CN110045300A - 基于磁感应蛋白探测磁场的传感器 - Google Patents

基于磁感应蛋白探测磁场的传感器 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备及应用方法,制备一个三电极体系的微流控芯片,将磁感应蛋白通过共价自组装的方式修饰在石墨烯工作电极上。当外加磁场时,磁感应蛋白产生响应,蛋白构象和介电性质发生变化,阻抗发生变化,将磁信号转化为电信号,通过电化学检测阻抗谱,实现对磁场的检测。本发明设计了新的磁场检测装置,通过仿生实现了对磁场的全新检测手段。

Description

基于磁感应蛋白探测磁场的传感器
技术领域
本发明涉及一种基于磁感应蛋白来检测磁场的器件及其制备方法和应用的技术,属于传感器制造的技术领域。
背景技术
近些年,检测磁场技术在航空航天、军事科技、生物医学等领域有着广泛的应用,目前较为成熟的测量磁场的方法有:磁力法、电磁感应法、电磁效应法、磁共振法、磁光效应法等等,利用不同的原理制备了不同的磁力仪,近些年来,磁力仪向着小型化、集成化、数字化的方向发展。但是磁力仪的使用受限较多,对开发新一代的磁力仪也有一定的需求。
磁感应蛋白MagR的发现是近年来生物领域的重大进展。MagR被认为是生物体内的磁感应受体,与隐花色素Cry形成复合物存在于生物的视网膜内,构成生物指南系统。磁感应蛋白MagR是一种具有磁性的蛋白,具有内禀磁性,参与生物体的电子传递,很可能就是鸽子等生物感知地球磁场的生物指南针。
在这里,我们设计了一种全新的磁场检测方法,将磁感应蛋白分子通过自组装的方式,组装到集合了三电极体系的微流控芯片上,蛋白对磁信号做出响应发生构象变化及电子传递,通过电化学工作站检测电化学学阻抗谱图和电子传递阻抗,从而实现对磁信号的探测。本方案中检测磁场的测量采用仿生,实现了数字化和小型化,且灵敏度高。但现有技术在组装和检测时,需要保持磁感应蛋白长久的活性,一定程度制约了材料的应用。
发明内容
技术问题:本发明的目的在于提出一种基于磁感应蛋白检测磁场的器件及其制备方法。使用共价自组装的方法将磁感应蛋白组装在微流控芯片的石墨烯工作电极上,磁感应蛋白将磁信号转化为电信号,通过电化学工作站检测电化学学阻抗谱图和电子传递阻抗,从而实现对磁信号的探测,最终实现对静磁场的检测。
技术方案:本发明的一种基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备方法技术方案如下:
该制备方法包括如下步骤:
步骤1,加工微流控芯片阻抗传感器:
1-1.以ITO玻璃为基底,利用激光刻蚀将ITO薄膜加工成对称的双L形图形,之后在丙酮、乙醇、纯水中超声清洗10-15min,氮气吹干,烘箱50℃干燥;
1-2.将50-100μm厚度的PI膜用双面胶平贴在圆玻璃表面上固定,在中心滴加PDMS预聚体混合液,使用旋涂机进行旋涂,形成厚度70-80μm的PDMS薄膜,随后放入烘箱70-80℃固化;
1-3.流道层为0.8-1mm宽,25-30mm长通道,一端拓宽为2-3mm圆形,另一侧流道宽度拓宽至1.5-2mm,拓宽范围1-1.2mm;按照下层PDMS流道设计制备刀模,对PDMS/PI膜进行切割加工;加工完成后乙醇超声清洗,并用纯水漂洗,放入烘箱干燥,保存在阴凉干燥处;
1-4.流道上层PDMS长度33-35mm,宽度0.8-1mm,厚度4-5mm,两端分别打有0.4-0.5mm和2-3mm圆形孔;将下层PDMS流道与ITO玻璃键合后,在流道内进行石墨烯修饰及蛋白组装后,将上层PDMS氧等离子体处理并与下层PDMS流道贴合,完成流道的封闭;
步骤2,磁感应蛋白的固定:
2-1.磁感应蛋白分子使用原核表达的方式在大肠杆菌中表达,并通过亲和层析纯化得到,基因序列来自鸽子;
2-2.在5-10mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入终浓度10-25mg/mL的抗坏血酸,超声10-15min混合;加入芘甲酸(PCA)的甲醇溶液混合,超声15-20min混合完全;
2-3.然后在流道中工作电极区域涂上一层5-10μm的导电银浆,50-60℃下烘干10-15min使其半干;然后将上述混合溶液均匀滴涂在银浆层上,40-45℃水浴保温15-16h;随后用纯水浸洗1-2h除去杂质,然后在冻干处理得到制备好的工作电极,冻干后的芯片在干燥处保存;
2-4.之后,配制60-80mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和40-60mMSulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的溶液,溶剂为0.05-0.1MMES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶液,滴加到电极表面室温静置15-20min后,吸去溶液并用纯水清洗三次,氮气吹干,随后滴加浓度为0.1mg/mL的磁感应蛋白溶液,0-4℃静置过夜,使磁感应蛋白与还原氧化石墨烯和PCA的羧基形成稳定的酰胺键,随后吸出溶液,并用PBS清洗电极三至五次,再用纯水冲洗后氮气吹干;在封闭上层PDMS后获得磁感应蛋白磁场传感器,保存在0-4℃备用。
其中:
所述ITO玻璃厚度1-1.2mm,长度33-35mm,宽度25-28mm,表面有180-190nm的ITO薄膜。
所述加入芘甲酸PCA的甲醇溶液混合,芘甲酸PCA与甲醇溶液体积比为1:4-1:3。
步骤2-4所述滴加浓度为0.1mg/mL的磁感应蛋白溶液,该溶液为0.01M PBS,pH7.2-7.4。
本发明的制备方法制备的基于磁感应蛋白磁场传感器用于传感器静磁场的检测,包括如下步骤:
(1)静磁场检测环境:使用钕铁硼磁铁形成静磁场,电极检测平面与磁感线方向平行,微流控芯片阻抗检测全部在坡莫合金封闭的磁屏蔽箱内检测;
(2)检测不同强度静磁场,建立静磁场强度-阻抗曲线:首先通过进样器向流道内加入氧化还原对检测溶液,氧化还原对检测溶液含有1-10mM铁氰化钾和1-10mM亚铁氰化钾,溶剂为0.01M PBS,pH7.2-7.4,将工作电极和对电极的ITO端分别通过导电铜箔连接到电化学工作站,在开孔处插入Ag/AgCl丝做参比电极并连接至电化学工作站;
在没有外加磁场的条件下,使用电化学工作站对修饰磁感应蛋白的微流控磁场传感器进行电化学阻抗谱的扫描,得到空白条件下电化学阻抗图谱和电子传递阻抗,测量结束后静置15min;
然后将芯片置于静磁场下,进行电化学阻抗谱的测量,得到该静磁场强度下对应的电化学阻抗谱和电子传递阻抗,测量结束后撤去静磁场,静置10-20min;
重复上述步骤对空白条件和不同静磁场强度下电化学阻抗的测量,得到不同磁场强度下的电化学阻抗谱图和电子传递电阻,计算对应强度静磁场作用下阻抗与空白条件下阻抗的差值,得到静磁场强度与阻抗的关系曲线y=ax+b,其中y为电子传递阻抗变化幅值,x为静磁场强度,a和b为常数,实现对静磁场的检测。
有益效果:本发明利用的生物体内的磁感应蛋白分子,MagR/Cry蛋白复合体,其是对磁场具有特征响应的分子,可以在磁场作用下产生构象变化、电子传递等,这为利用电化学表征提供了一种可能的途径,将磁感应蛋白分子自组装在微流控芯片的电极上,通过电化学阻抗检测器件对静磁场的响应,实现对磁场的检测。
附图说明
图1为本发明磁感应蛋白磁场传感器结构图;
图2为本发明磁感应蛋白磁场传感器电化学检测示意图;
图3为本发明磁感应蛋白磁场传感器工作电极制备示意图;
图4为本发明磁感应蛋白传感器不组装蛋白的电化学阻抗图谱;
图5为本发明磁感应蛋白传感器检测静磁场的电化学阻抗图谱;
图6为本发明磁感应蛋白传感器在不同静磁场作用下,电子传递阻抗变化与磁场强度之间的关系图;
图7为本发明磁感应蛋白传感器的等效电路模型。
具体实施方式
本发明基于电化学阻抗谱分析的磁感应蛋白传感器的制备包括如下步骤:
1.加工微流控芯片阻抗传感器:
以ITO玻璃为基底,ITO玻璃尺寸为34×26×1.1mm,ITO膜厚度185±2nm,利用激光刻蚀将ITO薄膜加工成图1中阴影图案,之后依次在丙酮、乙醇、纯水中超声清洗10min,氮气吹干,烘箱50℃干燥。将50μm厚度的PI膜用双面胶平贴在直径10cm的圆玻璃表面,在中心滴加适量PDMS预聚体混合液(PDMS预聚体和交联剂质量比10:1),使用LSM-250旋涂机进行旋涂,形成厚度约为80μm的PDMS薄膜,随后放入烘箱80℃固化。按照形状如图1中的下层PDMS流道图案制备刀模,对PDMS/PI膜进行切割加工。所述流道长度为28mm,宽度0.8mm,拓宽处为工作电极区域,长度10mm,宽度2.8mm,参比电极圆孔处直径3mm。加工完成后乙醇超声清洗2min并用纯水漂洗,放入烘箱60℃干燥,保存在阴凉干燥处。流道上层PDMS直接将固化后的PDMS进行切割打孔。将下层PDMS流道与ITO玻璃键合后,在流道内进行石墨烯修饰及蛋白组装后,将上层PDMS氧等离子体处理并与下层PDMS流道贴合,完成流道的封闭。
2.磁感应蛋白的固定:
磁感应蛋白分子使用原核表达的方式在大肠杆菌中表达,并通过亲和层析纯化得到MagR/Cry复合体,基因序列来自鸽子,表达和纯化MagR和Cry蛋白具有附录所示序列,N端分别带有Strep标签和10His标签。
首先在1mL的5mg/mL氧化石墨烯分散液中加入20mg的抗坏血酸,超声15min混合。加入250μL的3mg/mL芘甲酸(PCA)的甲醇溶液,超声20min混合。然后在流道中工作电极区域涂上一层较薄的导电银浆,50℃下烘干10min使其半干。然后将10μL的上述混合溶液均匀滴涂在银浆层上,40℃水浴保温16h。随后用纯水浸洗1h除去杂质,然后在-20℃预冻12h,最后冻干处理12h,冻干后的芯片在干燥处保存。上述银浆层和石墨烯层长度为8mm,宽度2.8mm,厚度分别约为5μm和10μm。之后,配制80mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和60mM Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的溶液,溶剂为0.1M MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶液,滴加到电极表面室温静置20min后,吸去溶液并用纯水清洗三次,氮气吹干,随后滴加50μL的浓度为0.1mg/mL的磁感应蛋白溶液(溶液为0.01M PBS,pH7.4),4℃静置过夜,使磁感应蛋白与还原氧化石墨烯和PCA的羧基形成稳定的酰胺键,随后吸出溶液,并用PBS清洗电极三次,再用纯水冲洗后氮气吹干。在封闭上层PDMS后获得磁感应蛋白磁场传感器,保存在4℃备用。
3.基于磁感应蛋白磁场传感器用于静磁场检测的方法步骤:
(1)静磁场检测环境:使用钕铁硼磁铁形成静磁场,电极检测平面与磁感线方向平行,微流控芯片阻抗检测全部在坡莫合金封闭的磁屏蔽箱内检测。
(2)检测不同强度静磁场,建立静磁场强度-阻抗曲线:首先通过进样器向流道内加入氧化还原对检测溶液,氧化还原对检测溶液含有5mM铁氰化钾和5mM亚铁氰化钾,溶剂为0.01M PBS,pH7.4将工作电极和对电极的ITO端分别通过导电铜箔连接到电化学工作站,在开孔处插入Ag/AgCl丝做参比电极并连接至电化学工作站,电化学工作站使用上海辰华仪器有限公司CHI660E型号产品。在没有外加磁场的条件下,使用电化学工作站对修饰磁感应蛋白的微流控磁场传感器进行电化学阻抗谱的扫描具体测试设置为初始电压设为开路电压,交流电压扰动幅值为5MV,扫描范围为1Hz-100kHz,得到电化学阻抗谱图,并通过阻抗等效电路拟合得到空白芯片的电子传递阻抗。测量结束后,静置15min,然后将芯片置于静磁场环境下,进行电化学阻抗谱的测量,得到该静磁场强度下对应的电化学阻抗谱和电子传递阻抗,测量结束后撤去静磁场,静置15min。然后重复上述步骤对空白条件和不同静磁场强度下电化学阻抗的测量,得到10mT、20mT、40mT、60mT磁场强度下的电化学阻抗谱图和电子传递电阻,如图5所示为记录的阻抗图谱,使用Zview软件进行拟合,计算对应强度静磁场作用下阻抗与空白条件下阻抗的差值,得到静磁场强度与阻抗的关系曲线做出线性相关曲线如图6所示,其中y为电子传递阻抗变化的幅值,x为静磁场强度。
根据传统的蛋白阻抗模型,基于传统的蛋白阻抗模型,任意相互作用的两个氨基酸可以等效为一个电阻和电容(RC)的并联电路,蛋白质由氨基酸形成的拓扑网络构成,具有一定的空间构像,因此蛋白本身也能等效成为一个RC电路。为了进一步研究磁感应蛋白与磁场的响应关系,依据磁感应蛋白所特有的铁硫中心和磁感应受体中心结构,可以构建一个具有磁感应结构的磁感应蛋白阻抗阻抗模型,如图7所示。MagR/Cry复合体蛋白的结构是以线性聚合的MagR蛋白为中心,Cry蛋白旋居在外侧。MagR蛋白的铁硫簇中心是其感磁结构,受磁场的影响发生可能的电子传递,外侧Cry蛋白作为光受体蛋白,两者间产生电子的传递,导致蛋白氨基酸结构的改变,从而引起蛋白总阻抗的变化。电极部分主要等效为一个电容(Ce)和一个阻抗(Ze)的影响。磁感应蛋白部分可分为氨基酸骨架和感磁铁硫中心结构两部分,Rp和Cp分别代表磁感应蛋白中氨基酸骨架之间的电阻和电容感磁的铁硫中心具有电阻和电容特性,也进行电路等效,Rc和Cc分别代表了感磁结构的电阻和电容特性。上述模型可以用于分析在磁场的作用下,磁感应蛋白传感器的电子转移电阻Rct变化的影响。磁场作用后,磁感应蛋白的蛋白骨架发生变化,引起氨基酸间的阻抗变化,导致蛋白阻抗变化。同时,铁硫中心感磁后发生电子传递现象,改变在MagR和Cry的介电性质递,影响了电子到达电极的途径。近些年,检测磁场技术在航空航天、军事科技、生物医学等领域得到广泛的应用。利用不同的原理制备了不同的磁力仪,磁力仪向着小型化、集成化、数字化的方向发展。但是目前磁力仪的使用受限较多,开发新一代的磁力仪成为研究热点。在这里,我们设计了一种全新的磁场检测方法,将磁感应蛋白通过组装的方式,结合微流控芯片构造一个能感知磁场的分子器件,通过蛋白将磁信号转化为电信号,从而实现对磁信号的检测。
蛋白氨基酸序列:
clMagR:
MNHKVWSHPQFEKGGSTSMASSASSVVRATVRAVSKRKIQATRAALTLTPSAVQKIKELLKDKPEHVGVKVGVRTRGCNGLSYTLEYTKSKGDSDEEVVQDGVRVFIEKKAQLTLLGTEMDYVEDKLSSEFVFNNPNIKGTCGCGESFNI
clCry4:
MNHKVHHHHHHHHHHMPHRTIHLFRKGLRLHDNPTLLAALESSETIYPVYVLDRRFLASAMHIGALRWHFLLQSLEDLHKNLSRLGARLLVIQGEYESVLRDHVQKWNITQVTLDAEMEPFYKEMEANIRRLGAELGFEVLSRVGHSLYDTKRILDLNGGSPPLTYKRFLHILSQLGDPEVPVRNLTAEDFQRCMSPEPGLAERYRVPVPADLEIPPQSLSPWTGGETEGLRRLEQHLTDQGWVANFTKPRTIPNSLLPSTTGLSPYFSMGCLSVRTFFQRLSNIYAQAKHHSLPPVSLQGQLLWREFFYTVASATQNFTQMAGNPICLQIHWYEDAERLHKWKTAQTGFPWIDAIMTQLRQEGWIHHLARHAVACFLTRGDLWISWEEGMKVFEELLLDADYSINAGNWMWLSASAFFHHYTRIFCPVRFGKRTDPEGQYIRKYLPVLKNFPTKYIYEPWTASEEEQRQAGCIIGRDYPFPMVNHKEASDRNLQLMRRVREEQRGTAQLTRDDADDPMEMKRDCSEENTARGKVARGRE。

Claims (5)

1.一种基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备方法,其特征在于该制备方法包括如下步骤:
步骤1,加工微流控芯片阻抗传感器:
1-1.以ITO玻璃为基底,利用激光刻蚀将ITO薄膜加工成对称的双L形图形,之后在丙酮、乙醇、纯水中超声清洗10-15min,氮气吹干,烘箱50℃干燥;
1-2.将50-100μm厚度的PI膜用双面胶平贴在圆玻璃表面上固定,在中心滴加PDMS预聚体混合液,使用旋涂机进行旋涂,形成厚度70-80μm的PDMS薄膜,随后放入烘箱70-80℃固化;
1-3.流道层为0.8-1mm宽,25-30mm长通道,一端拓宽为2-3mm圆形,另一侧流道宽度拓宽至1.5-2mm,拓宽范围1-1.2mm;按照下层PDMS流道设计制备刀模,对PDMS/PI膜进行切割加工;加工完成后乙醇超声清洗,并用纯水漂洗,放入烘箱干燥,保存在阴凉干燥处;
1-4.流道上层PDMS长度33-35mm,宽度0.8-1mm,厚度4-5mm,两端分别打有0.4-0.5mm和2-3mm圆形孔;将下层PDMS流道与ITO玻璃键合后,在流道内进行石墨烯修饰及蛋白组装后,将上层PDMS氧等离子体处理并与下层PDMS流道贴合,完成流道的封闭;
步骤2,磁感应蛋白的固定:
2-1.磁感应蛋白分子使用原核表达的方式在大肠杆菌中表达,并通过亲和层析纯化得到,基因序列来自鸽子;
2-2.在5-10mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入终浓度10-25mg/mL的抗坏血酸,超声10-15min混合;加入芘甲酸(PCA)的甲醇溶液混合,超声15-20min混合完全;
2-3.然后在流道中工作电极区域涂上一层5-10μm的导电银浆,50-60℃下烘干10-15min使其半干;然后将上述混合溶液均匀滴涂在银浆层上,40-45℃水浴保温15-16h;随后用纯水浸洗1-2h除去杂质,然后在冻干处理得到制备好的工作电极,冻干后的芯片在干燥处保存;
2-4.之后,配制60-80mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和40-60mMSulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的溶液,溶剂为0.05-0.1MMES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)溶液,滴加到电极表面室温静置15-20min后,吸去溶液并用纯水清洗三次,氮气吹干,随后滴加浓度为0.1mg/mL的磁感应蛋白溶液,0-4℃静置过夜,使磁感应蛋白与还原氧化石墨烯和PCA的羧基形成稳定的酰胺键,随后吸出溶液,并用PBS清洗电极三至五次,再用纯水冲洗后氮气吹干;在封闭上层PDMS后获得磁感应蛋白磁场传感器,保存在0-4℃备用。
2.如权利要求1所述的基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备方法,其特征在于所述ITO玻璃厚度1-1.2mm,长度33-35mm,宽度25-28mm,表面有180-190nm的ITO薄膜。
3.如权利要求1所述的基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备方法,其特征在于所述加入芘甲酸PCA的甲醇溶液混合,芘甲酸PCA与甲醇溶液体积比为1:4-1:3。
4.如权利要求1所述的基于磁感应蛋白检测磁场的传感器的制备方法,其特征在于步骤2-4所述滴加浓度为0.1mg/mL的磁感应蛋白溶液,该溶液为0.01M PBS,pH7.2-7.4。
5.一种如权利要求1所述的制备方法制备的基于磁感应蛋白磁场传感器的应用,其特征在于,该传感器用于传感器静磁场的检测,包括如下步骤:
(1)静磁场检测环境:使用钕铁硼磁铁形成静磁场,电极检测平面与磁感线方向平行,微流控芯片阻抗检测全部在坡莫合金封闭的磁屏蔽箱内检测;
(2)检测不同强度静磁场,建立静磁场强度-阻抗曲线:首先通过进样器向流道内加入氧化还原对检测溶液,氧化还原对检测溶液含有1-10mM铁氰化钾和1-10mM亚铁氰化钾,溶剂为0.01M PBS,pH7.2-7.4,将工作电极和对电极的ITO端分别通过导电铜箔连接到电化学工作站,在开孔处插入Ag/AgCl丝做参比电极并连接至电化学工作站;
在没有外加磁场的条件下,使用电化学工作站对修饰磁感应蛋白的微流控磁场传感器进行电化学阻抗谱的扫描,得到空白条件下电化学阻抗图谱和电子传递阻抗,测量结束后静置15min;
然后将芯片置于静磁场下,进行电化学阻抗谱的测量,得到该静磁场强度下对应的电化学阻抗谱和电子传递阻抗,测量结束后撤去静磁场,静置10-20min;
重复上述步骤对空白条件和不同静磁场强度下电化学阻抗的测量,得到不同磁场强度下的电化学阻抗谱图和电子传递电阻,计算对应强度静磁场作用下阻抗与空白条件下阻抗的差值,得到静磁场强度与阻抗的关系曲线y=ax+b,其中y为电子传递阻抗变化幅值,x为静磁场强度,a和b为常数,实现对静磁场的检测。
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