CN109971740A - 一种蛋白质烯烃化衍生物及其制备与应用 - Google Patents

一种蛋白质烯烃化衍生物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质烯烃化衍生物，制备方法及其用途。所述蛋白质烯烃化衍生物，是以蛋白质为原料，在氧化剂、钯催化剂、添加剂和配体存在下与烯烃化合物进行反应，经烯烃化修饰制得。本发明提供了一种蛋白质烯烃化衍生物，制备方法简单、高效、便捷，利用该方法可以有效的对蛋白进行荧光标记。

Description

一种蛋白质烯烃化衍生物及其制备与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种蛋白质烯烃化衍生物，及其制备方法与应用。
(二)背景技术
蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16％～20％，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6～12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
近些年来，随着化学蛋白质组会以及合成生物学的发展，对于蛋白的化学修饰已经成为了研究者研究的热门方向。特别是金属催化反应研究的深入，利用金属催化反应对蛋白进行后期修饰已经成为蛋白质修饰的有效方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种蛋白质烯烃化衍生物，及其制备方法与应用。
本发明采用的技术方案是：
一种蛋白质烯烃化衍生物，是以蛋白质为原料，在氧化剂、钯催化剂、添加剂和配体存在下与烯烃化合物进行反应，经烯烃化修饰获得所述蛋白质烯烃化衍生物；
所述蛋白质分子量为3kd～80kd，含有酪氨酸结构；
所述烯烃化合物为下列之一：丙烯酸乙酯，丙烯酸甲酯，取代芳基烯烃，丙烯腈；
所述氧化剂为下列之一：过硫酸钾，二氧化锰，二醋酸碘苯，苯醌；
所述钯催化剂为下列之一：醋酸钯，氯化钯，二乙酰丙酮钯；
所述添加剂为下列之一：碳酸银，醋酸银，三氟乙酸银，乙酸钾；
所述配体为下列之一：特戊醇，N-乙酰甘氨酸，1,10-菲罗啉，4,4'- 二甲基-2,2'-联吡啶。
所述蛋白质烯烃化衍生物是所述蛋白质中酪氨酸结构中苯基上羟基邻位C-H键被烯烃化所得，即所述蛋白质烯烃化衍生物均含有以下结构：
优选的，所述烯烃化合物为丙烯酸乙酯，所述蛋白质为下列之一：(1) 溶菌酶；(2)硫氧还蛋白；(3)泛素；(4)核糖核酸酶A；(5)梭菌蛋白 LC；(6)磷酸丙糖异构酶。
所述蛋白质烯烃化衍生物优选为如下之一：
所述蛋白质烯烃化衍生物是所述蛋白质中酪氨酸结构中苯基上羟基邻位C-H键被烯烃化所得，即所述蛋白质烯烃化衍生物均含有以下结构：
本发明还涉及制备所述蛋白质烯烃化衍生物的方法，所述方法包括：
(1)将蛋白质溶于税种，加入烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂和配体，于40～50℃下反应完全；所述蛋白质、烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂、配体的物质的量之比为1：1～5：0.1～0.5： 1～5：1～5：0.1～1；
(2)反应液加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，离心，得到粗产物，反复冻干两次，得到所述蛋白质烯烃化衍生物。
所述蛋白质、烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂、配体的物质的量之比优选为1：1.2：0.1：2.0：2.0：0.5。
优选的，所述烯烃化合物为丙烯酸乙酯，所述蛋白质为下列之一：(1) 溶菌酶；(2)硫氧还蛋白；(3)泛素；(4)核糖核酸酶A；(5)梭菌蛋白 LC；(6)磷酸丙糖异构酶。
优选的所述钯催化剂为二乙酰丙酮钯，所述氧化剂为过硫酸钾，所述添加剂为乙酸银，所述配体为N-乙酰甘氨酸。
本发明化合物由于含有烯烃化结构，有荧光的烯烃化合物(比如下式 A)可与之通过烯烃偶联反应，连接到蛋白上，构建得到另一种带有荧光的系统化蛋白。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种蛋白质烯烃化衍生物，制备方法简单、高效、便捷，可更加方便地进行蛋白的荧光标记。
(四)附图说明
图1为实施例1蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图2为实施例2蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图3为实施例3蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图4为实施例4蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图5为实施例5蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图6为实施例6蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图7为实施例7蛋白修饰后的Moditof质谱图；
图8为实施例7修饰后蛋白的SDS-page图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：制备烯烃化溶菌酶
将1mmol溶菌酶加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5 mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的溶菌酶(蛋白修饰后的Moditof质谱图见附图1)。
实施例2：制备烯烃化硫氧还蛋白
将1mmol硫氧还蛋白加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾， 0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的硫氧还蛋白(蛋白修饰后的Moditof质谱图见附图2)。
实施例3：制备烯烃化泛素
将1mmol泛素加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的泛素(蛋白修饰后的Moditof质谱图见附图3)。
实施例4：制备烯烃化核糖核酸酶A
将1mmol核糖核酸酶A加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的核糖核酸酶A(蛋白修饰后的Moditof质谱图见附图4)。
实施例5：制备烯烃化梭菌蛋白LC
将1mmol梭菌蛋白LC加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的梭菌蛋白LC(蛋白修饰后的Moditof质谱图见附图5)。
实施例6：制备烯烃化磷酸丙糖异构酶
将1mmol磷酸丙糖异构酶加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol 二乙酰丙酮钯，1.2mmol丙烯酸乙酯，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化的磷酸丙糖异构酶(蛋白修饰后的Moditof 质谱图见附图6)。
实施例7：溶菌酶的荧光标记
将1mmol烯烃化溶菌酶加入2ml的水中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol烯烃化化合物A，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，0.5mmol N-乙酰甘氨酸，40℃下反应12小时，反应结束后，加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，13000转/分，-5℃，离心10分钟得到粗产物，反复冻干两次，得到烯烃化罗丹明B修饰的溶菌酶(见附图7，为蛋白修饰后的Moditof质谱图)。将该蛋白溶解到PBS(磷酸缓冲液)中，震荡溶解，取该样品10ul的样品，加入到蛋白胶中进行蛋白质分离，待蛋白分离结束后，在蛋白质荧光扫描仪下进行荧光扫描(修饰后蛋白的 SDS-page图见附图8，由图可知烯烃化溶菌酶蛋白可以被很好的荧光标记)。

Claims (6)

1.一种蛋白质烯烃化衍生物，其特征在于：以蛋白质为原料，在氧化剂、钯催化剂、添加剂和配体存在下与烯烃化合物进行反应，经烯烃化修饰获得所述蛋白质烯烃化衍生物；
所述蛋白质分子量为3kd～80kd，含有酪氨酸结构；
所述烯烃化合物为下列之一：丙烯酸乙酯，丙烯酸甲酯，取代芳基烯烃，丙烯腈；
所述氧化剂为下列之一：过硫酸钾，二氧化锰，二醋酸碘苯，苯醌；
所述钯催化剂为下列之一：醋酸钯，氯化钯，二乙酰丙酮钯；
所述添加剂为下列之一：碳酸银，醋酸银，三氟乙酸银，乙酸钾；
所述配体为下列之一：特戊醇，N-乙酰甘氨酸，1,10-菲罗啉，4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶。
2.如权利要求1所述的蛋白质烯烃化衍生物，其特征在于所述烯烃化合物为丙烯酸乙酯，所述蛋白质为下列之一：(1)溶菌酶；(2)硫氧还蛋白；(3)泛素；(4)核糖核酸酶A；(5)梭菌蛋白LC；(6)磷酸丙糖异构酶。
3.制备权利要求1所述蛋白质烯烃化衍生物的方法，所述方法包括：
(1)将蛋白质溶于税种，加入烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂和配体，于40～50℃下反应完全；所述蛋白质、烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂、配体的物质的量之比为1：1～5：0.1～0.5：1～5：1～5：0.1～1；
(2)反应液加入冰丙酮，在丙酮中析出固体，离心，得到粗产物，反复冻干两次，得到所述蛋白质烯烃化衍生物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述蛋白质、烯烃化合物、钯催化剂、氧化剂、添加剂、配体的物质的量之比为1：1.2：0.1：2.0：2.0：0.5。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述烯烃化合物为丙烯酸乙酯，所述蛋白质为下列之一：(1)溶菌酶；(2)硫氧还蛋白；(3)泛素；(4)核糖核酸酶A；(5)梭菌蛋白LC；(6)磷酸丙糖异构酶。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述钯催化剂为二乙酰丙酮钯，所述氧化剂为过硫酸钾，所述添加剂为乙酸银，所述配体为N-乙酰甘氨酸。
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