CN103396554A

CN103396554A - 一种水凝胶、其制备方法及应用

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Publication number: CN103396554A
Application number: CN2013102740190A
Authority: CN
Inventors: 邓超; 范亚萍; 孟凤华; 程茹; 钟志远
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103396554B

Abstract

本发明公开了一种水凝胶、其制备方法及应用。本发明通过简单的光控“四唑-烯”点击化学方法制备水凝胶，该方法具有高效快速、专一性强、无需催化剂、时空可控等优点；用该法制备的水凝胶不仅具有较好的力学性能、可控的凝胶时间和优异的细胞相容性，而且能实现药物和细胞的无损伤包裹和完全可控的释放；因此该光控“四唑-烯”点击化学水凝胶在药物控制释放载体和组织工程支架材料等领域中具有很好的应用前景。

Description

一种水凝胶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种水凝胶、其制备方法及应用，具体涉及一种基于聚合物四唑衍生物与聚合物甲基丙烯酸酯衍生物的水凝胶、其制备方法，以及该水凝胶在医药领域的应用。

背景技术

水凝胶由于具有高含水量、尺寸可调节的多孔结构和良好的生物相容性等优点，已经在组织工程和药物缓释领域得到了广泛的应用。水凝胶可以通过物理交联和化学交联制备：物理交联包括憎水作用、聚乳酸的立体复合作用、静电作用等，物理凝胶制备通常无需毒性试剂，能实现蛋白质药物的无损伤包裹，但通常稳定性较差，所包裹的蛋白质药物释放较快；化学交联包括自由基聚合，希夫碱反应，迈克尔加成反应，酶催化反应等，化学交联也存在很多弊端，如用光交联形成水凝胶需要光引发剂，会影响其生物相容性；酶交联可能引发毒性和免疫反应，或者导致与蛋白、药物间的反应。

基于“叠氮-炔”的点击化学由于其快速、高效的反应特点已被广泛应用于制备水凝胶，但该点击化学形成凝胶时需要加入有毒的铜催化剂。Anseth和Becker等报道不用催化剂的炔基与叠氮的点击化学反应用于聚乙二醇水凝胶的制备，制备的水凝胶展现出很好的细胞相容性，但环张力炔基的合成步骤多且产率低（参见：Deforest CA, Polizzotti BD, Anseth KS. Nat. Mater. 2009, 8, 659-664;Zheng J, Callahan LAS, Hao J, et al. ACS Macro Lett. 2012, 1, 1071-1073）；Shoichet和Marra等通过Diels-Alder点击化学反应在不用催化剂的条件下制备了透明质酸水凝胶，该水凝胶细胞相容性好，可对胰岛素和溶菌酶等蛋白质实现长达21天的可控释放，但Diels-Alder点击化学制备的水凝胶的凝胶时间长，制得水凝胶的储存模量低（参见：Nimmo CM, Owen SC, Shoichet MS. Biomacromolecules 2011, 12, 824-830; Tan H, Rubin JP, Marra KG. Macromol. Rapid Commun. 2011, 32, 905-911）。

所以需要开发高效快速、专一性强、无催化剂的通用化学反应方法，用于制备力学性能较好和凝胶时间较短的水凝胶，使其更好地应用于药物控制释放载体和组织工程支架材料等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种无催化剂的光控“四唑-烯”点击化学方法制备水凝胶的方法，用该方法制备的水凝胶在药物控制释放载体和组织工程支架材料等领域中具有很好的应用前景。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种制备水凝胶的方法，包括以下步骤：将聚合物四唑衍生物溶于水或缓冲液中得到浓度为1～60 wt%的溶液A，将聚合物甲基丙烯酸酯衍生物溶于水或缓冲液中得到浓度为1～60 wt%的溶液B；然后将溶液A与溶液B在20～37℃下混合得到水凝胶前驱体溶液，前驱体溶液经过紫外光照50s～30 min后制备得到所述的水凝胶；

所述的聚合物四唑衍生物具有式I结构：

Figure DEST_PATH_528663DEST_PATH_IMAGE001

式Ⅰ；

其中X为O或者NH；n ≥ 2；

R为H、Cl、Br、Me、NH₂、NMe₂、NO₂或者OMe；

P为聚乙二醇、聚乙二醇-聚酯、壳聚糖、透明质酸、葡聚糖或者胶原蛋白；所述聚乙二醇为线性或者多臂聚乙二醇，表示为PEG-x-OH，x=2，4，6或8；所述聚乙二醇的分子量为2～100 kg/mol；所述聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯或者聚碳酸酯；所述聚酯的聚合度为1～20；

所述的聚合物甲基丙烯酸酯衍生物具有式II结构：

Figure DEST_PATH_85546DEST_PATH_IMAGE002

式II；

其中Y为O或者NH；m ≥ 2；

P′为聚乙二醇、聚乙二醇-聚酯、壳聚糖、葡聚糖、透明质酸或者胶原蛋白；所述聚乙二醇为线性或者多臂聚乙二醇，表示为PEG-y-OH，y=2，4，6或8；所述聚乙二醇的分子量为2～100 kg/mol；所述聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯或者聚碳酸酯；所述聚酯的聚合度为1～20；

所述水凝胶前驱体溶液中，甲基丙烯酸酯基团与四唑基团的摩尔比为1∶0.3～3，聚合物总浓度为1～60 wt%。

上述技术方案中，紫外光的波长为302 nm或者365 nm；强度为1～60 mW/cm²；利用紫外光聚合具有时空可控的特点。

上述技术方案中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐（HEPES）缓冲液，三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液或者2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液；优选为磷酸盐（PB）缓冲液；进一步优选为pH 为7.4的PB缓冲液。

上水凝胶的制备方法可表示如下：

Figure DEST_PATH_526148DEST_PATH_IMAGE003

。

本发明公开了根据上述方法制备得到的水凝胶；可以称为光控“四唑-烯”点击化学水凝胶。

本发明中，聚合物四唑衍生物的制备方法为：将四唑小分子（TET）与含有氨基或羟基的水溶性聚合物溶于溶剂中后，加入缩合剂二环己基碳二亚胺（DCC）和催化剂4-二甲氨基吡啶，然后在室温下搅拌反应18～28小时，得到所述的聚合物四唑衍生物（P-TET_n）；具体反应过程示意如下：

Figure DEST_PATH_459469DEST_PATH_IMAGE004

（X=O或者N；R=H、Cl、Br、Me、NH₂、NMe₂、NO₂或者OMe）。

上述溶剂优选为为二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜或二甲基亚砜与水的混合溶液；上述含有氨基或羟基的水溶性聚合物优选为聚乙二醇、聚乙二醇-寡聚酯、壳聚糖、透明质酸或者葡聚糖、胶原蛋白；其中所述聚乙二醇为线性或者多臂聚乙二醇；所述聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯或者聚碳酸酯；

上述反应中，水溶性聚合物中的羟基或者胺基与四唑的摩尔比优选为1∶0.1～2；四唑与二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）的摩尔比优选为1∶2∶0.1。

本发明进一步公开了上述水凝胶作为药物缓释载体的应用。

本发明还公开了上述水凝胶作为组织工程支架的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1）本发明公开的水凝胶的制备方法具有“点击化学”的快速高效、专一性和反应条件温和的特点，同时无需铜盐等毒性催化剂；

2）本发明公开的水凝胶的制备方法具有光聚合的时空可控性的特点，无须光引发剂并避免了反应不完全的缺点；

3）本发明公开的水凝胶前驱体材料制备简单、成本低，由此制备的水凝胶具有优异的生物活性、良好的力学性能，可用作组织工程支架材料；

4）本发明公开的水凝胶的制备方法具有很强的选择性，与包载的药物，尤其是蛋白质药物和细胞不反应，从而能很好的保持药物和细胞的功效，实现完全、可控的释放，可以作为药物缓释载体；

5）本发明制备的水凝胶荧光性能优异，可用于观察凝胶载体在体内的变化。

附图说明

图1是实施例一中四臂聚乙二醇四唑衍生物的氢核磁谱图；

图2是实施例三中四臂聚乙二醇甲基丙烯酸酯衍生物的氢核磁谱图;

图3是实施例四中水凝胶的凝胶含量图；

图4是实施例四中水凝胶的溶胀率随时间变化图；

图5是实施例五中水凝胶的储存模量图；

图6是实施例五中水凝胶的凝胶时间图；

图7是实施例六中水凝胶的细胞存活率图；

图8是实施例七中水凝胶用于模型蛋白质的控制释放图；

图9是实施例七中释放出的蛋白活性检测图；

图10是实施例八中水凝胶用于药物蛋白质IL-2的控制释放图；

图11是实施例八中释放出的IL-2抗肿瘤活性检测图。

具体实施方式

下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：四臂聚乙二醇四唑衍生物（PEG-TET₄）的合成

(1) 在100mL 两颈瓶中，在氮气保护下取0.75 g （5 mmol）对甲酰基苯甲酸溶于50 mL乙醇中，充分溶解，加入0.86 g （5 mmol）苯磺酰肼，溶解后，搅拌半小时，用二次水沉淀，干燥，得淡黄色固体苯腙1.2975 g，产率85.4 % 。苯胺0.23 mL（0.23 g）溶于混合溶液（2 mL水、2 mL乙醇、0.65 mL浓HCl），在冰水条件下，将NaNO₂固体（0.175 g）溶于1 ml二次水中，溶解后逐滴加入上述混合溶液，搅拌15 min，呈淡黄色重氮苯溶液。取苯腙（0.6 g）溶于15 ml吡啶中，充分溶解，逐滴滴加到上述中的重氮苯溶液中，用冰浴控制反应温度在0℃。反应6 h后得红棕色溶液，用乙酸乙酯分4次萃取，每次10 ml，分出有机相，加入120 ml， 3M HCl萃取分层，取上层有机层，过滤、真空干燥得到粉红色四唑固体TET（0.206 g，产率25.9 %）；

(2) 在氮气保护条件下，50 mL两颈瓶中加入四唑（0.216 g），二氯甲烷15ml搅拌溶解24小时，加入DCC （120 mg）搅拌15 min，PEG（M _n=10 K, 0.5 g）溶于2 mL 二氯甲烷中，溶解后加入四唑溶液中，搅拌10 min，加入DMAP （10 mg，），反应24小时，过滤，滤液用冰乙醚沉淀，干燥后得产品PEG-TET₄（0.421g，产率90.4 %）；PEG-TET₄核磁表征见附图1，¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.20-8.25 (m, 4H, C₆H₄ of TET); 7.53, 7.60 and 8.35 (m, 5H, C₆H₅ of TET); 4.53 (t, 2H, -COOCH ₂-); 3.64 (m, PEG中亚甲基质子)。

实施例二：壳聚糖四唑衍生物（Chit-TET_n）的合成

在氮气保护条件下，将四唑（0.216 g）溶于DMSO（15mL）中，然后加入DCC （120 mg）反应30 min，再将其加入壳聚糖的水溶液中（80K, 0.5g），并同时加入DMAP （10 mg），在搅拌条件下室温反应24小时。聚合物溶液用超滤纯化，冷冻干燥后得到产物Chit-TET_n（0.39 g，78.0%）。Chit-TET_n核磁表征，¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.15-8.21 (m, 4H, C₆H₄ of TET); 7.47, 7.55 and 8.28 (m, 5H, C₆H₅ of TET); 4.46 (s, 1H, 壳聚糖上α位上的次甲基上的质子); 3.27-4.10 (m, 9H, 壳聚糖中与醚键和羟基相连的亚甲基和次甲基上的质子)；2.97-3.16 (m, 1H, 壳聚糖上与氨基相连的次甲基质子)。

实施例三：四臂聚乙二醇甲基丙烯酸酯衍生物（PEG-MA₄）的合成

在氮气保护条件下，25mL密封反应器中加入八臂聚乙二醇PEG（M _n=10 K, 0.25g），三乙胺（Et₃N，120 μL），甲基丙烯酸酐（240 μL），DMAP（4.9 mg），甲苯10 mL，密封好反应器，置于70℃油浴中反应24小时，然后用冰乙醚沉淀，过滤，常温真空干燥得到产物0.45 g，产率60.5 %；PEG-4-MA核磁表征见附图2，¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.54 and 6.10 (s, 2H, -COC(CH₃)CH₂), 4.28 (t, 2H, -COOCH₂-), 3.61 (m, PEG 主链上的亚甲基质子), 1.91 (s, 3H, -COC(CH₃)CH₂)。

实施例四：光控“四唑-烯”点击化学法制备水凝胶

水凝胶的制备如下：将实施例一制备的PEG-TET₄和实施例三制备的PEG-MA₄分别溶于的PB（pH 7.4，10 mM）中，制备得到浓度为20-60 wt%的聚合物溶液，然后把两种溶液在室温下等体积混合均匀后得到不同浓度的水凝胶前驱体溶液，用紫外光（波长365 nm，光强60 mW/cm²）辐射10 min，制备得到厚2 mm，直径10 mm的柱形荧光水凝胶。

凝胶含量（gel content）是指形成凝胶的聚合物占加入聚合物总量的比例。附图3为上述凝胶含量与聚合物含量关系图，可以看出，通过这种光控“四唑-烯”点击化学制备的水凝胶具有较高的凝胶含量，在10 wt%的聚合物浓度下，形成的凝胶具有85.3%的凝胶含量；随着聚合物浓度的增加，凝胶含量相应增加。水凝胶的凝胶含量控制在80%到95%之间，这表明光控“四唑-烯”点击化学反应具有高效快速的特点。

附图4是上述水凝胶的溶胀平衡比随时间的变化。从图中可以以看出，在低浓度条件下形成的水凝胶具有较高的溶胀比，而在高浓度下形成的水凝胶具有较低的溶胀比；主要是因为凝胶的交联密度增加，导致其吸水能力下降；凝胶在PBS中浸泡20天后，他们的凝胶比例分别为230 %和280 %左右。

实施例五：光控“四唑-烯”点击化学水凝胶的流变分析

流变分析是采用RS 6000流变仪（Thermo-Fisher，Germany），在37℃的测试平台（Φ 20 mm）上进行流变测试。本实施例研究了聚合物浓度和紫外光照强度变化对水凝胶的储存模量和凝胶时间的影响。附图5为用实施例一制备的PEG-TET₄和实施例三制备的PEG-MA₄形成的水凝胶的储存模量与聚合物浓度和紫外光照强度变化的关系图，发现随着聚合物的浓度增加和紫外光照强度增强水凝胶的储存模量也同时增大；水凝胶模量可方便地控制在0.65 kPa到25.2 kPa之间。附图6为水凝胶的凝胶时间与聚合物浓度和紫外光照强度变化的关系图，发现随着聚合物的浓度增加及紫外光照强度增强水凝胶的凝胶时间也同时缩短；水凝胶凝胶时间可方便地控制在50 s到30 min之间。

实施例六：光控“四唑-烯”点击化学水凝胶的细胞相容性

以实施例四中的制备的水凝胶为例，测试水凝胶的细胞相容性。将成纤维细胞（L929）铺在96孔细胞培养板上，每个孔大约5000个细胞。使用的介质是使用的介质是DMEM培养基。介质使用前，要补加10 %的小牛血清、1%的谷氨酸盐、抗生素青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 μg/mL）。24小时后细胞长到70-80 %的覆盖率，将按实施例四方法制备的厚1mm，直径3mm的小块凝胶分别加入相应的孔中，然后在37℃、含有5% 的CO₂的条件下分别培育24小时、48小时和72小时。最后加入10 μL 的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的PBS 溶液（5 mg/mL），放置4小时后把培养液吸出，活细胞产生的紫色结晶子（MTT-formazan）溶解在100 μL的十二烷基磺酸钠（10 %）和0.1 M 盐酸的混合液里，放置过夜。使用酶标仪（Bio-rad, ELX808IU）测量形成的紫色结晶子在570 nm处的吸收。用仅含有培养基的空白细胞作对照，每孔重复4次。附图7为细胞存活率图，可以看出，24小时后在凝胶中细胞的存活率均达到100 %左右，随着培养时间的延长细胞也能够正常的增殖，说明由四臂聚乙二醇衍生物形成的水凝胶没有毒性。

实施例七：光控“四唑-烯”点击化学水凝胶用于细胞色素C和免疫球蛋白的包载和体外控制释放，以及释放出来的蛋白质的活性检测

蛋白质药物的包载是先将细胞色素C（CC，1 mg/mL）和免疫球蛋白（Ig，1 mg/mL）分别与PEG-MA₄和PEG-TET₄聚合物溶液（聚合物含量：20 wt%）混合溶解，然后用紫外光（波长365 nm，光强60 mW/cm²）辐射10 min，制备得到水凝胶（约0.2 mL）。蛋白质药物的体外释放是先将2 ml PBS缓冲溶液加入到包载蛋白质药物凝胶样品的小瓶中，然后每隔一段时间从瓶中取出所有的缓冲溶液样品，之后再加入2 ml新的缓冲溶液。释放出的蛋白冷冻干燥浓缩后，采用PIERCE公司的Micro BCATM Protein Assay Kit试剂盒进行测定其蛋白含量。附图8为上述水凝胶用于模型蛋白质的控制释放图，结果显示，由PEG-MA₄/PEG-TET₄形成的水凝胶在释放初期48小时内，对于CC和Ig都有突释，达到包载蛋白总量的50 %左右。主要可能由于，蛋白质部分聚集在一起，而靠近凝胶表面的这些蛋白质就可以通过扩散快速地释放出来。随着时间的延长，可以明显的看出凝胶对于CC的释放要比Ig快得多。这是因为，蛋白质CC的尺寸比Ig要小得多，在同样大小的三维网格中小尺寸的蛋白质更易于从中扩散出来。

蛋白质CC的活性是通过检测其对ABTS转变为ABTS+的催化效率得到。首先释放出的CC用PBS缓冲液稀释至浓度为0.004 mg/ mL，然后放入石英样品池内，向该溶液中加入含有10 μL的0.045 M的过氧化氢溶液和100 μL 的1 mg/mL的ABTS的PBS 溶液，并倒置使之混合均匀。然后用UV分光光度计读在410 nm处的吸收值，以此为时间零点，每隔15秒测一次。每一个时间点对应的紫外吸收值减去第一点的吸收值从而得到吸收值的变化（△A），以△A对时间做图表示其活性变化随时间的变化。同时配置相同浓度的、未经处理的CC作为对照组。附图9为上述释放出的蛋白活性检测图，附图9A的结果显示，从凝胶里释放出来的CC仍然能较快地催化ABTS的氧化，催化速率和未经任何处理的CC的接近；图9（B）是CC在远紫外区（190-250 nm）的圆二色谱吸收，从图中可以看出释放出来的CC与天然CC的的吸收峰几乎相同。这些数据表明从光控“四唑-烯”点击化学水凝胶中释放出来的蛋白质能保持原有的二级结构和生物活性。

实施例八：光控“四唑-烯”点击化学水凝胶用于抗癌蛋白质白细胞介素-2（IL-2）的包裹和体外控制释放，以及释放出来的蛋白质的活性检测

IL-2的包载采用与实施例七类似的方法，先将IL-2（0.1 mg/mL）与PEG-MA₄和PEG-TET₄聚合物溶液（聚合物含量：20 wt%）混合溶解，再用紫外光（波长365 nm，光强60 mW/cm²）辐射10 min，制备得到水凝胶（约0.2 mL）。然后再向凝胶样品的小瓶中加入2 mLPBS缓冲溶液，每隔一段时间从瓶中取出所有的缓冲溶液样品，之后再加入2 mL新的缓冲溶液。释放出来的IL-2浓度采用PEPROTECH公司定做的试剂盒检测。附图10为上述水凝胶用于药物蛋白质IL-2的控制释放图，由图可观察到该水凝胶对IL-2同样能达到很好的控制释放的作用。

释放出的IL-2的抗肿瘤活性通过MTT法检测。黑色素瘤细胞（B16）铺在96孔细胞培养板上，每个孔大约5000个细胞。使用的介质是1640培养基。介质使用前，要补加10 %的小牛血清、1 %的谷氨酸盐、抗生素青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 μg/mL）。24小时后细胞长到70-80 %的覆盖率，将浓度为1 μg/mL IL-2分别加入相应的孔中，每孔10 μL,然后在37℃、含有5 % 的CO₂的条件下培育24小时。最后加入10 μL 的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的PBS 溶液（5 mg/mL），放置4小时后把培养液吸出，活细胞产生的紫色结晶子（MTT-formazan）溶解在100 μL的十二烷基磺酸钠（10 %）和0.1 M 盐酸的混合液里，放置过夜。使用酶标仪（Bio-rad, ELX808IU）测量形成的紫色结晶子在570 nm处的吸收。用仅含有培养基的空白细胞作对照，每孔重复4次。附图11为上述细胞存活率图，由图可见，从水凝胶中释放出的IL-2在与B16细胞培养24小时后，其存活率下降到约70.6 %；而用相同浓度的天然IL-2与B16细胞培养24小时后，细胞的存活率下降到约 63.5 %左右。这说明从光控“四唑-烯”点击化学水凝胶中释放出来的抗肿瘤蛋白质能很好的保持其生物活性。

Claims

1.一种制备水凝胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚合物四唑衍生物溶于水或缓冲液中得到浓度为1～60 wt%的溶液A；将聚合物甲基丙烯酸酯衍生物溶于水或缓冲液中得到浓度为1～60 wt%的溶液B；然后将溶液A与溶液B在20～37℃下混合得到水凝胶前驱体溶液，前驱体溶液经过紫外光照50s～30 min后制备得到所述的水凝胶；

所述的聚合物四唑衍生物具有式I结构：

式Ⅰ；

其中X为O或者NH；n ≥ 2；

R为H、Cl、Br、Me、NH₂、NMe₂、NO₂或者OMe；

所述的聚合物甲基丙烯酸酯衍生物具有式II结构：

式II；

其中Y为O或者NH；m ≥ 2；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：紫外光的波长为302 nm或者365 nm；强度为1～60 mW/cm²。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或者2-吗啉乙磺酸缓冲液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1～4中任意一种方法制备得到的水凝胶。

6.权利要求5所述的水凝胶作为药物缓释载体的应用。

7.权利要求5所述的水凝胶作为组织工程支架的应用。