CN109970831B - 吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体及其制备方法 - Google Patents

吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体及其制备方法，将PEI先与还原性响应的前药链段反应，得到表面带有正电荷的，部分氨基被反应的PEI，然后将其再与带有醛基的磷酰胆碱链段反应，结束后装入MW=3500的透析袋中，透析2天，透析去除有机溶剂以及未反应的小分子，最后得到pH/GSH多层级响应的仿生纳米药物载体。本发明中的纳米微载体制备方法简单新颖，以及多层级的响应与之前报道过的药物载体比较，该载体键合的磷酰胆碱亲水链在肿瘤微酸环境下断裂，裸露出带正电荷的PEI，促进了细胞对于前药分子的内吞，前药分子进入癌细胞后，癌细胞中大量的GSH又进一步将前药中的二硫键分解，精准地控制药物的释放，实现药物的有效释放及肿瘤细胞的治疗。

Description

吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及高分子领域，具体涉及吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体及其制备方法。
背景技术
近年来，纳米药物载体共价负载化疗药物并对肿瘤组织的生物信号(如低pH值、高谷胱甘肽浓度)敏感，成为开发新型智能纳米微载体的重要思路。尽管如此，申请人在胰腺癌化疗的研究中发现，现有的载药胶束并非完全理想，仍未有效实现药物从组织层次到细胞层次的有效传递和智能控释，所以这种方并未极大提高胰腺癌的化疗效果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，探索构建一种基于肿瘤组织生物信号敏感且可脱落的仿生纳米药物载体，实现肿瘤组织处靶向富集的同时，提高肿瘤细胞对药物载体的摄取，将为纳米药物载体的高效靶向药物传递提供新途径而研发出吉西他滨前药化合物、仿生纳米药物载体。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：吉西他滨前药化合物，其具有(Ⅲ)的结构：
Figure RE-GDA0002061909850000011
吉西他滨前药化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1.将2-巯基乙醇和碘化钾放入有机溶剂a中搅拌溶解，在搅拌中缓慢加入双氧水；搅拌结束后，加入饱和食盐水溶液，再用乙酸乙酯萃取水相，最后旋蒸除去有机溶剂a得到具有结构(Ⅰ)的2,2'-二硫二乙醇，
Figure RE-GDA0002061909850000012
S2.将S1中制得的2,2'-二硫二乙醇(Ⅰ)和三乙胺溶解于有机溶剂b中，并进行冰水浴、搅拌，而后在搅拌时缓慢滴加丙烯酰氯，滴加完毕后，继续搅拌；反应结束后，加入饱和食盐水溶液，用二氯甲烷在其中萃取，最后旋蒸除去溶剂得到具有结构(Ⅱ)的黄色液体丙烯酸酯二硫化合物，
Figure RE-GDA0002061909850000021
S3.将S2中制得的黄色液体丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)与药物吉西他滨溶解在有机溶剂c 中，在催化剂条件下反应，旋蒸除去溶剂，然后使用硅胶柱提纯该产物，最后得到具有结构 (Ⅲ)的吉西他滨前药化合物，
Figure RE-GDA0002061909850000022
优选的，在所述S1中，搅拌在在室温下进行且搅拌2小时；其中，2-巯基乙醇和碘化钾的质量份数比为20:1，有机溶剂a选用乙酸乙酯，过氧化氢与乙酸乙酯的体积份数比为30:1，饱和食盐水和乙酸乙酯均将反应物萃取多次。
优选的，在所述S2中，所述2,2'-二硫二乙醇(Ⅰ)与丙烯酰氯的质量份数比为1：1.2，且所述反应时间24小时；其中丙烯酰氯与三乙胺的摩尔份数比为1：1；其中有机溶剂b选用二氯甲烷，并用二氯甲烷和饱和食盐水将反应物萃取多次。
优选的，在所述S3中，所述丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)与药物吉西他滨的摩尔份数比为 1：1；其中，催化剂选用对硝基苯氯甲酸，且丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)与对硝基苯氯甲酸的质量份数比为20：1，所述反应温度优为60℃，且反应时间为12小时；所述硅胶柱中的洗脱剂选用石油醚和乙醇，且石油醚与乙醇的体积份数比为1:2。
仿生纳米药物载体，其具有(Ⅵ)的结构：
Figure RE-GDA0002061909850000031
中，n为聚合度，值为10-100。
仿生纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：
S4.将磷酸胆碱与4-(11-羟基十一烷氧基)苯甲醛溶解在有机溶剂d中，加入催化剂，回流后将其旋蒸干燥，然后使用去离子水和乙酸乙酯萃取提纯该产物，再将溶解在水中的产物冷冻后使用冷冻干燥机干燥，最后得到具有结构(Ⅳ)的端醛基的磷酰胆碱化合物，
Figure RE-GDA0002061909850000032
S5.将上述吉西他滨前药化合物制备方法中的S3中得到的吉西他滨前药化合物(Ⅲ)与 PEI溶解在有机溶剂e中，搅拌反应得到具有结构(Ⅴ)的聚合物前药，
Figure RE-GDA0002061909850000041
式中， n为聚合度，值为10-100；
S6.将S5中得到的聚合物前药(Ⅴ)与S4中制得的具有端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ) 溶解在有机溶剂f中，搅拌得到具有结构(Ⅵ)的仿生纳米药物载体，
Figure RE-GDA0002061909850000051
式中， n为聚合度，值为10-100。
优选的，在所述S4中，所述磷酸胆碱与4-(11-羟基十一烷氧基)苯甲醛的摩尔份数比为1：1；有机溶剂d选用氯仿；其中催化剂为路易斯酸或对甲基苯磺酸，用去离子水和乙酸乙酯将反应物萃取多次。
优选的，在所述S5中，所述吉的西他滨前药化合物(Ⅲ)与PEI的摩尔份数比为20：1；其中，所述的PEI分子量为4000；所述有机溶剂e选用乙醇，反应时间为24小时。
优选的，在所述S6中，所述的具有端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)与聚合物前药(Ⅴ) 的摩尔份数比为30:1；其中，所述有机溶剂f选用乙醇，反应时间为24小时。
本发明的有益效果是：
1.本发明从仿生纳米药物载体出发，设计了一种肿瘤组织微环境敏感的智能纳米药物载体：合成具有谷胱甘肽(GSH)响应性活性基团的吉西他滨前体药物，然后将其键合至前期开发的pH敏感的PC-PEI共聚物上，共同构建一种内核为吉西他滨药物、外表面为PC-PEI 的纳米载药胶束，实现对化疗药物的共价负载，克服化疗药物在传输过程中的提前泄露问题；
2.本发明依据磷酸胆碱仿生纳米界面非特异性阻抗作用的特点，探索药物微载体磷酸胆碱界面结构影响微载体长效循环能力的基本规律；利用席夫碱在微酸环境下不稳定的特点，探索制备pH响应纳米药物载体，提高肿瘤细胞对药物载体的摄取；利用肿瘤细胞内较强的还原环境，实现吉西他滨的智能释放。
附图说明
图1为前药化合物的核磁谱图；
图2为端醛基的磷酰胆碱的核磁谱图；
图3为本发明中纳米药物载体的红外光谱图；
图4为实施例1中纳米药物载体的zeta电位图；
图5为实施例1中纳米药物载体经外界pH刺激前后的粒径曲线图；
图6为实施例1中纳米药物载体经外界GSH刺激前后的粒径曲线图；
图7为实施例1中纳米药物经外界刺激前后的释药率随时间的变化曲线图；
图8为实施例1中纳米药物载体在刺激释药前后对胰腺癌细胞的细胞毒性；
图9为实施例2中纳米药物载体的zeta电位图；
图10为实施例2中纳米药物载体经外界pH刺激前后的粒径曲线图；
图11为实施例2中纳米药物载体经外界GSH刺激前后的粒径曲线图；
图12为实施例2中纳米药物经外界刺激前后的释药率随时间的变化曲线图；
图13为实施例2中纳米药物载体在刺激释药前后对胰腺癌细胞的细胞存活率。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
仿生药物载体的制备方法，包括：
S1.将原料10g 2-巯基乙醇和0.5g碘化钾溶解在装有30mL乙酸乙酯的三口烧瓶中，在搅拌中缓慢加1mL入双氧水。在室温下持续搅拌2小时。搅拌结束后，加入饱和食盐水溶液，再用乙酸乙酯萃取水相，最后旋蒸除去溶剂得到具有结构式(Ⅰ)的2,2'-二硫二乙醇，
Figure RE-GDA0002061909850000061
S1的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000062
S2.将S1中制得的5g 2,2'-二硫二乙醇(Ⅰ)和3.9g三乙胺溶解于二氯甲烷中，置于冰水浴中，而后在搅拌下缓慢滴加3.5g丙烯酰氯。滴加完毕后，在室温下继续搅拌24小时。反应结束后，加入饱和食盐水溶液，用二氯甲烷在其中萃取，最后旋蒸除去溶剂得到黄色液体丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)，
Figure RE-GDA0002061909850000071
S2的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000072
S3.将2g S2中制得的黄色液体丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)与2.53g药物吉西他滨(GEM) 在20mL四氢呋喃中，以0.1g对硝基苯氯甲酸作为催化剂，在60℃条件下反应12小时，旋蒸除去溶剂，然后使用硅胶柱提纯该产物(淋洗液为石油醚：乙醇＝1:2)，最后得到吉西他滨前药化合物(Ⅲ)，
Figure RE-GDA0002061909850000073
S3的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000074
其中，吉西他滨前药化合物(Ⅲ)做核磁共振，其结果如图1所示，在6.2ppm的峰为双键的特征峰，6.7ppm的峰为吉西他滨药物上氨基的特征峰，且二者的比例为3:2，说明该吉西他滨前药化合物制备成功。
S4.将1.89g磷酸胆碱与2g 4-(11-羟基十一烷氧基)苯甲醛溶解在20mL氯仿中，加入0.2g 对甲基苯磺酸，70℃回流6小时后将其旋蒸干燥，然后使用去离子水和乙酸乙酯萃取提纯该产物，然后将溶解在水中的产物冷冻后使用冷冻干燥机干燥，最后得到端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)，
Figure RE-GDA0002061909850000081
S4的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000082
其中，端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)做核磁共振，其结果如图2所示，谱图中的醛基峰与季铵盐上三个甲基峰积分比例刚好为分子中的含氢量的比值(1:9)，说明端醛基的磷酰胆碱化合物被成功的制备。
S5.将S3中得到的3.04g吉西他滨前药化合物(Ⅲ)与1g PEI溶解在乙醇中，在室温的条件下搅拌反应24小时，得到聚合物前药(Ⅴ)，
Figure RE-GDA0002061909850000091
S5的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000101
S6.将S4中得到的聚合物前药(Ⅴ)与S5中的2.1g端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)溶解在乙醇中，室温下搅拌24小时，最终得到仿生纳米药物载体(Ⅵ)，
Figure RE-GDA0002061909850000111
S6的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000121
仿生药物载体(Ⅴ)的聚合度在10-100范围内取值。
对仿生纳米药物载体进行表征，其结果如图3、4、5、6、7、8；
图4中，该纳米药物载体在pH＝7.4时，zeta电位为+3，而在pH＝5时，由于亲水链段的断裂，载体材料的正电荷裸露出来，zeta电位变为了+16，说明该亲水链段能有效屏蔽正电荷，减小细胞毒性。
图5中，该纳米药物载体在pH＝7.4时，粒径在110nm，而在pH＝5时，裂分为两个峰，一个为10nm，一个为86nm，这两个峰是由于在酸性环境下Schiff减键断裂，裂分为载体前药材料和亲水链段，断裂后载体前药的正电荷变大，从而有利于细胞对于载体前药的摄取。
图6中，该纳米药物载体在无GSH的条件下为单一的分布峰，而在有GSH的存在下裂分为两个小峰，说明结构中二硫键被还原，从而药物被释放。
图7中，在不同pH条件下(无GSH)，释药率基本一致，而当在有GSH的情况下，释药率急剧增大，说明在无GSH的情况下载药材料还是较稳定的，不会出现突释的现象。
图8中，对比图中有无GSH的情况，在无GSH时，药物的释放率很低，所以细胞的杀伤性很低，而在有GSH存在时，药物可以从载体材料中释放，从而导致细胞杀伤性增大。
S7.将S6得到的仿生药物载体溶液装入透析袋，在去离子水中透析3天，每四小时换一次水，最终得到分散均匀的仿生药物纳米颗粒。
实施例2
S1.将原料10g 2-巯基乙醇和0.5g碘化钾溶解在装有30mL乙酸乙酯的三口烧瓶中，在搅拌中缓慢加1mL入双氧水。在室温下持续搅拌2小时。搅拌结束后，加入饱和食盐水溶液，再用乙酸乙酯萃取水相，最后旋蒸除去溶剂得到具有结构式(Ⅰ)的2,2'-二硫二乙醇，
Figure RE-GDA0002061909850000131
S1的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000132
S2.将S1中制得的5g 2,2'-二硫二乙醇(Ⅰ)和3.9g三乙胺溶解于二氯甲烷中，置于冰水浴中，而后在搅拌下缓慢滴加3.5g丙烯酰氯。滴加完毕后，在室温下继续搅拌24小时。反应结束后，加入饱和食盐水溶液，用二氯甲烷在其中萃取，最后旋蒸除去溶剂得到黄色液体丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)，
Figure RE-GDA0002061909850000133
S2的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000141
S3.将2g S2中制得的黄色液体丙烯酸酯二硫化合物(Ⅱ)与2.53g药物吉西他滨(GEM) 在20mL四氢呋喃中，以0.1g对硝基苯氯甲酸作为催化剂，在60℃条件下反应12小时，旋蒸除去溶剂，然后使用硅胶柱提纯该产物(淋洗液为石油醚：乙醇＝1:2)，最后得到吉西他滨前药化合物(Ⅲ)，
Figure RE-GDA0002061909850000142
S3的反应方程为，
Figure RE-GDA0002061909850000143
其中，吉西他滨前药化合物(Ⅲ)做核磁共振，其结果如图1所示，在6.2ppm的峰为双键的特征峰，6.7ppm的峰为吉西他滨药物上氨基的特征峰，且二者的比例为3:2，说明该吉西他滨前药化合物制备成功。
S4.将1.89g磷酸胆碱与2g 4-(11-羟基十一烷氧基)苯甲醛溶解在20mL氯仿中，加入0.2g 对甲基苯磺酸，70℃回流6小时后将其旋蒸干燥，然后使用去离子水和乙酸乙酯萃取提纯该产物，然后将溶解在水中的产物冷冻后使用冷冻干燥机干燥，最后得到端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)，
Figure RE-GDA0002061909850000144
S4的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000145
其中，端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)做核磁共振，其结果如图2所示，谱图中的醛基峰与季铵盐上三个甲基峰积分比例刚好为分子中的含氢量的比值(1:9)，说明端醛基的磷酰胆碱化合物被成功的制备。
S5.将S3中得到的4.05g吉西他滨前药化合物(Ⅲ)与1g PEI溶解在乙醇中，在室温的条件下搅拌反应24小时，得到聚合物前药(Ⅴ)；
Figure RE-GDA0002061909850000151
S5的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000161
S6.将S4中得到的聚合物前药(Ⅴ)与S5中的1.56g端醛基的磷酰胆碱化合物(Ⅳ)溶解在乙醇中，室温下搅拌24小时，最终得到仿生纳米药物载体(Ⅵ)；
Figure RE-GDA0002061909850000171
S6的反应方程为：
Figure RE-GDA0002061909850000181
仿生药物载体(Ⅴ)的聚合度在10-100范围内取值。
对仿生纳米药物载体进行表征，其结果如图3、9、10、11、12、13；
图9中，该纳米药物载体在pH＝7.4时，zeta电位为+2，而在pH＝5时，由于亲水链段的断裂，载体材料的正电荷裸露出来，zeta电位变为了+21，说明该亲水链段能有效屏蔽正电荷，减小细胞毒性。
图10中，该纳米药物载体在pH＝7.4时，粒径在120nm，而在pH＝5时，裂分为两个峰，一个为8nm，一个为102nm，这两个峰是由于在酸性环境下Schiff减键断裂，裂分为载体前药材料和亲水链段，断裂后载体前药的正电荷变大，从而有利于细胞对于载体前药的摄取。
图11中，该纳米药物载体在无GSH的条件下为单一的分布峰，而在有GSH的存在下裂分为两个小峰，说明结构中二硫键被还原，从而药物被释放。
图12中，在不同pH条件下(无GSH)，释药率基本一致，而当在有GSH的情况下，释药率急剧增大，说明在无GSH的情况下载药材料还是较稳定的，不会出现突释的现象。
图13中，对比图中有无GSH的情况，在无GSH时，药物的释放率很低，所以细胞的杀伤性很低，而在有GSH存在时，药物可以从载体材料中释放，从而导致细胞杀伤性增大
S7.将S6得到的仿生药物载体溶液装入透析袋，在去离子水中透析3天，每四小时换一次水，最终得到分散均匀的仿生药物纳米颗粒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.仿生纳米药物载体，其特征在于，其具有式（Ⅰ）的结构：
Figure 281460DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）
式（Ⅰ）中，n为聚合度，值为10-100。
2.根据权利要求1所述的仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将磷酸胆碱与4-(12-羟基十二烷氧基)苯甲醛溶解在有机溶剂d中，加入催化剂，回流后将其旋蒸干燥，然后使用去离子水和乙酸乙酯萃取提纯该产物，再将溶解在水中的产物冷冻后使用冷冻干燥机干燥，最后得到具有结构式（Ⅱ）的端醛基的磷酰胆碱化合物，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅱ）；
S2.将吉西他滨前药化合物（Ⅲ）与PEI溶解在有机溶剂e中，搅拌反应得到具有结构式（Ⅳ）的聚合物前药，
Figure 995338DEST_PATH_IMAGE003
（Ⅳ）
式（Ⅳ）中，n为聚合度，值为10-100；
吉西他滨前药化合物（Ⅲ）的结构如下：
Figure 40654DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅲ）；
S3.将聚合物前药（Ⅳ）与具有端醛基的磷酰胆碱化合物（Ⅱ）溶解在有机溶剂f中，搅拌得到具有结构（Ⅰ）的仿生纳米药物载体，
Figure 639126DEST_PATH_IMAGE005
（Ⅰ）
式（Ⅰ）中，n为聚合度，值为10-100。
3.根据权利要求2所述的仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于：在所述S1中，所述磷酸胆碱与4-(12-羟基十二烷氧基)苯甲醛的摩尔份数比为1：1；有机溶剂d选用氯仿；其中催化剂为路易斯酸，用去离子水和乙酸乙酯将反应物萃取多次。
4.根据权利要求2所述的仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于：在所述S2中，所述吉西他滨前药化合物（Ⅲ）与PEI的摩尔份数比为20：1；其中，所述的PEI分子量为4000；所述有机溶剂e选用乙醇，反应时间为24小时。
5.根据权利要求2所述的仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于：在所述S3中，所述的具有端醛基的磷酰胆碱化合物（Ⅱ）与聚合物前药（Ⅳ）的摩尔份数比为30:1；其中，所述有机溶剂f选用乙醇，反应时间为24小时。
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