CN109957581A - 特异性高表达棕榈酰化缺失mtdh的mda-mb-231细胞株及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种敲除野生型MTDH后重新高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA‑MB‑231细胞株及其构建方法。利用CRIPR/Cas9系统将乳腺癌细胞系MDA‑MB‑231中内源表达的MTDH进行敲除，之后通过定点突变的方式构建MTDH中棕榈酰化位点和sgRNA识别序列处Protospacer Adjacent Motif(PAM)位点同时突变的MTDH表达载体，借助慢病毒体系和抗性筛选获得特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA‑MB‑231细胞株。经测序和Western Blot检测细胞株中MTDH突变及高表达，最终成功构建内源MTDH敲除而棕榈酰化缺失MTDH特异性高表达的细胞株，可作为研究MTDH棕榈酰化修饰在乳腺癌发生发展中的分子作用机制及所参与代谢调控过程的理想细胞株。

Description

特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株及构建 方法

技术领域

本发明是构建一种敲除内源性MTDH，外源高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，涉及生物医学领域。

背景技术

棕榈酰化修饰发现至今已有四十多年的历史，但对其生物学功能以及在肿瘤中的研究却是近几年刚刚开始，它能够调控靶蛋白的胞内运输、亚细胞定位、活性、稳定性、蛋白相互作用等。MTDH作为一种在绝大多数癌症中高表达的癌基因，对肿瘤的研究和治疗具有更为重要的意义，但对其活性和功能的认识却仍处于初期阶段，尤其是对调控定位和功能的棕榈酰化修饰，迄今尚无相关研究，严重限制了MTDH在肿瘤诊断和治疗中的转化应用。研究证实MTDH能够发生棕榈酰化修饰；生物信息学分析显示，MTDH序列中仅存在唯一一个半胱氨酸残基(第75位)，即其棕榈酰化位点，并预测了可能的酰基转移酶。对于MTDH棕榈酰化修饰的研究，对肿瘤中新的肿瘤标志物及肿瘤发生发展的研究具有重要意义，同时也可用于临床早期诊断、预后判断等辅助性治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种借助多种分子细胞生物学手段抑制内源蛋白表达，而使突变型该蛋白外源高表达的方法，并进一步使用该方法构建相应的细胞模型，用于研究目标蛋白的功能以及突变位点的生物学功能，而避免内源野生型蛋白的干扰。

本发明提供的一种特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH蛋白的MDA-MB-231稳定细胞株，是以乳腺癌MDA-MB-231细胞系作为宿主细胞，通过CRISPR/Cas9敲除内源MTDH表达，进一步回补表达突变型MTDH并通过不同的抗性筛选获得的稳定细胞株，构建过程包括MTDHsgRNA的设计、CRISPR/Cas9系统的包装及慢病毒感染、MTDH敲除细胞株的鉴定、棕榈酰化位点及PAM序列双突变MTDH表达载体的构建、慢病毒的包装及感染、突变型MTDH过表达细胞株的鉴定。

特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，是一种内源MTDH敲除而棕榈酰化位点突变MTDH特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法，其特征在于：以乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为宿主细胞通过基因敲除(CRISPR/Cas9)和突变基因过表达两步筛选实现敲除野生型MTDH而回补突变型MTDH表达；双突变后MTDH基因序列如下：

ATGGCTGCACGGAGCTGGCAGGACGAGCTGGCCCAGCAGGCCGAGGAGGGCTCGGCCCGGCTGCGGGAAATGCTCTCGGTCGGCCTACC(PAM位点突变后序列，原为GG)CTTTCTGCGCACCGAGCTGGGCCTCGACCTGGGGCTGGAGCCGAAACGGTACCCCGGCTGGGTGATCCTGGTGGGCACTGGCGCGCTCGGGCTGCTGCTGCTGTTTCTGCTGGGCTACGGCTGGGCCGCGGCTAGT(棕榈酰化位点突变后序列，原为TGC)GCCGGCGCCCGCAAAAAGCGGAGGAGCCCGCCCCGCAAGCGGGAGGAGGCGGCGGCCGTGCCGGCCGCGGCCCCCGACGACCTGGCCTTGCTGAAGAATCTCCGGAGCGAGGAACAGAAGAAGAAGAACCGGAAGAAACTGTCCGAGAAGCCCAAACCAAATGGGCGGACTGTTGAAGTGGCTGAGGGTGAAGCTGTTCGAACACCTCAAAGTGTAACAGCAAAGCAGCCACCAGAGATTGACAAGAAAAATGAAAAGTCAAAGAAAAATAAGAAGAAATCAAAGTCAGATGCTAAAGCAGTGCAAAACAGTTCACGCCATGATGGAAAGGAAGTTGATGAAGGAGCCTGGGAAACTAAAATTAGTCACAGAGAGAAACGACAGCAGCGTAAACGTGATAAGGTGCTGACTGATTCTGGTTCATTGGATTCAACTATCCCTGGGATAGAAAATACCATCACAGTTACCACCGAGCAACTTACAACCGCATCATTTCCTGTTGGTTCCAAGAAGAATAAAGGTGATTCTCATCTAAATGTTCAAGTTAGCAACTTTAAATCTGGAAAAGGAGATTCTACACTTCAGGTTTCTTCAGGATTGAATGAAAACCTCACTGTCAATGGAGGAGGCTGGAATGAAAAGTCTGTAAAACTCTCCTCACAGATCAGTGCAGGTGAGGAGAAGTGGAACTCCGTTTCACCTGCTTCTGCAGGAAAGAGGAAAACTGAGCCATCTGCCTGGAGTCAAGACACTGGAGATGCTAATACAAATGGAAAAGACTGGGGAAGGAGTTGGAGTGACCGTTCAATATTTTCTGGCATTGGGTCTACTGCTGAGCCAGTTTCTCAGTCTACCACTTCTGATTATCAGTGGGATGTTAGCCGTAATCAACCCTATATCGATGATGAATGGTCTGGGTTAAATGGTCTGTCTTCTGCTGATCCCAACTCTGATTGGAATGCACCAGCAGAAGAGTGGGGCAATTGGGTAGACGAAGAAAGAGCTTCACTTCTAAAGTCCCAGGAACCAATTCCTGATGATCAAAAGGTCTCAGATGATGATAAAGAAAAGGGAGAGGGAGCTCTTCCAACTGGGAAATCCAAAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAGCAAGGTGAAGATAACTCTACTGCACAGGACACAGAAGAATTAGAAAAAGAGATTAGAGAAGACCTTCCAGTGAATACCTCTAAAACCCGTCCAAAACAGGAAAAAGCTTTTTCCTTGAAGACCATAAGCACTAGTGATCCAGCCGAAGTACTCGTCAAAAATAGCCAGCCTATCAAGACTCTTCCACCTGCTACTTCTACCGAGCCATCTGTAATCTTATCAAAAAGTGATTCTGACAAGAGCTCTTCCCAAGTGCCGCCAATACTACAAGAGACAGATAAATCCAAGTCAAATACCAAGCAAAATAGTGTGCCTCCTTCACAGACCAAGTCTGAAACTAGCTGGGAATCTCCCAAACAAATAAAAAAGAAGAAAAAAGCCAGACGAGAAACGTGA。

所述特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法：

包括以下步骤：

1)将野生型MTDH的sgRNA序列连至Lentivirus V2慢病毒载体中，得sgMTDH载体；

2)转染前24～48h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

3)在HEK293T细胞中以1:9:10的质量比例转染4～6μg包装质粒及病毒质粒质粒，分别为pVSV-G:pSPAX2:sgRNA(包含sgControl及sgMTDH载体)；

4)转染8～12h后吸去培养基并加入10ml DMEM培养基；

5)感染前24～48h将靶细胞MDA-MB-231接种于dish以使感染时细胞密度达到40％～70％；

6)转染后48～72h，将上清放入离心管中，2000～3000rpm离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入待感染的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度2～6μg/ml，优选2.5～5μg/ml polybrene；

7)感染的MDA-MB-231细胞培养8～24h后吸去培养基，换用DMEM培养基转至dish中，继续培养；

8)用含3～8μg/ml puromycin的DMEM培养基换液对细胞进行筛选，24～48h后将存活的细胞挑取单克隆放入96孔板培养至足够数量后，提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量；

9)使用点突变的方式在MTDH基因序列中进行两次定点突变；首先在编码棕榈酰化位点(Cys75)的基因序列处设计突变引物，使Cys75密码子TGC突变为AGT(编码丝氨酸Ser)进一步再将所设计sgRNA序列附近的PAM序列AGG突变为ACC(同义突变)，避免CRISPR/Cas9系统对外源表达MTDH的敲除，将双突变的MTDH序列连至pLoc过表达载体中，得pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

10)转染前24～48h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

11)在293T细胞中以1:9:10的比例转染4～6μg包装质粒及病毒质粒，分别为pVSV-G:pSPAX2:过表达载体pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

12)转染8-12h后吸去培养基并加入DMEM培养基；

13)病毒感染前24～48h将之前筛选验证的MTDH成功敲除的MDA-MB-231细胞接种于dish以使实验时细胞密度达到40％～70％；

14)转染后48～72h，将含有病毒的DMEM培养基转移至离心管中，2000～3000rpm转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入待感染的MTDH敲除的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度2.5～5μg/ml polybrene；

15)病毒干扰8～24h后吸去含病毒的培养基，换用DMEM培养基继续培养24～48h；

16)用含10～20μg/ml BSH的培养基换液对细胞进行筛选，提取细胞RNA，反转录后检测其中MTDH mRNA序列；提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量。

根据所述构建方法获得的特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株。本发明的优点为：

本发明涉及一种敲除野生型MTDH后重新高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株及其构建方法。利用CRIPR/Cas9系统将乳腺癌细胞系MDA-MB-231中内源表达的MTDH进行敲除，之后通过定点突变的方式构建MTDH中棕榈酰化位点和sgRNA识别序列处Protospacer Adjacent Motif(PAM)位点同时突变的MTDH表达载体，借助慢病毒体系和抗性筛选获得特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株。经测序和WesternBlot检测细胞株中MTDH突变及高表达，最终成功构建内源MTDH敲除而棕榈酰化缺失MTDH特异性高表达的细胞株，可作为研究MTDH棕榈酰化修饰在乳腺癌发生发展中的分子作用机制及所参与代谢调控过程的理想细胞株。

附图说明

图1：Western blot检测CRISPR/Cas9敲除MTDH后MDA-MB-231结果；

图2：MTDH敲除的MDA-MB-231细胞中回补表达棕榈酰化缺失MTDH检测。

具体实施方式

一种敲除野生型MTDH后重新高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，主要步骤如下：

MTDH sgRNA的设计及CRIPSR/Cas9系统的包装

1)借助在线软件CRIPR DESIGN(http://crispr.mit.edu/)获得最佳MTDH sgRNA序列，构建带有MTDH sgRNA的Lentivirus V2慢病毒载体。

2)转染前24h将3×10⁵数量的慢病毒包装细胞HEK293T接种于10cm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。转染时在HEK293T细胞中加入共计6μg质粒，比例为pVSVg:PSPAX2:sgRNA＝1:9:10。

3)转染12h后吸去HEK293T细胞的培养基并加入3ml新鲜的DMEM培养基。

靶细胞感染与筛选

1)病毒感染前24h将2×10⁵数量的待感染MDA-MB-231细胞接种于10cm dish中以使第二天细胞密度达到50％左右。

2)HEK293T细胞转染后72h，收集含病毒的细胞培养基转移至15ml离心管中，3000rpm室温离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒并加入待感染MDA-MB-231细胞中，同时加入终浓度5μg/ml polybrene，于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h。

3)弃去含病毒的MDA-MB-231细胞培养基，换用新鲜的DMEM培养基继续培养48h。

4)48h后用含3μg/ml puromycin的DMEM培养基换液，24h后将存活的细胞克隆分别挑取至96孔板中继续培养，至足够数量后提取不同克隆中细胞总蛋白验证目标蛋白MTDH的表达情况，确定MTDH完全敲除的MDA-MB-231细胞株。细胞蛋白的提取及Western Blot实验具体实施过程如下：

4.1)蛋白质样品的制备

a)配制RIPA蛋白裂解液(每个60mm的培养皿用100ul)加入蛋白酶抑制剂。

b)收集细胞，并用预冷的PBS清洗细胞，用配制好的蛋白裂解液将细胞吹散，将细胞移到离心管中，放入DNA混合仪中混匀，冰上孵育30min。

c)将离心管放入离心机中，4℃13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管中。

d)以BCA法测定蛋白浓度测浓度

空白对照：RIPA

混合不同浓度的BSA(0.125μg/μl，0.25μg/μl，0.5μg/μl，1μg/μl，2μg/μl)各20μl，制

成标准品备用并稀释2μl的样品到18μl的RIPA。

BCA系统:A:B＝50:1比例配置测量的溶液，最终按照200μl BCA+20μl样品或者标准品，

振荡后37℃孵育30min，用酶标仪测量蛋白浓度。

e)取所需质量的样品，加入5×SDS Loading buffer(含DTT 0.1M),并将混合物在95℃加热10min使蛋白质变性。

4.2)免疫印迹技术(Western Blot)

a)将凝胶固定到电泳装置上后，加入Tris-Glycine电泳缓冲液后，加样，在不加入样品的胶孔中加入等体积的1×SDS Loading buffer进行配平。

b)连接好电源后用80V电压跑胶，当样品经过浓缩胶到达分离胶时，将电压增大到120V直至溴酚蓝接近凝胶末端然后结束电泳。

c)取出电泳好的凝胶，并切除外源及上层的积层胶。

d)转膜：将膜及4片滤纸剪成所需胶的大小。先将PVDF膜浸于甲醇中浸泡5分钟。按照顺序：正级-海绵+滤纸+膜+胶+滤纸+海绵-负极，将膜夹紧，每一层都要压平，防止产生气泡。

e)将组装好的夹子放入装有转膜缓冲液的电泳槽中，放入冰盒，转子后加盖，并将电泳槽外围加入冰水混合物后放在磁力搅拌器上接通电源。恒流400mA转膜2h。

f)将转好的膜放入TBST中洗涤5min，洗涤两次。

g)封闭：用TBST配置5％的脱脂牛奶并混匀，将PVDF膜浸泡在含5％脱脂牛奶的TBST中，室温摇晃0.5-1h。

h)将膜放入TBST中洗涤5min，洗涤三次，将PVDF膜放在杂交袋中，再将用5％BSA稀释的一抗加入杂交袋中，轻轻赶走气泡，封口，4℃摇床过夜或者置于摇床上室温孵育1-2h。

i)将PVDF膜取出，用TBST清洗3次，每次15min。

j)在膜上加上用TBST配置的5％脱脂牛奶稀释好的二抗，置于摇床上室温孵育2h。

将膜用TBST清洗3次，每次15min。

k)将Thermo的发光液按1:1的比例将A、B液混合。用镊子夹起PVDF膜的边缘，用吸水纸吸去膜边缘多余水分，将其放在保鲜膜上，加入发光夜，避光孵育5分钟,曝光。

双突变MTDH载体的构建

针对MTDH序列棕榈酰化位点(Cys75)，设计正反两条引物，以野生型MTDH表达载体作为模板，通过PCR扩增使该位点加以突变，突变引物如下：

MTDHC75S-F:ACGGCTGGGCCGCGGCTAGTGCCGGC

MTDHC75S-R:TTTGCGGGCGCCGGCACTAGCCGCG(加粗部分为突变位点)

以突变后的序列为模板，进一步合成PAM位点突变的引物，引物序列如下：

mPAM-F:GCTCTCGGTCGGCCTACCCTTTCTG

mPAM-R:AGGGTAGGCCGACCGAGAGC(加粗部分为突变位点)

通过两次突变PCR，构建棕榈酰化位点突变(Cys75Ser)及PAM突变(AGG87ACC)的MTDH双突变序列，连至pLoc慢病毒载体中，构建可用于包装慢病毒的双突变MTDH表达载体。

双突变后MTDH基因序列如下：

ATGGCTGCACGGAGCTGGCAGGACGAGCTGGCCCAGCAGGCCGAGGAGGGCTCGGCCCGGCTGCGGGAAATGCTCTCGGTCGGCCTACC(PAM位点突变后序列，原为GG)CTTTCTGCGCACCGAGCTGGGCCTCGACCTGGGGCTGGAGCCGAAACGGTACCCCGGCTGGGTGATCCTGGTGGGCACTGGCGCGCTCGGGCTGCTGCTGCTGTTTCTGCTGGGCTACGGCTGGGCCGCGGCTAGT(棕榈酰化位点突变后序列，原为TGC)GCCGGCGCCCGCAAAAAGCGGAGGAGCCCGCCCCGCAAGCGGGAGGAGGCGGCGGCCGTGCCGGCCGCGGCCCCCGACGACCTGGCCTTGCTGAAGAATCTCCGGAGCGAGGAACAGAAGAAGAAGAACCGGAAGAAACTGTCCGAGAAGCCCAAACCAAATGGGCGGACTGTTGAAGTGGCTGAGGGTGAAGCTGTTCGAACACCTCAAAGTGTAACAGCAAAGCAGCCACCAGAGATTGACAAGAAAAATGAAAAGTCAAAGAAAAATAAGAAGAAATCAAAGTCAGATGCTAAAGCAGTGCAAAACAGTTCACGCCATGATGGAAAGGAAGTTGATGAAGGAGCCTGGGAAACTAAAATTAGTCACAGAGAGAAACGACAGCAGCGTAAACGTGATAAGGTGCTGACTGATTCTGGTTCATTGGATTCAACTATCCCTGGGATAGAAAATACCATCACAGTTACCACCGAGCAACTTACAACCGCATCATTTCCTGTTGGTTCCAAGAAGAATAAAGGTGATTCTCATCTAAATGTTCAAGTTAGCAACTTTAAATCTGGAAAAGGAGATTCTACACTTCAGGTTTCTTCAGGATTGAATGAAAACCTCACTGTCAATGGAGGAGGCTGGAATGAAAAGTCTGTAAAACTCTCCTCACAGATCAGTGCAGGTGAGGAGAAGTGGAACTCCGTTTCACCTGCTTCTGCAGGAAAGAGGAAAACTGAGCCATCTGCCTGGAGTCAAGACACTGGAGATGCTAATACAAATGGAAAAGACTGGGGAAGGAGTTGGAGTGACCGTTCAATATTTTCTGGCATTGGGTCTACTGCTGAGCCAGTTTCTCAGTCTACCACTTCTGATTATCAGTGGGATGTTAGCCGTAATCAACCCTATATCGATGATGAATGGTCTGGGTTAAATGGTCTGTCTTCTGCTGATCCCAACTCTGATTGGAATGCACCAGCAGAAGAGTGGGGCAATTGGGTAGACGAAGAAAGAGCTTCACTTCTAAAGTCCCAGGAACCAATTCCTGATGATCAAAAGGTCTCAGATGATGATAAAGAAAAGGGAGAGGGAGCTCTTCCAACTGGGAAATCCAAAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAGCAAGGTGAAGATAACTCTACTGCACAGGACACAGAAGAATTAGAAAAAGAGATTAGAGAAGACCTTCCAGTGAATACCTCTAAAACCCGTCCAAAACAGGAAAAAGCTTTTTCCTTGAAGACCATAAGCACTAGTGATCCAGCCGAAGTACTCGTCAAAAATAGCCAGCCTATCAAGACTCTTCCACCTGCTACTTCTACCGAGCCATCTGTAATCTTATCAAAAAGTGATTCTGACAAGAGCTCTTCCCAAGTGCCGCCAATACTACAAGAGACAGATAAATCCAAGTCAAATACCAAGCAAAATAGTGTGCCTCCTTCACAGACCAAGTCTGAAACTAGCTGGGAATCTCCCAAACAAATAAAAAAGAAGAAAAAAGCCAGACGAGAAACGTGA

慢病毒包装、靶细胞感染与筛选

1)转染前24h将3×10⁵数量的慢病毒包装细胞HEK293T接种于10cm细胞培养皿以使第二天细胞密度达到60％～70％。转染时在HEK293T细胞中加入共计6μg质粒，质量比例为pVSVg:PSPAX2:sgRNA(分为对照载体pLoc-rfp和pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC)＝1:9:10。

2)转染12h后吸去HEK293T细胞的培养基并加入3ml新鲜的DMEM培养基。

3)以之前筛选并验证的MTDH完全敲除MDA-MB-231细胞株作为待感染细胞。病毒感染前24h将2×10⁵数量的待感染MTDH敲除的MDA-MB-231细胞接种于10cm dish中以使第二天细胞密度达到50％左右。

4)HEK293T细胞转染后72h，收集含病毒的细胞培养基转移至15ml离心管中，3000rpm室温离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒并加入待感染MTDH敲除的MDA-MB-231细胞中，同时加入终浓度5μg/ml polybrene，于37℃、5％CO₂培养箱内培养24h。

5)24h后弃去含病毒的MDA-MB-231细胞培养基，换用新鲜的DMEM培养基继续培养48h。6)48h后用含15μg/ml BSH的DMEM培养基继续培养，每48h换新鲜的含15μg/ml BSH的DMEM培养基，弃掉死亡细胞，待存活的细胞生长至足够数量后分别提取细胞总蛋白和总RNA验证目标蛋白MTDH的表达情况及MTDH mRNA序列中棕榈酰化位点是否确实发生突变。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株及构建方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctgcac ggagctggca ggacgagctg gcccagcagg ccgaggaggg ctcggcccgg 60

ctgcgggaaa tgctctcggt cggcctaccc tttctgcgca ccgagctggg cctcgacctg 120

gggctggagc cgaaacggta ccccggctgg gtgatcctgg tgggcactgg cgcgctcggg 180

ctgctgctgc tgtttctgct gggctacggc tgggccgcgg ctagtgccgg cgcccgcaaa 240

aagcggagga gcccgccccg caagcgggag gaggcggcgg ccgtgccggc cgcggccccc 300

gacgacctgg ccttgctgaa gaatctccgg agcgaggaac agaagaagaa gaaccggaag 360

aaactgtccg agaagcccaa accaaatggg cggactgttg aagtggctga gggtgaagct 420

gttcgaacac ctcaaagtgt aacagcaaag cagccaccag agattgacaa gaaaaatgaa 480

aagtcaaaga aaaataagaa gaaatcaaag tcagatgcta aagcagtgca aaacagttca 540

cgccatgatg gaaaggaagt tgatgaagga gcctgggaaa ctaaaattag tcacagagag 600

aaacgacagc agcgtaaacg tgataaggtg ctgactgatt ctggttcatt ggattcaact 660

atccctggga tagaaaatac catcacagtt accaccgagc aacttacaac cgcatcattt 720

cctgttggtt ccaagaagaa taaaggtgat tctcatctaa atgttcaagt tagcaacttt 780

aaatctggaa aaggagattc tacacttcag gtttcttcag gattgaatga aaacctcact 840

gtcaatggag gaggctggaa tgaaaagtct gtaaaactct cctcacagat cagtgcaggt 900

gaggagaagt ggaactccgt ttcacctgct tctgcaggaa agaggaaaac tgagccatct 960

gcctggagtc aagacactgg agatgctaat acaaatggaa aagactgggg aaggagttgg 1020

agtgaccgtt caatattttc tggcattggg tctactgctg agccagtttc tcagtctacc 1080

acttctgatt atcagtggga tgttagccgt aatcaaccct atatcgatga tgaatggtct 1140

gggttaaatg gtctgtcttc tgctgatccc aactctgatt ggaatgcacc agcagaagag 1200

tggggcaatt gggtagacga agaaagagct tcacttctaa agtcccagga accaattcct 1260

gatgatcaaa aggtctcaga tgatgataaa gaaaagggag agggagctct tccaactggg 1320

aaatccaaaa agaaaaaaaa gaaaaagaag aagcaaggtg aagataactc tactgcacag 1380

gacacagaag aattagaaaa agagattaga gaagaccttc cagtgaatac ctctaaaacc 1440

cgtccaaaac aggaaaaagc tttttccttg aagaccataa gcactagtga tccagccgaa 1500

gtactcgtca aaaatagcca gcctatcaag actcttccac ctgctacttc taccgagcca 1560

tctgtaatct tatcaaaaag tgattctgac aagagctctt cccaagtgcc gccaatacta 1620

caagagacag ataaatccaa gtcaaatacc aagcaaaata gtgtgcctcc ttcacagacc 1680

aagtctgaaa ctagctggga atctcccaaa caaataaaaa agaagaaaaa agccagacga 1740

gaaacgtga 1749

Claims (3)

1.特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株的构建方法，是一种内源MTDH敲除而棕榈酰化位点突变MTDH特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法，其特征在于：以乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞作为宿主细胞通过基因敲除(CRISPR/Cas9)和突变基因过表达两步筛选实现敲除野生型MTDH而回补突变型MTDH表达；双突变后MTDH基因序列如下：

ATGGCTGCACGGAGCTGGCAGGACGAGCTGGCCCAGCAGGCCGAGGAGGGCTCGGCCCGGCTGCGGGAAATGCTCTCGGTCGGCCTACC(PAM位点突变后序列，原为GG)CTTTCTGCGCACCGAGCTGGGCCTCGACCTGGGGCTGGAGCCGAAACGGTACCCCGGCTGGGTGATCCTGGTGGGCACTGGCGCGCTCGGGCTGCTGCTGCTGTTTCTGCTGGGCTACGGCTGGGCCGCGGCTAGT(棕榈酰化位点突变后序列，原为TGC)GCCGGCGCCCGCAAAAAGCGGAGGAGCCCGCCCCGCAAGCGGGAGGAGGCGGCGGCCGTGCCGGCCGCGGCCCCCGACGACCTGGCCTTGCTGAAGAATCTCCGGAGCGAGGAACAGAAGAAGAAGAACCGGAAGAAACTGTCCGAGAAGCCCAAACCAAATGGGCGGACTGTTGAAGTGGCTGAGGGTGAAGCTGTTCGAACACCTCAAAGTGTAACAGCAAAGCAGCCACCAGAGATTGACAAGAAAAATGAAAAGTCAAAGAAAAATAAGAAGAAATCAAAGTCAGATGCTAAAGCAGTGCAAAACAGTTCACGCCATGATGGAAAGGAAGTTGATGAAGGAGCCTGGGAAACTAAAATTAGTCACAGAGAGAAACGACAGCAGCGTAAACGTGATAAGGTGCTGACTGATTCTGGTTCATTGGATTCAACTATCCCTGGGATAGAAAATACCATCACAGTTACCACCGAGCAACTTACAACCGCATCATTTCCTGTTGGTTCCAAGAAGAATAAAGGTGATTCTCATCTAAATGTTCAAGTTAGCAACTTTAAATCTGGAAAAGGAGATTCTACACTTCAGGTTTCTTCAGGATTGAATGAAAACCTCACTGTCAATGGAGGAGGCTGGAATGAAAAGTCTGTAAAACTCTCCTCACAGATCAGTGCAGGTGAGGAGAAGTGGAACTCCGTTTCACCTGCTTCTGCAGGAAAGAGGAAAACTGAGCCATCTGCCTGGAGTCAAGACACTGGAGATGCTAATACAAATGGAAAAGACTGGGGAAGGAGTTGGAGTGACCGTTCAATATTTTCTGGCATTGGGTCTACTGCTGAGCCAGTTTCTCAGTCTACCACTTCTGATTATCAGTGGGATGTTAGCCGTAATCAACCCTATATCGATGATGAATGGTCTGGGTTAAATGGTCTGTCTTCTGCTGATCCCAACTCTGATTGGAATGCACCAGCAGAAGAGTGGGGCAATTGGGTAGACGAAGAAAGAGCTTCACTTCTAAAGTCCCAGGAACCAATTCCTGATGATCAAAAGGTCTCAGATGATGATAAAGAAAAGGGAGAGGGAGCTCTTCCAACTGGGAAATCCAAAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAGCAAGGTGAAGATAACTCTACTGCACAGGACACAGAAGAATTAGAAAAAGAGATTAGAGAAGACCTTCCAGTGAATACCTCTAAAACCCGTCCAAAACAGGAAAAAGCTTTTTCCTTGAAGACCATAAGCACTAGTGATCCAGCCGAAGTACTCGTCAAAAATAGCCAGCCTATCAAGACTCTTCCACCTGCTACTTCTACCGAGCCATCTGTAATCTTATCAAAAAGTGATTCTGACAAGAGCTCTTCCCAAGTGCCGCCAATACTACAAGAGACAGATAAATCCAAGTCAAATACCAAGCAAAATAGTGTGCCTCCTTCACAGACCAAGTCTGAAACTAGCTGGGAATCTCCCAAACAAATAAAAAAGAAGAAAAAAGCCAGACGAGAAACGTGA。

2.如权利要求1所述特异性高表达的MDA-MB-231细胞株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将野生型MTDH的sgRNA序列连至Lentivirus V2慢病毒载体中，得sgMTDH载体；

2)转染前24～48h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

3)在HEK293T细胞中以1:9:10的质量比例转染4～6μg包装质粒及病毒质粒质粒，分别为pVSV-G:pSPAX2:sgRNA(包含sgControl及sgMTDH载体)；

4)转染8～12h后吸去培养基并加入10ml DMEM培养基；

5)感染前24～48h将靶细胞MDA-MB-231接种于dish以使感染时细胞密度达到40％～70％；

6)转染后48～72h，将上清放入离心管中，2000～3000rpm离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入待感染的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度2～6μg/ml，优选2.5～5μg/ml polybrene；

7)感染的MDA-MB-231细胞培养8～24h后吸去培养基，换用DMEM培养基转至dish中，继续培养；

8)用含3～8μg/ml puromycin的DMEM培养基换液对细胞进行筛选，24～48h后将存活的细胞挑取单克隆放入96孔板培养至足够数量后，提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量；

9)使用点突变的方式在MTDH基因序列中进行两次定点突变；首先在编码棕榈酰化位点(Cys75)的基因序列处设计突变引物，使Cys75密码子TGC突变为AGT(编码丝氨酸Ser)进一步再将所设计sgRNA序列附近的PAM序列AGG突变为ACC(同义突变)，避免CRISPR/Cas9系统对外源表达MTDH的敲除，将双突变的MTDH序列连至pLoc过表达载体中，得pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

10)转染前24～48h将用于慢病毒包装的细胞HEK293T接种于细胞培养皿；

11)在293T细胞中以1:9:10的比例转染4～6μg包装质粒及病毒质粒，分别为pVSV-G:pSPAX2:过表达载体pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

12)转染8-12h后吸去培养基并加入DMEM培养基；

13)病毒感染前24～48h将之前筛选验证的MTDH成功敲除的MDA-MB-231细胞接种于dish以使实验时细胞密度达到40％～70％；

14)转染后48～72h，将含有病毒的DMEM培养基转移至离心管中，2000～3000rpm转离心10分钟，吸取上清并用0.45μm的滤膜过滤，得到所需病毒液，加入待感染的MTDH敲除的MDA-MB-231细胞中并同时加入终浓度2.5～5μg/ml polybrene；

15)病毒干扰8～24h后吸去含病毒的培养基，换用DMEM培养基继续培养24～48h；

16)用含10～20μg/ml BSH的培养基换液对细胞进行筛选，提取细胞RNA，反转录后检测其中MTDH mRNA序列；提取蛋白，通过Western blot检测MTDH的表达量。

3.如权利要求1或2所述构建方法获得的特异性高表达棕榈酰化缺失MTDH的MDA-MB-231细胞株。