CN109938012A - 一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法 - Google Patents
一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，包括如下步骤：(1)花药和花粉的预处理；(2)花药和花粉的保存；(3)花药和花粉的解冻和授粉。本发明能够大量有效收集花粉，并有效维持花粉活力，在授粉过程中自然分离花药和花粉提高授粉率，使用本发明达到花费时间少，花粉损失少，花粉活性高等优点，使得香水莲花花粉的寿命延长、花粉利用率显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物花粉保存的方法，具体是一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，属于植物发育生物学领域。
背景技术
香水莲花(Nymphaea hybrid)是睡莲科睡莲属的一种热带大型睡莲，主要分布在我国广州、福建、海南、四川、浙江等地。因其花色丰富，花型优美，被广泛应用于鲜切花、园林水湖造景和盆栽等。同时，已有多项研究表明香水莲花具有抗氧化、抑制前列腺增生、降血脂等作用，同时对大气、水体和土壤污染等具有一定的净化和修复作用。由此可见，香水莲花是一种集药用、生态和观赏应用价值于一体的水生花卉植物，具有较高的推广价值。
花粉作为香水莲花种质的形式之一，包含了香水莲花的全部遗传品质信息，是香水莲花种质保存、交换、人工辅助授粉以及杂交育种的重要材料。目前，香水莲花培育新品种的主要方式是杂交育种，而保证较高的花粉生活力是确保杂交成功的首要条件。前期试验发现，在自然状态下，香水莲花花粉的寿命很短，这给种质保存和杂交育种工作带来极大的不利。
对于植物花粉的保存目前多采用超低温的方法，但这种方法不仅保存条件要求较高、保存成本大，而且在需要使用花粉时，花粉复苏过程较长，技术较复杂，稍有不慎就会导致花粉褐变，使花粉蛋白酶丧失活性，使用这种方法保存的花粉无法做到即取即用，使用效率较低。
现有技术中也公开了一些保持花粉生活力的方法，但保存期限较短，并不能完全满足睡莲杂交育种工作与种质资源保存研究的实际需要。同时，香水莲花花粉小、花粉量少，不易收集大量花粉，如果继续沿用目前对植物花粉采集与保存的方法，不仅费时费工，而且容易导致花粉损失过多。因此，研发一种适合于香水莲花花粉的可行的高效收集保存的方法是非常必要的。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的目的在于提供一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，且本发明能够大量有效收集花粉，并有效维持花粉活力，在授粉过程中自然分离花药和花粉提高授粉率，使用本发明达到花费时间少，花粉损失少，花粉活性高等优点，使得香水莲花花粉的寿命延长、花粉利用率显著提高。
为解决上述技术问题，本发明方法包括以下步骤：
本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：
一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，包括如下步骤：
(1)花药和花粉的预处理：在大蕾期采集香水莲花花朵，将香水莲花的花药取出，拨成单层花药均匀摊开在硫酸纸或羊皮纸上，然后将单层花药和散落的花粉置于密闭容器内遮光干燥20～24h，使花药和花粉含水量保持在4.5％-6.5％；
(2)花药和花粉的保存：香水莲花花药和花粉经步骤(1)处理后，将花粉和花药收集并装入离心管中，置于4℃或-20℃或-80℃中保存；
(3)花粉的解冻和授粉：香水莲花花粉在使用时，从离心管中取出花药和花粉后先置于室温下自然解冻30min后用于授粉。
进一步的技术方案，步骤(1)中所述的的密闭容器内平铺有干燥剂，所述的干燥剂平铺的厚度为2cm～3cm，所述的干燥剂置于硫酸纸或羊皮纸的下方，所述的干燥剂为硅胶变色干燥剂。
更进一步的技术方案，所述的硅胶变色干燥剂由蓝色变为粉色或粉红色时应及时更换。
进一步的技术方案，步骤(1)中所述的花药和花粉平铺的厚度不超过1cm。
进一步的技术方案，步骤(1)的所述的密闭容器内的干燥的环境为室温22～28℃，相对湿度60％～70％。
进一步的技术方案，步骤(2)中所述的花药和花粉的收集并装入离心管的具体操作流程是：先将沾有花粉的花药用镊子轻轻的夹入离心管中；花药收集完后，轻轻倾斜纸张四角，使剩余花粉汇聚在纸张中央，然后将纸张沿着一角轻轻对折，缓慢倾斜至45°，并轻轻抖动，使花粉滑落至离心管内，即完成花药和花粉的收集。
进一步的技术方案，步骤(2)中所述的离心管为10mL～50mL的塑料离心管，所述花药与花粉的体积不超过离心管容积的2/3。
进一步的技术方案，步骤(2)中所述的花药和花粉若在1个月内使用，就将收集好的花药和花粉置于4℃的冰箱内保存；花药和花粉若在1个月之后使用，就将收集好的花药和花粉置于-80℃或-20℃的冷冻室内。
进一步的技术方案，步骤(3)中所述的花药和花粉的授粉方法为：在母本花朵开放第一天，柱头分泌大量黏液时，用注射器吸取母本的柱头液注入保存花药和花粉的离心管内，注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1,盖上盖子上下摇动，使柱头液和花粉混合均匀，然后用注射器吸取1～4mL离心管中混有花粉的柱头液，注入套袋的母本柱头上，再重新套袋隔离，即完成授粉。
进一步的技术方案，所述的密闭容器为规格为45cm*40cm*20cm的方形抽屉。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用花药和花粉同时收集保存的方法，有效避免花粉收集时损耗率高的问题，解决了香水莲花花粉小、花粉量少、不易于大量收集并保存这一难题，且花费时间少。
2、本发明使用干燥剂的方式相比传统方式中使用干燥器进行花粉干燥，可以快速干燥收集大量生活力高的花粉，效率高，且干燥投入成本也较低，同时在干燥过程中严格控制花粉含水量保持在4.5％-6.5％，避免花粉细胞中水分在冷冻时结晶使细胞受损，提高花粉存活率。
3、本发明首次提出应当根据不同时间周期使用花粉的情况选择保存花药和花粉的环境，将花药和花粉分别放置在不同的温度中进行保存，通过花粉活力检测，筛选出适宜香水莲花花粉短期和长期保存的不同条件，可根据实际需要和实地条件选择不同的保存方式，该方法有效提高了花粉解冻和授粉的效率。
4、本发明优化条件密闭容器内的干燥的环境主要采用空调进行温湿度调节，控制温度为22～28℃，相对湿度60％～70％，以保证自然条件下花粉活性和研究的客观性。
6、本发明花药与花粉的体积不超过离心管容积的2/3，以防止花药与花粉结块发生霉变。
7、本发明在授粉时注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1，以保证柱头液中足够的花粉数。通过盖上盖子上下摇动能够有效分离花药和花粉，同时花粉可以有效和柱头液混合均匀，提高授粉效率。
8、本发明的方法简单易行且节省时间，根据需要，可随时随地从保存环境中取出用于科研与生产，如果是远距离杂交育种可采用冰盒携带花粉，到母本所在地后室温下自然解冻30min，用于授粉。
综上所述，本发明改变了现有对香水莲花的花粉干燥、收集保存和授粉的方法，效率高且省时省力，操作简单、可重复性强，能有效保证香水莲花花粉活力，在香水莲花杂交育种研究和种质资源创新工作中具有重要的实践与推广意义。
附图说明
图1为本发明不同保存条件对‘黄花型’香水莲花花粉活力的影响；
图2为本发明不同保存条件对‘紫花型’香水莲花花粉活力的影响；
图3为本发明不同保存条件对‘粉花型’香水莲花花粉活力的影响；
图4为本发明收集并保存香水莲花花药和花粉的流程示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，并介绍本发明的相关研究结果。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
以‘黄花型’香水莲花为例
(1)花药和花粉的预处理：在大蕾期采集香水莲花花朵，将香水莲花的花药取出，拨成单层花药均匀摊开在硫酸纸或羊皮纸上，花药和花粉平铺的厚度为0.6cm，然后将单层花药和散落的花粉置于规格为45cm*40cm*20cm的方形抽屉内遮光干燥20h，利用外部空调保证方形抽屉中的干燥的环境为室温22～28℃，相对湿度60％～70％。干燥后‘黄花型’香水莲花花药和花粉含水量为6.5％；所述的方形抽屉内平铺有硅胶变色干燥剂，硅胶变色干燥剂平铺的厚度为3cm，其置于硫酸纸或羊皮纸的下方，当硅胶变色干燥剂由蓝色变为粉色或粉红色时应及时更换。
(2)花药和花粉的保存：‘黄花型’香水莲花花药和花粉经步骤(1)处理后，将花粉和花药分成四份，分别收集并装入50mL离心管中，装入的操作方式是先将沾有花粉的花药用镊子轻轻的夹入离心管中；花药收集完后，轻轻倾斜纸张四角，使剩余花粉汇聚在纸张中央，然后将纸张沿着一角轻轻对折，缓慢倾斜至45°，并轻轻抖动，使花粉滑落至离心管内，即完成花药和花粉的收集。花粉与花药的体积占离心管容积的1/3，将四份离心管分别置于室温(20℃)、4℃、-20℃、-80℃保存条件下储存，于5d、10d、30d、50d、70d、90d、120d、180d后测定各个保存条件下的花粉萌发率。
(3)花粉的解冻和授粉：香水莲花花粉在使用时，从离心管中取出花药和花粉后先置于室温下自然解冻30min后用于授粉。授粉方法为：在母本花朵开放第一天，柱头分泌大量黏液时，用注射器吸取母本的柱头液注入保存花药和花粉的离心管内，注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1,盖上盖子上下摇动，使柱头液和花粉混合均匀，然后用注射器吸取1～4mL离心管中混有花粉的柱头液，注入套袋的母本柱头上，再重新套袋隔离，即完成授粉。
花粉活力测定：本研究采用固体培养基萌发法培养花粉，培养基的组分为0.001％硼酸、5％蔗糖和1％的琼脂。取待测花粉播于培养基上，置于30℃遮光培养箱中培养12h后，于显微镜下观察统计花粉的发芽率，每处理重复3次。统计时，萌发标准是花粉管长度≥花粉粒的直径。每张凹玻片在显微镜下观察5个视野，每个视野内花粉数应大于100。花粉萌发率＝(已萌发的花粉数目/观测花粉总数)×100％。结果如图1所示。
由图1可以看出，‘黄花型’香水莲花在不同保存条件下花粉萌发率差异显著，保存温度越低，花粉的保存寿命越长。‘黄花型’香水莲花保存能力的排序均为：室温<4℃<-20℃<-80℃，室温条件下‘黄花型’香水莲花花粉保存5d即失去活力，4℃条件下保存30d时花粉萌发率从58.31％下降为28.47％，50d后仅为7.68％；-20℃条件下保存180d后花粉萌发率仍为34.04％，而-80℃条件下保存180d后，‘黄花型’香水莲花花粉活力仍达44.66％。
由此我们推断，4℃适于‘黄花型’香水莲花花粉的短期保存(30d左右)，-20℃、-80℃的低温条件适于‘黄花型’香水莲花花粉的长期保存，且-80℃是‘黄花型’香水莲花花粉的最佳保存温度。
实施例2
以‘紫花型’香水莲花为例
(1)花药和花粉的预处理：在大蕾期采集香水莲花花朵，将香水莲花的花药取出，拨成单层花药均匀摊开在硫酸纸或羊皮纸上，花药和花粉平铺的厚度为0.4cm，然后将单层花药和散落的花粉置于规格为45cm*40cm*20cm的方形抽屉内遮光干燥23h，利用外部空调保证方形抽屉中的干燥的环境为室温22～28℃，相对湿度60％～70％。干燥后‘紫花型’香水莲花花药和花粉含水量为4.5％；所述的方形抽屉内平铺有硅胶变色干燥剂，硅胶变色干燥剂平铺的厚度为2cm，其置于硫酸纸或羊皮纸的下方，当硅胶变色干燥剂由蓝色变为粉色或粉红色时应及时更换。
(2)花药和花粉的保存：‘紫花型’香水莲花花药和花粉经步骤(1)处理后，将花粉和花药分成四份，分别收集并装入10mL离心管中，装入的操作方式是先将沾有花粉的花药用镊子轻轻的夹入离心管中；花药收集完后，轻轻倾斜纸张四角，使剩余花粉汇聚在纸张中央，然后将纸张沿着一角轻轻对折，缓慢倾斜至45°，并轻轻抖动，使花粉滑落至离心管内，即完成花药和花粉的收集。花粉与花药的体积占离心管容积的1/2，将四份离心管分别置于室温(20℃)、4℃、-20℃、-80℃保存条件下储存，于5d、10d、30d、50d、70d、90d、120d、180d后测定各个保存条件下的花粉萌发率。
(3)花粉的解冻和授粉：香水莲花花粉在使用时，从离心管中取出花药和花粉后先置于室温下自然解冻30min后用于授粉。授粉方法为：在母本花朵开放第一天，柱头分泌大量黏液时，用注射器吸取母本的柱头液注入保存花药和花粉的离心管内，注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1,盖上盖子上下摇动，使柱头液和花粉混合均匀，然后用注射器吸取1～4mL离心管中混有花粉的柱头液，注入套袋的母本柱头上，再重新套袋隔离，即完成授粉。
花粉活力测定：本研究采用固体培养基萌发法培养花粉，培养基的组分为0.001％硼酸、5％蔗糖和1％的琼脂。取待测花粉播于培养基上，置于30℃遮光培养箱中培养12h后，于显微镜下观察统计花粉的发芽率，每处理重复3次。统计时，萌发标准是花粉管长度≥花粉粒的直径。每张凹玻片在显微镜下观察5个视野，每个视野内花粉数应大于100。花粉萌发率＝(已萌发的花粉数目/观测花粉总数)×100％。结果如图2所示。
由图2可以看出，‘紫花型’香水莲花在不同保存条件下花粉萌发率差异显著，保存温度越低，花粉的保存寿命越长。‘紫花型’香水莲花保存能力的排序均为：室温<4℃<-20℃<-80℃，室温条件下保存5d后，花粉活力仅为0.90％，保存10d后即失去活力；4℃条件下保存30d时花粉萌发率从46.88％下降为19.87％，50d后即下降为0；-20℃条件下保存180d后花粉萌发率仍为28.28％，而-80℃条件下保存180d后，‘紫花型’香水莲花花粉活力仍达38.48％。
由此我们推断，4℃适于‘紫花型’香水莲花花粉的短期保存(30d左右)，-20℃、-80℃的低温条件适于‘紫花型’香水莲花花粉的长期保存，且-80℃是‘紫花型’香水莲花花粉的最佳保存温度。
实施例3
以‘粉花型’香水莲花为例
(1)花药和花粉的预处理：在大蕾期采集香水莲花花朵，将香水莲花的花药取出，拨成单层花药均匀摊开在硫酸纸或羊皮纸上，花药和花粉平铺的厚度为1cm，然后将单层花药和散落的花粉置于规格为45cm*40cm*20cm的方形抽屉内遮光干燥24h，利用外部空调保证方形抽屉中的干燥的环境为室温22～28℃，相对湿度60％～70％。干燥后‘粉花型’香水莲花花药和花粉含水量为5％；所述的方形抽屉内平铺有硅胶变色干燥剂，硅胶变色干燥剂平铺的厚度为2.5cm，其置于硫酸纸或羊皮纸的下方，当硅胶变色干燥剂由蓝色变为粉色或粉红色时应及时更换。
(2)花药和花粉的保存：‘粉花型’香水莲花花药和花粉经步骤(1)处理后，将花粉和花药分成四份，分别收集并装入30mL离心管中，装入的操作方式是先将沾有花粉的花药用镊子轻轻的夹入离心管中；花药收集完后，轻轻倾斜纸张四角，使剩余花粉汇聚在纸张中央，然后将纸张沿着一角轻轻对折，缓慢倾斜至45°，并轻轻抖动，使花粉滑落至离心管内，即完成花药和花粉的收集。花粉与花药的体积占离心管容积的2/3，将四份离心管分别置于室温(20℃)、4℃、-20℃、-80℃保存条件下储存，于5d、10d、30d、50d、70d、90d、120d、180d后测定各个保存条件下的花粉萌发率。
(3)花粉的解冻和授粉：香水莲花花粉在使用时，从离心管中取出花药和花粉后先置于室温下自然解冻30min后用于授粉。授粉方法为：在母本花朵开放第一天，柱头分泌大量黏液时，用注射器吸取母本的柱头液注入保存花药和花粉的离心管内，注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1,盖上盖子上下摇动，使柱头液和花粉混合均匀，然后用注射器吸取1～4mL离心管中混有花粉的柱头液，注入套袋的母本柱头上，再重新套袋隔离，即完成授粉。
花粉活力测定：本研究采用固体培养基萌发法培养花粉，培养基的组分为0.001％硼酸、5％蔗糖和1％的琼脂。取待测花粉播于培养基上，置于30℃遮光培养箱中培养12h后，于显微镜下观察统计花粉的发芽率，每处理重复3次。统计时，萌发标准是花粉管长度≥花粉粒的直径。每张凹玻片在显微镜下观察5个视野，每个视野内花粉数应大于100。花粉萌发率＝(已萌发的花粉数目/观测花粉总数)×100％。结果如图1所示。
由图3可以看出，‘粉花型’香水莲花在不同保存条件下花粉萌发率差异显著，保存温度越低，花粉的保存寿命越长。‘粉花型’香水莲花保存能力的排序均为：室温<4℃<-20℃<-80℃，室温条件下保存5d后，花粉即失去活力；4℃条件下保存30d时花粉萌发率从54.11％下降为21.33％，50d后即下降为0；-20℃条件下保存180d后花粉萌发率仍为30.51％，而-80℃条件下保存180d后，‘粉花型’香水莲花花粉活力仍达41.36％。
由此我们推断，4℃适于‘粉花型’香水莲花花粉的短期保存(30d左右)，-20℃、-80℃的低温条件适于‘粉花型’香水莲花花粉的长期保存，且-80℃是‘粉花型’香水莲花花粉的最佳保存温度。
Claims (9)
1.一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)花药和花粉的预处理：在大蕾期采集香水莲花花朵，将香水莲花的花药取出，拨成单层花药均匀摊开在硫酸纸或羊皮纸上，然后将单层花药和散落的花粉置于密闭容器内遮光干燥20～24h，使花药和花粉含水量保持在4.5％-6.5％；
(2)花药和花粉的保存：香水莲花花药和花粉经步骤(1)处理后，将花粉和花药收集并装入离心管中，置于4℃或-20℃或-80℃中保存；
(3)花药和花粉的解冻和授粉：香水莲花花粉在使用时，从离心管中取出花药和花粉后先置于室温下自然解冻30min后用于授粉。
2.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的密闭容器内平铺有干燥剂，所述的干燥剂平铺的厚度为2cm～3cm，所述的干燥剂置于硫酸纸或羊皮纸的下方，所述的干燥剂为硅胶变色干燥剂。
3.根据权利要求2所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于，所述的硅胶变色干燥剂由蓝色变为粉色或粉红色时应及时更换。
4.根据权利要求1所述一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的花药和花粉平铺的厚度不超过1cm。
5.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的密闭容器内的干燥的环境为室温22～28℃，相对湿度60％～70％。
6.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的花药和花粉的收集并装入离心管的具体操作流程是：先将沾有花粉的花药用镊子轻轻的夹入离心管中；花药收集完后，轻轻倾斜纸张四角，使剩余花粉汇聚在纸张中央，然后将纸张沿着一角轻轻对折，缓慢倾斜至45°，并轻轻抖动，使花粉滑落至离心管内，即完成花药和花粉的收集。
7.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的离心管为10mL～50mL的塑料离心管，所述花药与花粉的体积不超过离心管容积的2/3。
8.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的花药和花粉若在1个月内使用，就将收集好的花药和花粉置于4℃的冰箱内保存；花药和花粉若在1个月之后使用，就将收集好的花药和花粉置于-80℃或-20℃的冷冻室内。
9.根据权利要求1所述的一种高效收集并保存香水莲花花药和花粉的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的花药和花粉的授粉方法为：在母本花朵开放第一天，柱头分泌大量黏液时，用注射器吸取母本的柱头液注入保存花药和花粉的离心管内，注入的柱头液与保存的花药和花粉的体积比为3～5：1,盖上盖子上下摇动，使柱头液和花粉混合均匀，然后用注射器吸取1～4mL离心管中混有花粉的柱头液，注入套袋的母本柱头上，再重新套袋隔离，即完成授粉。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190628 |
|
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