CN109932511A - 用于肝癌筛查的尿液外泌体磷脂标志物及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尿液外秘体磷脂标志物在制备诊断肝癌患者试剂盒中的应用，所述磷脂标志物是[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+，这些磷脂成分可作为诊断肝癌的有效生物标志物，在代谢组学上为肝癌的辅助诊断提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体四种磷脂标志物在诊断肝癌患者中的应用，以及制备相应的检测试剂盒中的应用。
背景技术
肝癌是临床上常见且致死率高的一类肿瘤，严重威胁着人类的健康，早期诊断及治疗是提高患者生存率、改善生活质量的重要手段。目前肝癌的诊断主要依赖于血液检查、影像学和活组织检查，然而，这些方法对于检测肝脏内的小癌症病变并不理想且方法有创，患者依从性不高，虽然肿瘤标志物作为早期诊断方便快捷，但作为肝癌的诊断标志物之一的血液中的甲胎蛋白(AFP)的检测灵敏度并不高。
尿液是临床上常见的标本类型，以其取材简便、无创、易行等优点受到临床医生及科研人员的关注。尿液中排泄出的小分子物质是机体代谢作用的最终结果。对尿液标本中的代谢物进行检测可以更直接、准确地反映一段时间内机体的生理及病理情况。同时对尿液的检测更利于一些在体内快速消除而又很难在血液中被检测到的小分子代谢产物，且对全身多个脏器的病变都有着不可忽视的诊断作用。
外泌体是由磷脂双分子层封闭组成不同大小的囊状小泡，从细胞表面脱落或者细胞向外分泌释放。直径大约为30nm-150nm，可以从正常细胞和病变细胞(如肿瘤细胞)释放到血液、唾液、脑脊液、胃液、尿液、羊水和母乳等体液中。外泌体属于细胞外囊泡中的一种形式，也是近年来最受到关注一种形式；另外还有细胞膜微粒、调亡小体两种形式；其最初在20世纪80年代被发现，当时被认为是丢弃的膜蛋白，其生物学意义在很大程度上被人们忽视。随着近几年研究的深入，囊泡的成分和生物功能也越来越被人们发现和认可。研究表明，外泌体可通过运输蛋白质、脂质及核酸来调控机体内细胞间的通讯，进而影响多种病理生理过程。但目前并未有利用尿液外泌体研究相关肝癌标志物的报道，因此，鉴定出对肝癌的早期诊断和预后有用的灵敏度高、特异性好的“理想”的标志物是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的区分正常人与肝癌患者的方法，本发明人发现，尿液外泌体一些特定的磷脂成分能有效诊断肝癌，尤其是肝细胞癌，这些磷脂成分可作为诊断肝癌的有效生物标志物，在代谢组学上为肝癌的辅助诊断提供了新的方向。
本发明的一个方面在于，提供了尿液外泌体磷脂标志物[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+中的至少两种用于制备诊断肝癌试剂盒中的用途。
本发明的另一个方面在于：提供了诊断受试者是否患有肝癌的方法，该方法包括至少两个步骤：(a)测定怀疑患有肝癌的受试者的尿液样品中外泌体[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度；和(b)根据[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度，评估该受试者是否患有肝癌。
作为本发明优选的实施方案，所述评估包括将所测定的[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+相对丰度与已知未患有肝癌的受试者中[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度或预确定的阈值进行比较，所测定的相对丰度增加或减少指示该受试者患有肝癌。
作为本发明优选的实施方案，所述测定的相对丰度增加或减少是指[SM(18:1/18:0)+Na]+的相对丰度增加，[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度减少。
作为本发明优选的实施方案，所述已知未患有肝癌的受试者是指肝功能正常，排除肝脏疾病及其他器质性疾病的受试者。
作为本发明优选的实施方案，所述尿液是晨尿。
作为本发明优选的实施方案，所述晨尿是排除对磷脂成分检测有影响的乳糜尿液标本。
作为本发明优选的实施方案，所述肝癌为肝细胞癌。
本发明的另一个方面，提供了所述尿液样品中外泌体的提取方法：收集晨尿标本，利用差速离心法结合试剂法提取尿液中的外泌体。
作为优选的实施方案，所述差速离心法结合试剂法是依次利用500g、2000g和16000g差速离心尿液样本，16000g离心后的底部沉渣中加入200mg/ml二硫苏糖醇(DTT)溶液以提高外泌体产量，上清液浓缩至15ml，后加入1/5尿液体积的外泌体提取试剂。该方法能较快速地提取浓度与纯度均符合要求的尿液中的外泌体，为后续的诊断工作提供合格的样本。
本发明具有的有益效果为：
本发明将尿液外泌体磷脂标志物[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+中的至少两种用于诊断肝癌尤其是肝细胞癌，具有较高的灵敏度和特异性，作为新的肝癌标志物，可提高肝癌的早期诊断水平，以更简单、准确的方法预测肝癌的发生，具有较高的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中尿液外泌体磷脂代谢检测的流程示意图；
图2为本发明实施例1中差速离心法结合试剂法提取外泌体的透射电镜图；
图3为本发明实施例1中差速离心法结合试剂法提取外泌体的粒径分析图；
图4为本发明实施例1中差速离心法结合试剂法提取外泌体的免疫印记实验图；
图5为本发明实施例1中电喷雾萃取电离质谱装置图；
图6为本发明实施例1中肝癌组与正常对照组尿液外泌体的电喷雾电离质谱分析的一级质谱指纹图；
图7为本发明实施例1中肝癌组与正常对照组尿液外泌体的电喷雾电离质谱分析的主成分区分图；
图8为本发明实施例1中肝癌组与正常对照组尿液外泌体的电喷雾电离质谱分析的差异磷脂质谱峰图。
图9为本发明实施例1中肝癌组与正常对照组尿液外泌体的电喷雾电离质谱分析的差异磷脂成分分子式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。
实施例1
一、诊断标志物的筛选
1、外泌体的提取：
差速离心法结合试剂法：4℃500g离心尿液样品10min，取上清液以2000g离心20min，去除底部沉淀物，然后继续以16000g离心上清液20min，收集上清液，底部沉渣待用；在前一步骤的沉渣中加入二硫苏糖醇溶液(200mg/ml)，然后在37℃水浴中加热10min(每2min涡旋混合，直至颗粒溶解)，然后以17000g离心10min，收集上清液供后续使用；将前两步得到的上清液一起取出，转移到离心超滤管(Amicon ultra-15)中，浓缩至15ml；最后加入外泌体提取试剂(1/5尿液体积)至浓缩尿液中，4℃过夜，然后以10000g离心30min，除去上清液，沉淀加入磷酸缓冲盐溶液100μl重悬。-80℃保存备用。
2、外泌体的鉴定：
根据国际外囊泡协会发表的指导手册(MISEV)，通过电子显微镜观测外泌体的形态特征(图2)，呈现典型的盘状囊泡状，具有双层囊膜超微结构；通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)等手段来观测外泌体的粒子直径(图3)，处于60-100nm之间；以及免疫印迹试验(Western blot)方法来检测外泌体表面标志蛋白Alix、TSG101蛋白(图4)，证实提取的外泌体浓度与纯度均达到要求。
3、电喷雾萃取电离质谱分析：
质谱分析均在东华理工大学江西省质谱与仪器重点实验室进行。如图5所示的电喷雾萃取电离质谱的装置图，待分析溶液被气动雾化为中性样品雾滴，并且与所产生的初级带电萃取剂雾滴试剂发生碰撞及液-液微萃取。萃取剂为甲醇/蒸馏水/乙酸(v/v/v，1/1/0.02)萃取剂与样本均以4μl/min的流速注入；设置LTQ-MS为正离子检测模式(+4.0kv)，扫描范围为m/z 700-900；氮气流速为1.0MPa，离子传输管温度为150℃；其他参数由LTQ-MS系统自动优化，以纯萃取剂进样为背景，所有图谱均需扣除背景信号。
4、质谱数据的处理及分析
质谱数据使用Matlab软件(R2015a 64位)进行主成分分析，以此评估肝癌样本与健康对照样本之间的差异。使用Matlab将化学指纹谱数据(见图6)导出到excel中以进行进一步处理。选择princomp函数以执行数据主成分分析(见图7、图8)；将得到的差异质谱峰进行二级质谱分析，通过碰撞诱导解离的方法将特征碎片离子放到人类代谢组数据库(LipidomicsGateway)中进行查找，并与标准品进行比较，以鉴定和确认差异的磷脂成分。
5、两组样本间差异磷脂结果
通过上述分析，结果显示，肝癌组与正常对照组尿液外泌体的差异磷脂成分主要有4种，分别为：[SM(18:1/18:0)+Na]+(m/z754)，[PC(18:1/18:1)+H]+(m/z787)，[PC(20:4/18:0)+Na]+(m/z832)，[PC(20:4/20:0)+K]+(m/z 877)，如图9所示，其中一种为鞘磷脂、三种为磷脂酰胆碱。
二、病例资料
本实施例分别收集2017年9月至2017年12月临床已被诊断为肝细胞癌以及正常对照各5例，分别收集400ml的晨尿(排除含有磷脂类成分的乳糜尿)，分别作为肝癌组及正常对照组用于后续实验操作。10例样本均来自南昌大学第二附属医院，排除其他肿瘤、肾脏疾病、内分泌及消耗性疾病、自身免疫性疾病，并经南昌大学第二附属医院病理报告结果证实病情，所有晨尿标本的收集均在干预治疗前。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。
1、分组设计
肝癌组(5例)与正常对照组(5例)；为减少试验误差，每例样本进行6次重复试验。
三、主要仪器与试验耗材
| 仪器/试剂名称 | 生产厂家 |
| 电喷雾萃取电离质谱离子源 | 南昌东华理工大学自主研制 |
| LTQ-XL型线性离子阱质谱仪 | 美国Thermo Electron公司 |
| 低温高速离心机 | 美国Thermo Fisher Scientific公司 |
| 甲醇 | 美国ROE Scientific Inc.公司 |
| 乙酸 | 美国ROE Scientific Inc.公司 |
| 离心式超滤管 | 美国Millipore公司 |
| 二硫苏糖醇 | 中国上海Aladdin公司 |
| 外泌体提取试剂 | 南昌惠肽生物科技有限公司 |
四、实验结果
1、尿液外泌体的鉴定
根据国际外囊泡协会发表的指导手册(MISEV)，通过电子显微镜观测外泌体的形态特征(图2)，呈现典型的盘状囊泡状，具有双层囊膜超微结构；通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)等手段来观测外泌体的粒子直径(图3)，处于30-1000nm之间；以及免疫印迹试验(Western blot)方法来检测外泌体表面标志蛋白Alix、TSG101蛋白(图4)，证实提取的外泌体浓度与纯度均达到要求。
2、尿液外泌体的电喷雾萃取电离质谱指纹图谱
选择质谱仪扫描范围为m/z 700-900(磷脂成分质谱峰主要所在范围)，通过电喷雾萃取电离质谱分析两组的尿液外泌体中磷脂的结果如图6所示。电喷雾萃取电离质谱分析外泌体中的磷脂可以获得丰富的信息，并且正常人尿液外泌体中磷脂的电喷雾萃取电离质谱表征与肝癌患者不同，见图6；在肝癌患者尿液外泌体的磷脂质谱中，最强的质谱峰是m/z 738、m/z754、m/z 803，而在正常人尿液外泌体的磷脂质谱，最强的质谱峰是m/z 787、m/z 832、m/z 877。
3、区分并确定差异质谱峰
为了更直观地体现和描述肝癌患者和正常人尿液外泌体磷脂的差异，在外泌体磷脂的质谱结果数据上进行了主成分分析，主成分分析评分结果的3D图所示(图7)，正常人和肝癌患者的样本通过电喷雾萃取电离质谱检测和通过主成分分析方法进行了很好的区分，并且筛选出差异信号。在主成分分析结果(图8)中，可以初步识别电喷雾萃取电离质谱获得的目标离子，这些离子对区分不同标本来源的外泌体磷脂有着显著贡献，得到目标质谱峰m/z 754、m/z 787、m/z 832和m/z 877。
4、碰撞诱导解离试验确定差异磷脂
对于4种目标离子的定性分析，是通过碰撞诱导解离方法将特征碎片离子放到人类代谢组数据库(LipidomicsGateway)中进行查找，并与标准品进行比较，以鉴定和确认目标磷脂分子。如图9所示，确定目标质谱峰m/z 754、m/z 787、m/z 832、m/z877的准分子离子分别为SM(18:1/18:0)，PC(18:1/18:1)，PC(20:4/18:0)，PC(20:4/20:0)分别与氢离子，钠离子或钾离子结合。其中一种为鞘磷脂，3种为磷脂酰胆碱。
实施例2
诊断试剂盒
一种用于早期预示肝癌的诊断试剂盒，该试剂盒包括成分：
磷脂标志物的标准品：包括[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+，各标准品分别封装。
当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述四种标志物的标准品，可以仅适用其中的两种或三种进行组合，这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。
该试剂盒是基于本发明提供的磷脂标志物而设计的，可以用于辅助诊断肝癌患者。
Claims (10)
1.尿液外泌体磷脂标志物[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+中的至少两种用于制备诊断肝癌试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述诊断包括以下步骤：
(a)测定怀疑患有肝癌的受试者的尿液样品中外泌体[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度；和
(b)根据[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度，评估该受试者是否患有肝癌。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述评估包括将所测定的[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+相对丰度与已知未患有肝癌的受试者中[SM(18:1/18:0)+Na]+、[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度或预确定的阈值进行比较，所测定的相对丰度增加或减少指示该受试者患有肝癌。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述测定的相对丰度增加或减少是指[SM(18:1/18:0)+Na]+的相对丰度增加，[PC(18:1/18:1)+H]+、[PC(20:4/18:0)+Na]+和[PC(20:4/20:0)+K]+的相对丰度减少。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述已知未患有肝癌的受试者是指肝功能正常，排除肝脏疾病及其他器质性疾病的受试者。
6.根据权利要求1和2中任一项所述的用途，其中所述尿液是晨尿。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述晨尿是排除对磷脂成分检测有影响的乳糜尿液标本。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述肝癌为肝细胞癌。
9.根据权利要求1和2中任一项所述的用途，其中所述尿液样品中外泌体的获得方法为：收集晨尿标本，利用差速离心法结合试剂法提取尿液中的外泌体。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述差速离心法结合试剂法是依次利用500g、2000g和16000g差速离心尿液样本，16000g离心后的底部沉渣中加入200mg/ml二硫苏糖醇(DTT)溶液以提高外泌体产量，上清液浓缩至15ml，后加入1/5尿液体积的外泌体提取试剂。
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