CN109917050B

CN109917050B - 一种饲料中匹美西林残留量的测定方法

Info

Publication number: CN109917050B
Application number: CN201910321584.5A
Authority: CN
Inventors: 宋薇; 阎玉林; 李冬晓
Original assignee: QINGDAO PONY TEST CO Ltd
Current assignee: QINGDAO PONY TEST CO Ltd
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2022-01-18
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN109917050A

Abstract

本方法公开了一种饲料中匹美西林残留量的测定方法，属于分析检测领域，特别涉及一种使用液相色谱‑串联质谱法测定饲料中匹美西林残留量的高灵敏度检测方法。具体步骤如下：取一定量的样品，加磷酸缓冲盐提取，过PEP固相萃取柱净化，洗脱液过滤膜并上机分析，外标法定量。本发明适用于饲料中匹美西林残留量的测定，方法操作简单，快捷，灵敏度高，定量准确，回收率高的特点。

Description

一种饲料中匹美西林残留量的测定方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，涉及一种饲料中匹美西林残留量的测定方法，特别涉及一种使用液相色谱-串联质谱法测定饲料中匹美西林的高灵敏度检测方法。

背景技术

匹美西林，是人用杀菌剂，主要是用于大肠杆菌、沙门氏菌、肠杆菌属等敏感微生物引起的单纯性或复合性泌尿道感染，以及由此引起的败血症。随着兽药禁用的越来越多，部分不良商人将人用药用于治疗动物疾病，这不仅会导致人畜共患病的频发，而且随着该类药物的大量使用，最终以原药或者其代谢物的形式由粪便排到环境之中，不仅会污染环境，而且也可造成细菌的耐药性，危害人体的健康。

目前关于匹美西林的检测方法的研究较少，我们还未发现饲料中检测匹美西林的测定方法，因此，开发一个测定饲料中匹美西林残留量的方法，对于打击违法用药，减少人畜共患病的发生，保护消费者权益，具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种饲料中匹美西林残留量的测定方法。

本发明所述的技术问题可通过以下技术方案得以解决：

（1）样品的前处理

取代表性样品约5.0 g (精确至0.01g)，于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL磷酸缓冲盐溶液，混匀，振荡提取10 min，8000 r/min冷冻离心5 min，收集上清液于另一个50 mL离心管中。残渣另加入10 mL磷酸缓冲盐溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。

（2）固相萃取柱净化

依次用5 mL甲醇和等体积的一级水活化固相萃取柱，将（1）中上清液过固相萃取柱，控制样液流速1-4 mL/min，不要超过5 mL/min流速；然后用5 mL一级水淋洗；再用3 mL0.5 %甲酸乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过0.22 μm有机滤膜，上机供液相色谱-串联质谱仪测定。

（3）液相色谱-串联质谱测定

建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液，采用外标-标准曲线法进行定性定量分析。

作为优选，在步骤（1）中所述加入的磷酸缓冲盐溶液为pH=8.5的0.15 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液。

作为优选，在步骤（2）所述的固相萃取柱为PEP柱，规格型号为100 mg/5 mL。

作为优选，在步骤（2）中所述所述的0.5%甲酸乙腈溶液体积比为4：6。

作为优选，在步骤（3）所述所述液相条件为：色谱柱：BEH C₁₈柱，2.1×50 mm，1.8 μm；流动相为甲醇和0.1%甲酸，梯度洗脱，0~1 min，10 %甲醇；1~2 min，10 %~40 %甲醇；2~2.5 min，40 %~95 %甲醇；2.5~3 min，95 %~95 %甲醇；3~4 min，10 %甲醇；进样量为5 μL，流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃。

作为优选，在步骤（3）所述所述质谱条件为：离子源：ESI；扫描方式：正离子；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2400 V；干燥气流速：800 L/h；干燥气温度：500 ℃；匹美西林的定量离子对为m/z =440.17/167.20，定性离子对为m/z = 440.17/139.18，碰撞能量分别为40 eV和25 eV。

本发明的有益效果在于：

本发明建立了液相色谱-串联质谱技术检测饲料中匹美西林残留量的方法，填补了没有匹美西林检测方法的空白，对于打击违法用药，保护消费者权益，维护人们身体健康具有重要的指导作用；该方法，具有灵敏度高，重现性好的特点。对于控制兽药合理规范的使用，加强监管，提供了必要的检测技术支持。

附图说明

图1. 20 μg/L的匹美西林标准品在液相色谱-串联质谱仪的总离子流（TIC）色谱图；

图2. 匹美西林标准工作曲线；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。

实施例1 鸡配合饲料中匹美西林残留量的测定

（1）样品的前处理

取代表性样品约5.0 g (精确至0.01g)，于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL磷酸二氢钠缓冲溶液，混匀，振荡提取10 min，8000 r/min冷冻离心5 min，收集上清液于另一个50 mL离心管中。残渣另加入10 mL磷酸缓冲盐溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。

（2）固相萃取柱净化

依次用5 mL甲醇和等体积的一级水活化固相萃取柱，将（1）中上清液过PEP净化柱，控制样液流速1-4 mL/min，不要超过5 mL/min流速；然后用5 mL一级水淋洗；再用3 mL0.5 %甲酸乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过0.22 μm有机滤膜，上机供液相色谱-串联质谱仪测定。

（3）液相色谱-串联质谱测定

建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液，采用外标-标准曲线法进行定性定量分析。液相条件为：色谱柱：BEH C₁₈柱，2.1×50 mm，1.8 μm；流动相为乙腈和0.1%甲酸，梯度洗脱，0~1 min，10 %甲醇；1~2 min，10 %~40 %甲醇；2~2.5 min，40 %~95 %甲醇；2.5~3 min，95 %~95 %甲醇；3~4 min，10 %甲醇；进样量为5 μL，流速为0.3mL/min，柱温为40 ℃。质谱条件为：离子源：ESI；扫描方式：正离子；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2400 V；干燥气流速：800 L/h；干燥气温度：500 ℃；匹美西林的定量离子对为m/z =440.17/167.20，定性离子对为m/z = 440.17/139.18，碰撞能量分别为40 eV和25eV。

（4）定性测定：按照上述液相条件和质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检出的色谱峰保留时间与标准品一致，且目标化合物的离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差应在合理的范围之内，可以判定为同一种物质。

（5）线性关系：将标准储备液逐级稀释，制备5个不同浓度的系列工作液，分别为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L和100μg/L。按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件和质谱条件测定。按其标准溶液浓度 X与对应的峰面积Y作标准曲线图，计算回归方程和相关系数，回归方程为Y=8080X+9684.3，相关系数为R²=0.9983，说明线性良好。

（6）准确度和精密度：准确称取阴性鸡配合饲料样品，添加3个不同含量水平的匹美西林标准溶液,每个浓度进行6个平行样品测定，依照上述色谱条件和质谱条件进行分析，准确度用回收率表示，精密度用相对标准偏差表示。准确度和精密度计算结果见表1。

表1 鸡配合饲料添加匹美西林准确度和精密度的试验结果

通过表1可以看出，本发明方法的准确度在90%-100%之间，精密度在5%以下。说明该方法准确度高，且重现性好。

（7）检出限和定量限：以空白饲料样品进行添加试验，方法检出限以信噪比≥3估算；定量限的确定依据是样品的实际加标回收率70%～120%之间，信噪比≥10，相对标准偏差≤15%，最终确定检出限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。

Claims

1.一种饲料中匹美西林残留量的测定方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）样品提取

取代表性样品5.0g，于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL pH=8.5的0.15 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液，混匀，振荡提取10 min，8000 r/min冷冻离心5 min，收集上清液于另一个50 mL离心管中，残渣另加入10 mLpH=8.5的0.15 mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化；

（2）PEP固相萃取柱净化

依次用5 mL甲醇和等体积的一级水活化PEP固相萃取柱，将（1）中上清液过PEP固相萃取柱，控制样液流速1-4 mL/min，不要超过5 mL/min流速；然后用5 mL一级水淋洗；再用3mL 0.5 %甲酸乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液过0.22 μm有机滤膜，上机供液相色谱-串联质谱仪测定；

（3）利用超高效液相色谱-串联质谱仪对标准溶液和待测液进行检测，液相条件：色谱柱：BEH C₁₈柱，2.1×50 mm，1.8 μm；流动相为甲醇和0.1%甲酸，梯度洗脱，0~1 min，10 %甲醇；1~2 min，10 %~40 %甲醇；2~2.5 min，40 %~95 %甲醇；2.5~3 min，95 %~95 %甲醇；3~4min，10 %甲醇；进样量为5 μL，流速为0.3 mL/min，柱温为40 ℃；质谱条件：离子源：ESI；扫描方式：正离子；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：2400 V；干燥气流速：800 L/h；干燥气温度：500 ℃；匹美西林的定量离子对为m/z =440.17/167.20，定性离子对为m/z =440.17/139.18，碰撞能量分别为40 eV和25 eV；依据定性定量离子对目标物进行分析，采用外标标准曲线法进行定量分析。