CN109406643A - 一种饲料中二氢吡啶的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种饲料中二氢吡啶的测定方法，包括以下步骤：称取粉碎均匀的饲料样品，加入有机溶液提取两遍，合并上清液；经过固相萃取柱净化后，洗脱液收集并定容到一定体积，直接上液相色谱‑质谱/质谱仪进行测定。本方法弥补了目前没有饲料中二氢吡啶检测方法，且操作简单方便、灵敏度高、回收率高，定性定量准确等特点，能满足兽药检测的需求。
Description
技术领域：
本发明属于饲料技术领域，具体涉及一种通过高效液相色谱串联质谱仪测定饲料中的二氢吡啶的方法。
背景技术：
二氢吡啶，淡黄色粉末或针状结晶，无毒，无味，遇光变色，易氧化，能溶于热乙醇，微溶于水。是农业部首次批准在我国使用的兽药类促生长添加剂，被列入农业部《兽药质量标准》2003年版中。
据报道二氢吡啶是一种新型绿色多功能的饲料添加剂，具有促进动物生长、改善皮毛质量、提高瘦肉率、提高繁殖性能及防病抗病等广泛的生物学功能。同时报道称二氢吡啶通过胃肠吸收，97％～99％随排泄物中排除，在其它器官和组织中很少存留，对动物不产生突变和胚胎中毒等优点。
虽然二氢吡啶在具有多种功能，但是其使用量是受到限制的，在《兽药国家标准》2017年版中规定每1000kg饲料中，牛允许使用量为100g-150g，种肉鸡为150g，牛和肉鸡的休药期均为7天，弃奶期为7天。在2017年 315晚会中曝光了一些饲料企业为了追求利益最大化，大量添加促生长药物，其中就包括二氢吡啶，但是目前还没有测定饲料中二氢吡啶的方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种测定饲料中二氢吡啶的方法，弥补目前没有二氢吡啶检测方法的情况。本发明通过高效液相色谱串联质谱法测定饲料中的二氢吡啶含量，该方法操作简单方便、灵敏度高、回收率高，定性定量准确等特点，能满足兽药检测的需求。
为实现上述目的，本发明采取以下检测步骤包括：
1、样品提取：
准确称取粉碎均匀的饲料样品2.0g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入10mL有机溶液，于旋涡混合器上涡旋1min，超声提取 10min，6000转/min离心5min，收集上清液于另一个50mL离心管中。残渣另加入10mL有机溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。
2、固相萃取柱净化
取部分上清液用水稀释一定的倍数，将稀释液全部过固相萃取柱净化，用水淋洗，吹干，并用3mL有机洗脱液进行洗脱，用水定容至5mL，过 0.22μm有机滤膜，转移至进样小瓶，形成待测液待测。
3、液相色谱串联质谱测定
建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液。通过保留时间和离子丰度比进行定性分析，采用外标标准曲线法进行定量分析。
作为优选，在步骤1中所述有机溶液为40％乙醇溶液。
作为优选，在步骤2中所述稀释一定的倍数，原则是将乙醇溶液稀释到10％一下，如取2mL上清液，定容至10mL。
作为优选，在步骤2中所述固相萃取柱为Thermo PEP固相萃取柱，规格为500mg/6mL(先用甲醇、水各5mL活化再使用)。
作为优选，在步骤2中所述有机洗脱液为乙腈。
作为优选，在步骤3中所述液相分析条件为：
a)色谱柱：BEH C18柱，2.1×50mm，1.7μm；
b)流动相A：甲醇；流动相B：5mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液，梯度洗脱，详见下表1。
表1流动相梯度洗脱程序
c)柱温：40℃
d)流速：0.4mL/min
e)进样量：5μL
作为优选，在步骤3中所述质谱条件为：
a)离子源：电喷雾离子源
b)扫描方式：正离子扫描
c)检测方式：多反应监测(MRM)
d)毛细管电压：2400V
e)离子源温度：150℃
f)干燥气流速：800L/h
g)干燥气温度：500℃
h)监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2
表2监测离子对、锥孔电压和碰撞能量
注：*为定量离子对
按照上述液相条件和质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准品一致，且目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差应符合表3规定的范围。
表3定性确认时相对离子丰度比的最大允许偏差
| 相对离子丰度 | ＞50％ | ＞20％～50％ | ＞10％～20％ | ＜10％ |
| 允许相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
4、计算公式
按照下列公式计算二氢吡啶的含量
其中：
X：待测样品的含量(μg/kg)；
C：测试溶液的浓度(μg/L)；
V：测试溶液的定容体积(mL)；
m：称样量(g)；
本发明的优点是：采用本发明的方法检测饲料中的二氢吡啶的含量，简便快捷，避免了二氢吡啶因容易被氧化，导致在测定过程中出现较大的误差，定性定量准确，填补了目前无二氢吡啶检测方法的空白，经验证该方法的检出限可以达到0.01mg/kg，回收率在80％-100％范围，线性相关性和重复性良好。由此可见，本发明的方法为检测饲料中的二氢吡啶的含量，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足日常饲料中二氢吡啶的监控要求。
附图说明：
图1为二氢吡啶标准溶液的MRM质谱图；
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1鸭配合饲料中二氢吡啶的检测方法
1、样品提取：准确称取粉碎均匀的饲料样品2.0g(精确至0.01g)于50mL 聚丙烯塑料离心管中，加入10mL40％乙醇溶液，于旋涡混合器上涡旋1min，超声提取10min，6000转/min离心5min，收集上清液于另一个50mL离心管中。残渣另加入10mL40％乙醇溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。
2、固相萃取柱净化：取2mL上清液，用水定容至10mL，得稀释液，将稀释液全部过Thermo PEP固相萃取柱，用水淋洗，吹干，并用3mL乙腈进行洗脱，用水定容至5mL，过0.22μm有机滤膜，转移至进样小瓶，形成待测液待测。
3、液相色谱串联质谱测定
建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液。通过保留时间和离子丰度比进行定性分析，采用外标标准曲线法进行定量分析。
a)色谱柱：BEH C18柱，2.1×50mm，1.7μm；
b)流动相A：乙腈；流动相B：5mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液，梯度洗脱，详见下表1。
c)柱温：40℃
d)流速：0.4mL/min
e)进样量：5μL
4、质谱条件为：
a)离子源：电喷雾离子源
b)扫描方式：正离子扫描
c)检测方式：多反应监测(MRM)
d)毛细管电压：2400V
e)离子源温度：150℃
f)干燥气流速：800L/h
g)干燥气温度：500℃
h)监测离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2
5、线性关系：将标准储备液逐级稀释，制备六个不同浓度的系列工作液，分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L和10.0μg/L。按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件和质谱条件测定。按其标准溶液浓度X与对应的峰面积Y作标准曲线图，计算回归方程和相关系数，回归方程为Y＝8958.56X-300.989，相关系数为R2＝0.994，说明线性良好。
6、回收率和精密度：准确称取阴性饲料样品，添加3个不同含量水平的二氢吡啶标准溶液，每个浓度进行6个平行样品测定，依照上述色谱条件和质谱条件进行分析。回收率和精密度计算结果见表4。
表4鸭配合饲料中添加二氢吡啶回收率和精密度试验结果(n＝6)
7、检测低限：以饲料的空白样品进行添加试验，根据信噪比计算该方法的最低检出限(LOD)，经计算检出限为2.5μg/kg。
通过表4可以看出，本发明方法的准确度在80％-100％之间，精密度在 5％以下。说明该方法准确度高，且重现性好。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本发明权利要求的覆盖范围。
Claims (7)
1.一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)样品提取：准确称取粉碎均匀的饲料样品2.0g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入10mL有机溶液，于旋涡混合器上涡旋1min，超声提取10min，6000转/min离心5min，收集上清液于另一个50mL离心管中。残渣另加入10mL有机溶液，重复上述提取步骤，合并上清液，待净化。(2)固相萃取柱净化：取部分上清液用水稀释一定的倍数，将稀释液全部过固相萃取柱净化，用水淋洗，吹干，并用3mL有机洗脱液进行洗脱，用水定容至5mL，过0.22μm有机滤膜，转移至进样小瓶，形成待测液待测。(3)液相色谱串联质谱测定：建立液相条件和质谱条件，按照相应条件测定标准工作溶液和待测液，采用外标标准曲线法进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(1)所述有机溶液为40％乙醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(2)所述稀释一定的倍数，原则是将乙醇溶液稀释到10％一下。
4.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(2)所述所述固相萃取柱为Thermo PEP固相萃取柱。
5.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(2)所述所述有机洗脱液为乙腈。
6.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(3)所述所述液相条件为：
a)色谱柱：BEH C18柱，2.1×50mm，1.7μm
b)流动相为：乙腈和5mmol/L乙酸铵(含0.1％甲酸)水溶液，梯度洗脱程序
c)柱温：40℃
d)流速：0.4mL/min
e)进样量：5μL。
7.根据权利要求1所述的一种饲料中二氢吡啶的测定方法，其特征在于步骤(3)所述所述质谱条件为：
a)离子源：电喷雾离子源
b)扫描方式：正离子扫描
c)检测方式：多反应监测(MRM)
d)毛细管电压：2400V
e)离子源温度：150℃
f)干燥气流速：800L/h
g)干燥气温度：500℃。
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