CN109913383A - 用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂及其制备方法与应用。本发明从天然湿地底泥中采集筛选得到氨化细菌A1、亚硝化细菌株B1、硝化细菌C1、反硝化细菌D1，按特定比例制成氮循环菌剂可用于低浓度污水氮素的去除，有效的改变微生物组成，提高脱氮效率，较好的对低污染型富营养化水体进行生态修复，产业前景广阔。

Description

用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于环境科学技术领域，具体涉及到一种用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

在水体氮循环的过程中，参与氮循环的微生物占到了十分主要的地位，是水体氮素循环的基础，能够转化水体有机氮和无机氮，它们的种群、数量变化又对水体有着明显的改善作用。水体氮循环中，发挥绝大部分作用的微生物是传统氮循环菌群，主要分为四种，分别为氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌和反硝化细菌。

目前，经过投加分解能力更强的菌株以迅速转化环境中的超标物质从而变无害为有害的生物生态技术在环境治理范围内已经得到了大量的研究和试验，并显示出其良好的效果。为了获得更好的降解效果和实现对目标污染物的快速转化，构建高效复合菌群技术处理介质中污染物已经成为微生物菌剂令人重视的研究方向。复合菌群去除水中污染物的原因是复合微生物菌群作为一种多种微生物存在的复合体，含有合成营养物质的菌群，也含有降解营养物质的菌群，同时还拥有厌氧菌、兼性菌和好氧菌。复合菌群在水环境中可以快速生长繁殖，结成稳定的、形态多样的结构和生态系统，而且能够对有害微生物的生长进行抑制，同时加快水环境中中有益菌、原生动物和植物的增长，在这些生物的合作条件下，完成对水环境中污染物的去除。

目前，在国外，高效复合微生物菌群技术在包括环境保护领域的多个分支领域都得到重视和使用，我国也在多年前就引进了微生物复合菌群技术。我国某些研究人员利用高效复合微生物菌群技术对常见的生活污水进行实验，取得了特别好的净化成效。随着脱氮菌种的不断被发现和应用，复合脱氮菌群的构建和使用越来越多，可以分为两类，一类是同一类脱氮菌种间的复合，一种是不同类脱氮菌种间的复合。目前，常见的脱氮菌剂缺乏针对低浓度含氮污水的复合菌剂，且存在转化效率低，持续时间短等问题，在对低污染型富营养化水体进行生态修复时不能有效应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种用于低污染水体脱氨的高效氮循环菌剂，通过筛选氨化细菌、亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌，挑选合适的菌种构建高效脱氮的氮循环菌剂。该氮循环菌剂用于水生态和水处理时可以有效的改变微生物组成，提高脱氮效率，较好的对低污染型富营养化水体进行生态修复。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂，其活性菌包括：氨化细菌(Alcaligenessp.)A1(为产碱杆菌)，其于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为：CGMCC NO.16033；亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1(为亚硝化单胞菌)，其于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16030；硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1(为硝化杆菌)，其于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.16031；反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1(为假单胞菌)，其于2018年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16032。

进一步地，所述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂，其活性菌氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1、亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1、硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1、反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的有效活菌数比为(1-9):(10-50):(10-20):(50-100)，优选为(2-6):(20-30):(10-20):(60-80)；更优选为4:25:15:70。

所述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂既可按本领域常规方法制成液体菌剂，也可制成固体菌剂。

当所述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂为液体菌剂时，其有效活菌数总量为1.0×10⁸-5.0×10⁸CFU/g，优选为2.0×10⁸-4.0×10⁸CFU/g，更优选为3.6×10⁸CFU/g。

可将上述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂的液体菌剂按本领域常规方法(例如冷冻干燥或喷雾干燥)制成固体菌剂。

当所述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂为固体菌剂时，含可含有本领域可用的载体或助剂，例如硅藻土、碳酸钙和草木碳等。

为保证氮循环菌剂菌种活性，上述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂中还含有适量保护剂。所述保护剂由甘氨酸与甘油组成，其质量比优选为(1-3):(1-5)，更优选为1:1.5。

一般地，当所述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂为液体菌剂时，所述保护剂的添加量为所述高效氮循环菌剂质量或体积的1-2倍，优选为1.5倍。

本发明还提供上述用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂的制备方法，包括分别制备氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1、亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1、硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1和反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的菌悬液或其冻干菌剂，然后按比例混匀。

进一步地，制备氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1的培养基为：1000mL水中含有K₂HPO₄ 0.2-0.8g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g，蛋白胨0.3-0.5g，pH 6.5-7.2；优选地，其配方为：1000mL水中含有K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，蛋白胨0.5g，pH 7.0。可按本领域常规方法制备，例如121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有适量琼脂，例如20g琼脂/1000mL培养基。

优选地，氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1的液体培养条件包括：温度28℃，转速120r/min，无光培养；一般培养5d。

进一步地，制备亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1的培养基为：1000mL水中含有KH₂PO₄ 0.2-0.8g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g，FeSO₄ 0.1-0.4g，NaCl 1-2.0g，CaCO₃ 1-10.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.3-1g，pH 7.6～8.2；优选地，其配方为：1000mL水中含有KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄ 0.1g，NaCl 2.0g，CaCO₃ 5.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，pH 7.8。可按本领域常规方法制备(配制时CaCO₃最后加入)，例如121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有适量琼脂，例如：20g琼脂/1000mL培养基。

优选地，亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1的液体培养条件包括：温度28℃，转速120r/min，无光培养；一般培养15d。

进一步地，制备硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1的培养基为：1000mL水中含有NaCl0.2-0.8g，K₂HPO₄ 0.2-0.8g，MgSO₄ 0.1-0.5g，FeSO₄ 0.1-0.4g，Na₂CO₃ 0.5-2g，NaNO₂ 0.2-1g，pH 7.2-8.2；优选地，其配方为：1000mL水中含有NaCl 0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.1g，Na₂CO₃ 1g，NaNO₂ 0.5g，pH 7.8。可按本领域常规方法制备，例如121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有适量琼脂，例如20g琼脂/1000mL培养基。

优选地，硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1的液体培养条件包括：温度28℃，转速120r/min，无光培养；一般培养30d。

进一步地，制备反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的培养基为：1000mL水中含有酒石酸钾钠2-10g，CaCl₂ 0.3-0.6g，KNO₃ 1-2g，K₂HPO₄ 0.2-0.5g，葡萄糖0.5-2g，pH 7.2-7.8；优选地，其配方为：1000mL水中含有酒石酸钾钠5g，CaCl₂ 0.5g，KNO₃ 2.0g，K₂HPO₄0.5g，葡萄糖1g，pH 7.4。可按本领域常规方法制备，例如121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有适量琼脂，例如20g琼脂/1000mL培养基。

优选地，反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的液体培养条件包括：温度28℃，厌氧培养；一般培养5d。

本发明还包括上述高效氮循环菌剂或上述氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1或上述亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1或上述硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1或上所述反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1在低浓度含氮水体脱氨方面的应用。

进一步地，所述含氮水体中总氮的浓度为15mg/L以下，优选为5-15mg/L。

具体应用时，将所述高效氮循环菌剂或所述细菌(或含其菌剂)投入到待处理含氮水体中即可。

本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

与现有技术相比，本发明有益效果体现在：本发明改进了氮循环菌的筛选和富集方法，得到对低浓度污水除氮效果更好的氮循环细菌，构建的氮循环菌群合理配置各氮循环菌的比例，把降解各个形态氮的菌种组合到一起构建成菌群，把需要降解的氮直接分解掉或者转化为其他形态的氮再分解掉，对低浓度污水拥有较高的总氮去除率，同时不积累氨氮和硝态氮。

附图说明

图1本发明氨化细A1对低浓度有机氮转化效果。

图2本发明亚硝化细菌B1对低浓度氨氮转化效果。

图3本发明硝化细菌C1对低浓度亚硝态氮转化效果。

图4本发明反硝化细菌D1对低浓度硝态氮转化效果。

图5实施例4氮循环菌剂对低浓度水体中氮素去除效果。

图6实施例5氮循环菌剂对自然水体中氮素去除效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下培养氨化细菌的培养基配方为：1000mL水中含有K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蛋白胨0.5g，pH 7.0。可按本领域常规方法制备，121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有20g琼脂/1000mL培养基。

培养亚硝化细菌的培养基配方为：1000mL水中含有KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄ 0.1g，NaCl 2.0g，CaCO₃ 5.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，pH为7.8。可按本领域常规方法制备(配制时CaCO₃最后加入)，121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有20g琼脂/1000mL培养基。

培养硝化细菌的培养基配方为：1000mL水中含有NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄ 0.1g，Na₂CO₃ 1g，NaNO₂ 0.5g，pH 7.8。可按本领域常规方法制备，121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有20g琼脂/1000mL培养基。

培养反硝化细菌的培养基配方为：1000mL水中含有酒石酸钾钠5g，CaCl₂ 0.5g，KNO₃ 2.0g，K₂HPO₄ 0.5g，葡萄糖1g，pH 7.4。可按本领域常规方法制备，121℃灭菌15min。其固体培养基还可含有20g琼脂/1000mL培养基。

本发明所用氮循环菌群是通过富集培养、分离纯化得来的，通过现代分子学手段16sRNA测序进行鉴定，检测筛选菌种的生长特征并研究其对低浓度含氮污水的降解效果，挑选合适的菌种构建氮循环菌剂，寻找氮循环菌剂内部菌种最佳配比比例，以提高构建的氮循环菌剂的能力，具体的方法如下。

实施例1菌株筛选与培养

1)取自江苏省宜兴市竺山湾天然湿地底泥，制备菌悬液，然后以10％比例分别添加到四种装有100mL培养基(氨化细菌培养基、亚硝化细菌培养基、硝化细菌培养基、反硝化细菌培养基)的250mL锥形瓶中，进行富集培养。

其中，氨化细菌培养基于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养5d，以10％比例转移到新的氨化细菌富集培养中继续培养，连续转移5次。

亚硝化细菌培养基于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养15d，以10％比例转移到新的亚硝化细菌富集培养中继续培养，连续转移6次。

硝化细菌培养基于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养30d，以10％比例转移到新的硝化细菌富集培养中继续培养，连续转移10次。

反硝化细菌培养基于厌氧培养箱内28℃恒温培养5d，以10％比例转移到新的反硝化细菌富集培养中继续培养，连续转移5次。

2)富集培养完毕后，使用连续划线法分离纯化菌株。分离培养基为各氮循环菌培养基配方中加入20g琼脂。

3)挑取一环分离后的菌种接种入相应的培养基中，待菌株生长至生长对数期，把培养基倒入锥形离心管中，液体体积不超过离心管三分之二体积，在5000r/min，7-10℃条件下低温离心。丢弃上清液，用玻璃滴管吸取无菌生理盐水冲洗管壁，加入无菌水，继续离心，离心3-5次即可。把离心后菌液使用无菌生理盐水扩大至原体积后，制备出实验用菌悬液。

4)制备出的氨化细菌菌悬液中有效活菌数为1.2×10⁸～2.6×10⁸CFU/g，制备出的亚硝化细菌菌悬液有效活菌数为0.45×10⁸～1.1×10⁸CFU/g，制备出的硝化细菌菌悬液有效活菌数为0.6×10⁸～1.2×10⁸CFU/g，制备出的反硝化细菌菌悬液有效活菌数为1.56×10⁸～2.33×10⁸CFU/g。

5)取5ml氨化细菌菌悬液加入到含有总氮浓度为5mg/L有机氮的污水中，在30℃，120r/min恒温摇床摇晃无光照培养50h，测定TN与氨氮浓度，计算氨化细菌的转化效率。

取5ml亚硝化细菌菌悬液加入到总氮浓度为5mg/L氨氮的污水中，在30℃，120r/min恒温摇床摇晃无光照培养12d，测定氨氮与亚硝态氮浓度，计算亚硝化细菌的转化效率。

取5ml硝化细菌菌悬液加入到总氮浓度为5mg/L亚硝态氮的污水中，在30℃，120r/min恒温摇床摇晃无光照培养10d，测定亚硝态氮与硝态氮浓度，计算硝化细菌的转化效率。

取5ml反硝化细菌菌悬液加入到总氮浓度为5mg/L硝态氮的污水中，在30℃，120r/min恒温厌氧光照培养5d，测定总氮与硝态氮浓度，计算反硝化细菌的转化效率。

6)优选得到的转化效率最高的氨化细菌，挑取一环菌种接入氨化细菌培养基，于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养15d，以10％比例转移到新的氨化细菌富集培养中继续培养，连续转移10次，进一步地提高优选出的氨化细菌的转化效率。

优选得到转化效率最高的亚硝化细菌，挑取一环接入亚硝化细菌培养基于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养15d，以10％比例转移到新的亚硝化细菌富集培养中继续培养，连续转移5次，进一步的提高优选出的亚硝化细菌的转化效率。

优选转化效率最高的硝化细菌，分别挑取一环硝化细菌接入硝化细菌培养基于28℃，120r/min转速的培养箱内摇晃无光培养30d，以10％比例转移到新的硝化细菌培养基中继续培养，连续转移5次，进一步提高优选出的硝化细菌的转化效率。

优选转化效率最高的反硝化细菌，挑取一环接入反硝化细菌培养基于厌氧培养箱内28℃恒温培养5d，以10％比例转移到新的反硝化细菌富集培养中继续培养，连续转移8次，进一步提高优选出的反硝化细菌的转化效率。

7)测定优选出的菌种的生长量和对低浓度各形态氮转化的效果，测定条件及方法同步骤3)-5)，优选得到氨化细菌A1，其转化率为92.59％，见图1；优选得到亚硝化细菌B1，其转化率为73.86％，见图2；优选得到硝化细菌C1，其转化率为86.32％，见图3；优选得到反硝化细菌D1，其转化率为94.49％，见图4。

实施例2对实施例1筛选的四种菌进行鉴定(16sRNA测序)

取培养完毕的菌液放进离心管中，常温下，以8,000rpm的转速离心1min，弃去上清液，收集下部沉降的细菌菌体。加入180μl溶菌酶溶液(将溶解酶加入到Enzymatic lysisbuffer中混合均匀，配置成20mg/ml的溶解酶溶液)然后上下颠倒摇晃菌液，在37℃下均匀加热30-60min，再加入400μl BufferDigestion，震荡混匀。在65℃下恒温加热1h使得细胞破碎完毕释放细胞内物质。

加入离心管中200μl Buffer PB，使之充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。在常温下以10,000rpm的转速离心5-6min，取出离心后的液体放置在新的容器内。加入离心管中与取得液体一样体积的异丙醇，颠倒反复晃动混合均匀液体，然后再常温下放置3-4min。在常温下以10,000rpm的转速离心混合后的液体6min，丢弃离心后的液体，保留沉降物。向容器内沉降物中75％的乙醇1ml，然后反复上下摇匀，之后在以10,000rpm的转速离心液体3min，丢弃离心后的液体。

重复上述加入乙醇的操作一次。拔开离心管的盖子，倒放离心管7-12min左右，得到的DNA用75μl的TE Buffer溶解。

所得DNA用16SrDAN扩增引物进行扩增，所用引物为一对通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')，1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')

扩增完毕后，测定其16SrDNA序列，测定结果在NCBI上通过BLAS程序得到比对结果。

氨化细菌A1 DNA序列见SEQ NO.1；

亚硝化细菌B1 DNA序列见SEQ NO.2；

硝化细菌C1 DNA序列见SEQ NO.3；

反硝化细菌D1 DNA序列见SEQ NO.4。

其中，氨化细菌A1经鉴定为产碱杆菌Alcaligenes sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCCNo.16033。亚硝化细菌B1经鉴定为亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCCNo.16030。硝化细菌C1经鉴定为硝化杆菌Nitrobacter sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC No.16031。反硝化细菌D1鉴定为反硝化细菌Pseudomonas sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC No.16032。

实施例3

使用正交实验法，优选出实施例1所筛选的氨化细菌A1CGMCC NO.16033、亚硝化细菌B1CGMCC NO.16030、硝化细菌C1CGMCC NO.16031、反硝化细菌D1CGMCC NO.16032最佳配比，构建出氮循环菌群。其中，各菌株所用培养基及培养条件与实施例1相同，具体过程如下：

1)挑取一环分离后的菌种接种入相应的培养基中，待菌株生长至生长对数期，把培养基倒入锥形离心管中，液体体积不超过离心管三分之二体积，在5000r/min，7-10℃条件下低温离心。丢弃上清液，用玻璃滴管吸取无菌生理盐水冲洗管壁，加入无菌水，继续离心，离心3-5次即可。把离心后菌液使用无菌生理盐水扩大至培养基原体积，制备出实验用菌悬液。

2)制备出的氨化细菌A1菌悬液中有效活菌数为1.2×10⁸CFU/g，制备出的亚硝化细菌B1菌悬液有效活菌数为0.9×10⁸CFU/g，制备出的硝化细菌C1菌悬液有效活菌数为0.8×10⁸CFU/g，制备出的反硝化细菌D1菌悬液有效活菌数为2.1×10⁸CFU/g。

3)使用正交实验法，选取四种细菌不同量的菌悬液按照浓度梯度构建氮循环菌菌液，取5ml配比后的菌液加入到含有15mg/L总氮的100ml低浓度污水中，在30℃，无光照条件下连续测定17d液体中总氮及各形态氮的浓度。

4)取降解效率最好的一组氮循环菌配比比例作为氮循环菌群构建比例，即：氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1、亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1、硝化细菌(Nitrobactersp.)C1、反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的有效活菌数比例4:25:15:70。

5)分别按步骤4)中比例将四种菌悬液混合，制成混合菌悬液，然后添加混合菌悬液总体积1.5倍的保护剂，制成氮循环菌剂。所述保护剂为甘氨酸与甘油按质量比为1:1.5组成的混合物。

实施例4

对低浓度含氮污水的去除作用，该污水的总氮起始浓度为15mg/L左右。

采用实施例1所筛选的氨化细菌A1、亚硝化细菌B1、硝化细菌C1、反硝化细菌D1分别制备菌悬液，其中，各菌株所用培养基及培养条件与实施例1相同。采用实施例3中的氮循环菌构建比例将四种菌悬液混合，制成混合菌悬液，然后添加混合菌悬液总体积1.5倍的保护剂，制成氮循环菌剂。所述保护剂为甘氨酸与甘油按质量比为1:1.5组成的混合物。

本实施例所制得的氮循环菌剂中，氨化细菌A1、亚硝化细菌B1、硝化细菌C1、反硝化细菌D1的活菌数比例为4:25:15:70，有效活菌数总量为3.6×10⁸CFU/g。

对本实施例制得的氮循环菌剂进行脱氨性能评价，所用污水的总氮起始浓度为15mg/L左右。在室内条件下，以5％接种比例把氮循环菌剂投加到污水中，每隔1d检测污水中各形态氮的变化，连续检测17d。17d后，该污水中总氮浓度为5.09mg/L，总氮去除率达到66.18％，结果见图5。

实施例5

按实施例4相同的方法制备氮循环菌剂。

本实施例所制得的氮循环菌剂中，氨化细菌A1、亚硝化细菌B1、硝化细菌C1、反硝化细菌D1的活菌数比例为4：25：15：70，有效活菌数总量为3.6×10⁸CFU/g对本实施例制得的氮循环菌剂进行脱氨性能评价，所用污水为自然水体，实验地点：江苏省宜兴市周铁镇某小型池塘，水面面积约为120m²，水深约0.6m，水体中TN(总氮)浓度约为1.19mg/L。使用五点法投加本实施例制得的氮循环菌剂1L，1个月以后，水体中TN降为0.63m/L，TN去除效率达到47.06％，结果见图6。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改和改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国环境科学研究院

<120> 用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂及其制备方法与应用

<130> KHP181111367.9

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 氨化细菌(Alcaligenes sp.A1)

<400> 1

attgaacgct agcgggatgc tttacacatg caagtcgaac ggcagcacga gagagcttgc 60

tctcttggtg gcgagtggcg gacgggtgag taatatatcg gaacgtgccc agtagcgggg 120

gataactact cgaaagagtg gctaataccg catacgccct acgggggaaa gggggggatt 180

cttcggaacc tctcactatt ggagcggccg atatcggatt agctagttgg tggggtaaag 240

gctcaccaag gcaacgatcc gtagctggtt tgagaggacg accagccaca ctgggactga 300

gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggggaaacc 360

ctgatccagc catcccgcgt gtatgatgaa ggccttcggg ttgtaaagta cttttggcag 420

agaagaaaag gtatctccta atacgagata ctgctgacgg tatctgcaga ataagcaccg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact 540

gggcgtaaag cgtgtgtagg cggttcggaa agaaagatgt gaaatcccag ggctcaacct 600

tggaactgca tttttaactg ccgagctaga gtatgtcaga ggggggtaga attccacgtg 660

tagcagtgaa atgcgtagat atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc cccctgggat 720

aatactgacg ctcagacacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccctaa acgatgtcaa ctagctgttg gggccgttag gccttagtag cgcagctaac 840

gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 900

ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct 960

acccttgaca tgtctggaas ccgaagagat ttgggtgctc gcaagagaac cggaacacag 1020

gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg tcattagttg ctacgcaaga gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagaat gagactgccg 1200

gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagccg 1260

atcgtagtcc gttcgtccat gcgagactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320

cggatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380

tgggagtggg tttcaccaga agtaggtagc ctaaccgtaa ggagggcgct taccacggtg 1440

ggattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta tcggaagg 1488

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.B1)

<400> 2

attgaacgct ggcggcatgc tttacacatg caagtcgaac ggcagcacgg gggcaaccct 60

ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaatgc atcggaacgt atccttaagt gggggataac 120

gcaccgaaag gtgtgctaat accgcataat ctctgaggag aaaagcaggg gatcgcaaga 180

ccttgcgctt ttggagcggc cgatgtctga ttagctagtt ggtgaggtaa aggcttacca 240

aggcgacgat cagtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactgggact gagacacggc 300

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggaaa ccctgatcca 360

gccatgccgc gtgagtgaag aaggccttcg ggttgtaaag ctctttcagc cggaacgaaa 420

cggttacggt taatacccgt gactactgac ggtaccggaa gaagaagcac cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 540

agcgtgcgca ggcggttttg taagtcagat gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg 600

cgtttgaaac tacaaggcta annntgcgca ggcggttttg taagtcagat gtgaaatccc 660

cgggcttaac ctgggaactg cgtttgaaac tacaaggcta tggcccttat gggtagggct 720

tcacacgtaa tacaatggcg cgtacagagg gttgccaacc cgcgaggggg agctaatctc 780

agaaagcgcg tcgtagtccg gatcggagtc tgcaactcga ctccgtgaag tcggaatcgc 840

tagtaatcgc ggatcagcat gtcgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc 900

gtcacaccat gggagtgggt tccaccagaa gcaggtagtc taaccgcaag gagggcgcct 960

gccacggtga gattcatgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccgtag gggaacctgc 1020

ggctggatca cctccttt 1038

<210> 3

<211> 1459

<212> DNA

<213> 硝化细菌(Nitrobacter sp.C1)

<400> 3

gatcttggct cagagcgaac gctggcggca ggcttaacac atgcaagtcg aacgggcgta 60

gcaatacgtc agtggcagac gggtgagtaa cacgtgggaa cgtacctttt ggttcggaac 120

ggacagggaa acttcagcta ataccggata agcccttacg gggaaagatt tatcgccgaa 180

agatcggccc gcgtctgatt agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gccctaatca 240

gtagctggtc aaactggatg atcagccaca ttgggactga gacacggccc aaactctacg 300

gggcagcagt ggggaatatt ggacaatgcc gaaaagcctg atccagccat gccgcgtgag 360

tgatgaaggc cctagggttg taaagctctt ttgtgcggga agataatgac ggtaccgcaa 420

gaataagccc cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggg gctagcgttg 480

ctcggaatca ctgggcgtaa agggtgcgta ggcggatctt taagtcaggg gtgaaatcct 540

ggagctcaac tccagaactg cctttgatac tgaaggtctt gagttcggga gaggtgagtg 600

gaactgcgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcgcaa gaaaaccagt ggcgaaggcg 660

gctcactggc ccgatactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 720

accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagccgt tagtgggttt actcactagt 780

ggcgcacgta acgctttaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa 840

aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagacctggt ttaattcgac gcaacgcgca 900

gaaccttacc agcccttgac atgtccatga ccggtcgcag agatgtgacc ttctcttcgg 960

agcatggagc acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1020

gtcccgcaac gagcgcaacc cccgtcctta gttgctacca tttagttgag cactctccgg 1080

aactgccggt gataagccgc gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca tggcccttac 1140

gggctgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacaatgg gaagcaaagg ggcaacccct 1200

agcaaatctc aaaaaaccgt ctcagttcgg attgggctct gcaactcgag cccatgaagt 1260

tggaatcgct agtaatcgtg gatcagcata aatcgatgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320

acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt ttacctgaag gcggtgcgct aacccgcaag 1380

gaggcagccg accacggtag ggtcagcgac tggggtgaag tcgtaacaag gtagccgtag 1440

gggaacctgc ggctggatc 1459

<210> 4

<211> 779

<212> DNA

<213> 反硝化细菌(Pseudomonas sp.D1)

<400> 4

tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg cgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc 60

actttaagtt gggaggaagg gcattaacct aatacgttag tgttttgacg ttaccaacag 120

attaagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaagggtg caggcgttaa 180

tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaagcccc 240

gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact ggcgagctag agtacggtag agggtggtgg 300

aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggcagg aacaccagtg gcgaaggcga 360

ccacctggac tgatactgac actgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 420

ccctggtagt ccacgccgta aagtcgatgt caactagccg ttggaatcct tgagatttta 480

gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 540

aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 600

gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 660

ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 720

agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acctcgggtg ggcactcta 779

Claims (10)

1.一种用于低浓度含氮污水的氮循环菌剂，其活性菌包括：

氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1，其保藏编号为：CGMCC NO.16033；

亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1，其保藏编号为：CGMCC NO.16030；

硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1，其保藏编号为：CGMCC NO.16031；

反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1，其保藏编号为：CGMCC NO.16032。

2.根据权利要求1所述的氮循环菌剂，其特征在于，所述氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1、亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1、硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1、反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1的有效活菌数比为(1-9):(10-50):(10-20):(50-100)，优选为(2-6):(20-30):(10-20):(60-80)；更优选为4:25:15:70。

3.根据权利要求1或2所述的氮循环菌剂，其特征在于，其为液体菌剂或固体菌剂；

当为液体菌剂时，有效活菌数总量为1.0×10⁸-5.0×10⁸CFU/g，优选为2.0×10⁸-4.0×10⁸CFU/g，更优选为3.6×10⁸CFU/g。

4.根据权利要求1-3任一项所述的氮循环菌剂，其特征在于，还含有适量保护剂；所述保护剂由甘氨酸与甘油组成，其质量比优选为(1-3):(1-5)，更优选为1:1.5。

5.根据权利要求4所述的氮循环菌剂，其特征在于，其为液体菌剂；所述保护剂的添加量为所述高效氮循环菌剂质量或体积的1-2倍，优选为1.5倍。

6.氨化细菌(Alcaligenes sp.)A1，其保藏编号为：CGMCC NO.16033。

7.亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1，其保藏编号为：CGMCC NO.16030。

8.硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1，其保藏编号为：CGMCC NO.16031。

9.反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1，其保藏编号为：CGMCC NO.16032。

10.根据权利要求1-5任一项所述氮循环菌剂或权利要求6所述氨化细菌(Alcaligenessp.)A1或权利要求7所述亚硝化细菌(Nitrosomonas sp.)B1或权利要求8所述硝化细菌(Nitrobacter sp.)C1或权利要求9所述反硝化细菌(Pseudomonas sp.)D1在低浓度含氮水体脱氨方面的应用；

优选地，所述含氮水体中总氮的浓度为15mg/L以下，更优选为5-15mg/L。