CN109890216A - 水产生物生长促进剂 - Google Patents
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Abstract
一种水产生物生长促进剂，其以低分子量木质素和/或高分子量木质素作为有效成分，所述低分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量4,000～9,500的范围具有分子量峰，所述高分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量10,000～40,000的范围具有分子量峰。
Description
技术领域
本发明涉及促进水产生物生长的促进剂、以及使用了该促进剂的水产生物的生长促进方法。
背景技术
进行了在家畜用的饲料中有效利用以往废弃的植物资源的研究，例如，木质系生物质通过除去木质素而作为家畜的饲料被有效利用(专利文献1)。此外，也进行了在饲料中添加各种植物资源来源的化学物质而使水产生物的肉质、生长提高的研究，例如，一直以来已知如果将维生素E、维生素C添加于鱼类的饲料则对鱼肉的褐变、脂质氧化的抑制具有效果，最近，明确了金针菇废菌床提取物(非专利文献1)、柚子的皮(非专利文献2)也可获得同样的效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平07-231752号公报
非专利文献
非专利文献1：Huynh N.D.Bao等人，Aquaculture 295，243-249(2009)
非专利文献2：Fukada等人，Journal of aquatic food product technology 23，5，511-521(2014)
发明内容
发明所要解决的课题
以提供以水产生物的生长促进作为目的的植物来源的安全的饲料作为课题。
用于解决课题的手段
本发明人进行了深入研究，结果发现，在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量4,000～9,500的范围具有分子量峰的低分子量木质素和/或在分子量10,000～40,000的范围具有分子量峰的高分子量木质素促进水产生物的生长，从而完成了本发明。
即本发明具有以下[1]～[3]的构成。
[1]一种水产生物生长促进剂，其以低分子量木质素和/或高分子量木质素作为有效成分，所述低分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量4,000～9,500的范围具有分子量峰，所述高分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量10,000～40,000的范围具有分子量峰。
[2]根据[1]所述的水产生物生长促进剂，上述低分子量木质素和/或高分子量木质素来源于甘蔗渣的碱热水提取物。
[3]根据[1]或[2]所述的水产生物生长促进剂，其促进甲壳类的蜕皮。
[4]一种水产生物生长促进用饲料，其包含上述水产生物生长促进剂。
[5]根据[4]所述的水产生物生长促进用饲料，其包含以多酚量计按照儿茶素换算为0.007重量％以上的上述低分子量木质素和/或高分子量木质素。
[6]一种促进水产生物生长的方法，其中，对水产生物给予上述水产生物生长促进剂。
〔7〕一种促进水产生物生长的方法，其中，对水产生物喂食上述水产生物生长促进用饲料。
[8]根据〔6〕或〔7〕所述的促进水产生物生长的方法，上述水产生物为甲壳类。
发明的效果
本发明中，以迄今为止未作为水产生物用饲料有效利用的甘蔗渣的碱提取物作为有效成分，具有水产生物的生长促进效果。
附图说明
图1是甘蔗渣碱热水提取液的GPC分子量分析结果具体例
图2是低分子量木质素的GPC分子量分析结果具体例
图3是高分子量木质素的GPC分子量分析结果具体例
图4是甘蔗渣水热处理液的GPC分子量分析结果具体例
图5是木质素磺酸液的GPC分子量分析结果具体例
图6是碱水热处理液的GPC分子量分析结果具体例
具体实施方式
对用于实施本发明的方式进行详细说明。
木质素为植物来源的高分子酚性化合物。木质素具有复杂并且多样的结构，因此详细的结构不清楚。此外，根据生物质的种类、提取方法、分析方法的不同而分子量不同，但报导的一般的数均分子量为2400～9700(Biofuels Bioproducts&Biorefinering，Volume8，Issue6，836-856(2014))。
本发明的水产生物生长促进剂以在波长254nm下的GPC分子量分析中，在分子量4,000～9,500的范围具有分子量峰的低分子量木质素和/或在分子量10,000～40,000的范围具有分子量峰的高分子量木质素作为有效成分。
本发明中使用的低分子量木质素所具有的分子量峰的优选的分子量的范围为4,500～9,400，进一步优选为5,000～9,300。
本发明中使用的高分子量木质素所具有的分子量峰的优选的分子量的范围为10,200～37,000，进一步优选为11,000～35,000。
此外，木质素的分子量也可以由数均分子量判断。关于本发明中使用的低分子量木质素的优选的平均分子量，以使用了UV检测器的GPC分子量分析中的数均分子量计，为3,500以上且6,000以下，更优选为3,600以上且5,000以下。关于本发明中使用的高分子量木质素的优选的平均分子量，以使用了UV检测器的GPC分子量分析中的数均分子量计，为10,000以上且20,000以下，更优选为10,000以上且15,000以下。关于包含本发明中使用的低分子量木质素和高分子量木质素两者的木质素的优选的数均分子量，以使用了UV检测器的GPC分子量分析中的数均分子量计，为4,000以上且15,000以下，更优选为6,000以上且10,000以下。
此外，对于本发明中使用的低分子量木质素和高分子量木质素，只要为上述的分子量范围内，分子量峰也可以为多个。进一步，也可以在上述的分子量范围外具有分子量峰，但在该情况下，波长254nm下的分子量峰之中的具有最大高度的峰，如果是本发明中使用的低分子量木质素则优选为分子量4,000～9,500的范围内，如果是本发明中使用的高分子量木质素则优选为分子量10,000～40,000的范围内。
将包含本发明中使用的低分子量木质素和本发明中使用的高分子量木质素两者的情况下的、使用了UV检测器的GPC分子量分析的具体例示于图1中。此外，将本发明中使用的低分子量木质素的具体例示于图2中，将本发明中使用的高分子量木质素的具体例示于图3中。
以下，本说明书中，将本发明中使用的低分子量木质素记为本发明的低分子量木质素，将本发明中使用的高分子量木质素记为本发明的高分子量木质素。
GPC为Gel Permeation chromatography，是凝胶渗透色谱的简写，可以将测定试样中的化合物按分子尺寸进行分离。此外，通过检测器检测分离出的聚合物的相对量，也可以计算分子量。GPC分子量分析中，使用标准聚合物预先求出溶出时间与分子量的关系，基于此而换算测定试样的分子量。本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的分子量为使用聚乙二醇、聚氧化乙烯作为标准聚合物而测定的值。
GPC分子量分析的检测器可以利用可以检测作为木质素的吸收波长区域的250～300nm的检测器。本发明中，在GPC分子量分析时为了消除作为低分子芳香族的香豆酸、阿魏酸等肉桂酸类的影响而使用在不具有肉桂酸类的吸收的254nm下分析而得的值。本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素为用株式会社岛津制作所制的多波长紫外-可见吸收检测器(SPD-M20A)检测到的值。GPC分子量分析中，可以由以下式1算出数均分子量。
Mn＝Σ(Mi·Ni)/Σ(Ni)＝ΣCi/Σ(Ci/Mi)···式1。
这里Mn表示数均分子量，M表示分子量，N表示聚合物的数，C表示试样浓度。
作为GPC分子量分子量分析所使用的柱，没有特别限制，本申请发明的分子量为使用TSKgelGMPWXL和G2500PWXL测定的值。
作为成为本发明的低分子量木质素、和/或本发明的高分子量木质素的原料的植物，可以使用松、杉、扁柏等针叶树、桉、槐等阔叶树、作为甘蔗的榨渣的甘蔗渣、黍、象草、斑茅、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草本系生物质、以及藻类、海草等水生环境来源的生物质、玉米外皮、小麦外皮、大豆外皮、稻壳等谷物外皮生物质等。优选为甘蔗渣。
作为从上述植物提取本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素的方法，有采用有机溶剂(乙醇、乙酸乙酯等)的提取、酸提取、碱提取、水热提取、碱水热提取或碱热水提取等，优选为碱提取或碱热水提取，进一步优选为碱热水提取。
碱提取、碱水热提取或碱热水提取所使用的碱化合物没有特别限制，可举出例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氨等，优选为氢氧化钠或氢氧化钾，进一步优选为氢氧化钠。
碱热水提取的条件优选为pH10～13.5、温度80℃～120℃、处理时间0.5小时以上，更优选为pH10.5～13.0、温度90℃～120℃、处理时间1小时以上进行反应。关于碱浓度的上限，只要可获得本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素就没有特别限制，但在碱浓度相对于生物质过高的情况下影响最终添加的饲料的pH，伴随有水产生物对饲料的嗜好性、生育环境的变化，因此优选为4(wt/wt)％以下。
水热处理为用加压热水(180～240℃)进行处理而提取木质素的方法。
碱水热提取为在碱热水提取的pH条件下，用加压热水(180～240℃)进行处理而提取木质素的方法。
作为碱热水提取方法的具体例，例如通过对于甘蔗渣5(wt/wt)％(干燥重量)浓度的溶液，在90℃用0.45(wt/wt)％的氢氧化钠水溶液反应2小时，从而可以提取本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素。上述的所谓干燥重量，为使甘蔗渣在105℃下干燥直到重量变为恒定为止后的重量。
在想要将本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素分离的情况下，中和到pH5以下进行固液分离，从而可以将本发明的低分子量木质素分离到液体部分，将本发明的高分子量木质素分离到固体部分。原因在于具有下述特点：在pH5以下的条件下本发明的低分子量木质素溶解于水，与此相对，本发明的高分子量木质素不溶解于水而沉淀。在pH5以下的条件下不溶解的高分子量木质素可以通过使pH再次为与pH5相比靠碱侧，例如为pH8以上，从而使其再溶解于水。
本发明的水产生物生长促进剂向水产生物的给予形态可以为将本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素制成药剂而将有效量给予水产生物的形态，此外，也可以为将本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素配合于饲料中制成水产生物生长促进用饲料而进行喂食的形态，优选采用水产生物生长促进用饲料的形态。
在本发明为水产生物生长促进用饲料的情况下，优选在该饲料中包含以多酚量计按照儿茶素换算为0.007重量％以上的本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素，更优选包含0.0128重量％以上，进一步优选包含0.14重量％以上。关于多酚量的上限，只要发挥生长促进效果就没有特别限制，但优选为基本不会造成其它饲料成分的相对比例降低的程度即0.5重量％以下。
本发明中的儿茶素换算的多酚量为通过福林西奥卡特法算出的值。福林西奥卡特法原来是以分析酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸、具有它们的蛋白质作为目的而开发的方法。是在700～770nm下对酚性羟基为碱性将磷钨酸、钼酸还原而产生的蓝色进行比色定量的方法。可以用没食子酸、儿茶素等特定的基准物质进行同样的操作，以该化合物换算显示定量值。
如果向水产生物给予以本发明的低分子量木质素和/或高分子量木质素作为有效成分的水产生物生长促进剂、或包含该水产生物生长促进剂的饲料，则与给予不含该有效成分的水产生物用饲料的情况相比，水产生物的生长被促进。这里所谓生长促进，为水产生物的体重(生物内包含水分的烹调前的鱼的重量)、体长增加、或甲壳类等的蜕皮次数的增加、或过密的养殖条件下的死亡率的降低(存活率的增加)。
作为本发明的水产生物生长促进用饲料的调制方法，可以将包含本发明的有效成分的液体喷雾于通常的水产生物用饲料、或在各种饲料原料的配合时与水等粘合剂一起添加。此外，也可以使包含本发明的有效成分的液体浓缩、或干燥、或如上述那样将本发明的高分子量木质素的pH调整为pH5以下而产生沉淀，从而制成固体，混入到通常的水产生物用饲料来给予。此外在将本发明的有效成分喷雾于通常的水产生物用饲料、或混入到通常的水产生物用饲料的情况下，可以以使本发明的有效成分充分保持在饲料中作为目的，在该饲料的表面用疏水性物质等涂布。作为涂布所使用的疏水性物质，可举出例如包含脂肪酸的植物油、将植物油精制而得的色拉油、动物性的油等。
作为本发明的水产生物生长促进用饲料所包含的水产生长促进剂以外的饲料原料，只要是可以适用于饲料就没有特别限制，有鱼粉、磷虾粉、乌贼粉、虾粉、桡足动物粉末、淀粉、鱼贝提取物、卵磷脂、饲料用酵母、酵母提取物、磷酸钙、精制鱼油、天然甜菜碱、甘草末、狭鳕肝油、各种维生素等。关于饲料的分析组成，也只要以对水产生物的生育没有显著问题的程度含有充分量的粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷等，就没有特别限制。
此外，作为有效成分以外的物质，可以包含植物来源物质。作为有效成分以外的物质，可举出例如，植物来源的香豆酸、阿魏酸等肉桂酸类。作为在饲料中包含的其它成分的浓度，在高浓度的情况下花费添加成本，因此优选香豆酸为0～0.02重量％、阿魏酸为0～0.01重量％，进一步优选香豆酸为0.0001～0.01重量、阿魏酸为0.00001～0.01重量％。这些香豆酸、阿魏酸可以为精制物，也可以为粗提取物的状态。
此外，可以包含以防止饲料保存中的氧化作为目的的抗氧化剂。具体而言，可举出乙氧喹啉、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚等。
作为对水产生物喂食饲料的方法，只要是按照常规方法的喂食时机、喂食量就没有特别限制，例如，可以1天～1周喂食1次，优选为1天1～3次，将相当于水产生物的体重的2～5重量％的饲料根据残饵量来调整进行供给为好。
作为成为生长促进的对象的水产生物，只要是在海水、淡水中生活的生物就没有特别限制，优选为鱼类或甲壳类，更优选为甲壳类。
作为鱼类的具体例，可举出眼斑双锯鱼、花鲈、尾斑光鳃鱼、金枪鱼、鲣等鲈形目、日本鳗鲡等鳗鲡目、中吻鲟等鲟形目、太平洋鲱、远东拟沙丁鱼等鲱形目、西鲤、鲫、泥鳅等鲤形目、鲶等鲶形目、香鱼、大马哈鱼、虹鳟等鲑形目、红金眼鲷等棘鳍总目、狭鳕等鳕形目、日本鬼鲉、等目、赤魟等鳐目、褐菖鲉、棘绿鳍鱼等鲉形目、拟鲽、牙鲆等蝶形目、丝背细鳞鲀、河豚等鲀形目，进一步优选为鲈形目。
作为甲壳类的具体例，可举出深虾蛄科、指虾蛄科、齿指虾蛄科、猛虾蛄科、虾蛄科、长须虾科、管鞭虾科、对虾科、单肢虾科、樱虾科、刺虾科、匙指虾科、玻璃虾科、背膝虾科、长臂虾科、鼓虾科、藻虾科、长额虾科、雕褐虾科、褐虾科、蝲蛄科、正螯虾科、海螯虾科、锯指螯虾科、多钳虾科、龙虾科、蝉虾科、阿蛄虾科、铠甲虾科、瓷蟹科、石蟹科、溪蟹科、蛙蟹科、人面绵蟹科、绵蟹科、蛛形蟹科、人面蟹科、关公蟹科、馒头蟹科、蜘蛛蟹科、膜壳蟹科、菱蟹科、黄道蟹科、玉蟹科、近圆蟹科、假面蟹科、梭子蟹科、巨神蟹科、扇蟹科、长脚蟹科、沙蟹科、方蟹科、豆蟹科等。其中，特别优选为龙虾科的日本龙虾、蝉虾科的毛缘扇虾、日本岩礁扇虾、鳞突拟蝉虾、对虾科的斑节对虾、白虎虾(ホワイトタイガー)、日本对虾、周氏新对虾、须赤虾、白虾、短沟对虾、樱虾科的正樱虾、长额虾科的甜虾、日本长额虾、海螯虾科的红斑后海螫虾。
实施例
以下，具体说明本发明。
(参考例1)GPC分子量分析测定
GPC分子量分析在以下条件下实施。
检测器：多波长紫外-可见吸收检测器UV(株式会社岛津制作所制SPD-M20A，波长254nm)
柱：TSKgelGMPWXL，G2500PWXL各1根(φ7.8mm×30cm，東ソー)
溶剂：氨缓冲液(pH11)/甲醇(1/1＝v/v)
流速：0.7mL/min
柱温度：23℃
进样量：0.2mL
标准试样：東ソー株式会社制，Polymer Laboratories制单分散聚氧化乙烯、聚乙二醇。
用标准试样预先取得溶出时间与分子量的对数的关系，以每LogM(M为分子量)的重量分率dW/dlogM(W为重量)进行转换，将横轴作为分子量的对数，将纵轴以峰面积成为1的方式绘制进行解析。
(参考例2)多酚量的测定
将适当稀释的测定试样1.0mL、苯酚试液(ナカライテスク社)1.0mL、水5mL加入到25mL的容量瓶中在室温放置5分钟，在其中加入7％碳酸钠水溶液10mL。进一步加入水制成25mL并进行混合，在室温放置2小时。取反应液的一部分，用φ0.45μm的PTFE过滤器过滤，在750nm下测定吸光度(以吸光度成为0.6ABS以下的方式将样品适当稀释)。作为标准物质，使用儿茶素试剂(シグマ社，纯度98％以上)，以儿茶素换算值的形式算出。
(参考例3)芳香族化合物的测定
香豆酸、阿魏酸等芳香族化合物浓度的测定在以下条件下实施。
设备：日立高效液相色谱仪LaChrom Eite
柱：Synergi 2.5μHydro-RP100A 100×3.00mm(Phenomenex)
流动相：0.1％磷酸：乙腈＝93：7～5：95梯度
检测器：Diode Array(二极管阵列)
流速：0.6mL/min
温度：40℃。
(试验例1)日本对虾的蜕皮促进效果(本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将甘蔗渣1kg(从台糖农产株式会社购入，越南制)以干燥重量计为5wt％添加、混合到0.45wt％氢氧化钠水溶液中，在90℃下使其反应2小时，使用6N盐酸将pH调整为7后，用笊篱分离固体，用MF膜(商品名：トレフィルHFS型，東レ社制)进行过滤，制作出甘蔗渣碱热水提取液。将该碱提取液通过参考例1所记载的方法进行GPC分子量分析。分析结果如图1所述那样，确认了含有在分子量7,000具有峰的本发明的低分子量木质素、和在分子量21,000具有分子量峰的本发明的高分子量木质素。此外，数均分子量为8,900。进一步将该甘蔗渣碱提取液按照参考例2测定了多酚量，结果以儿茶素换算为0.2重量％。此外，通过参考例3所记载的方法测定了香豆酸、阿魏酸，结果香豆酸为0.08重量％，阿魏酸为0.016重量％，仅含有相同浓度的香豆酸、阿魏酸的液体的多酚含量以儿茶素换算为0.072重量％。由此可知，本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的多酚含量以儿茶素换算为0.128重量％。将该甘蔗渣碱热水提取液(固体成分2％，单位固体成分的多酚含量以儿茶素换算为10％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％喷雾、混合于配合饲料(ヒガシマル醤油株式会社制，ノーサン印对虾育成用配合饲料HクルマエビスーパーB)(单位饲料干燥重量的多酚含量以儿茶素换算为0.02％，本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的多酚含量以儿茶素换算为0.0128重量％)。进一步将饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)涂布于饲料表面。将制作的饲料作为含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料使用。
[生长促进效果的评价]
将平均体重14.1g(标准偏差1.5)、平均全长143.1mm(标准偏差6.0)的日本对虾24尾以每1水槽为8尾(12.5尾/m2)在3水槽中对含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料的水产生物生长促进效果进行了评价。在水槽底部铺底砂，将天然过滤海水加温作为海水，使其为20～25℃，换水率为3.8次/天。光条件为12小时明、12小时暗，将含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料1次/天在刚熄灯后立即喂食。喂食量以开始时的虾体重比3％计量，然后，在试验开始第9天为开始时的虾体重比4％，在试验开始第20天为开始时的虾体重比5％，根据摄食状况阶段性地提高喂食量。实施30天试验，计测该期间中的24尾的合计蜕皮次数。将结果示于表1中。
(试验例2)日本对虾的蜕皮促进效果(本发明的低分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例1中制作的甘蔗渣碱热水提取液用6N盐酸中和成pH5，使本发明的高分子量木质素沉淀。添加、混合硅藻土1％后，使用压滤机(薮田机械社株式会社制YTO型)进行固液分离，将本发明的低分子量木质素液分离到滤液侧，将本发明的高分子量木质素分离到固体成分侧。将所得的滤液用氢氧化钠50％(wt/v)溶液调整为pH7，获得了本发明的低分子量木质素液。将该本发明的低分子量木质素液通过参考例1所记载的方法进行了GPC分子量分析。结果如图2所示那样，确认了含有在分子量7,000具有峰的本发明的低分子量木质素。此外，由GPC分子量分析结果求出的数均分子量为4,000。进一步将该低分子量木质素液按照参考例2测定了多酚量，结果以儿茶素换算为0.1％。此外，通过参考例3所记载的方法测定了香豆酸、阿魏酸，结果香豆酸为0.06重量％，阿魏酸为0.012重量％，仅含有相同浓度的香豆酸、阿魏酸的液体的多酚含量以儿茶素换算为0.05重量％。由此可知，本发明的低分子量木质素以儿茶素换算为0.05重量％。将该低分子量木质素液(固体成分1.5％，单位固体成分的儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％喷雾、混合于配合饲料(ヒガシマル醤油株式会社制，ノーサン印对虾育成用配合饲料HクルマエビスーパーB)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.014％，本发明的低分子量木质素的多酚含量以儿茶素换算为0.007重量％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。将制作的饲料作为含有本发明的低分子量木质素的饲料使用。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例1同样。将结果示于表1中。
(试验例3)日本对虾的蜕皮促进效果(本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例1中制作的甘蔗渣碱热水提取液用6N盐酸中和成pH3，使本发明的高分子量木质素沉淀。作为过滤助剂添加、混合硅藻土1％后，使用压滤机(薮田机械株式会社制YTO型)进行固液分离，以固体形式获得了含有硅藻土的本发明的高分子量木质素。使含有硅藻土的本发明的高分子量木质素干燥，使固体成分为85％。将该本发明的高分子量木质素(单位固体成分的多酚量以儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％混合于配合饲料(ヒガシマル醤油株式会社制，ノーサン印对虾育成用配合饲料HクルマエビスーパーB)(单位饲料干燥重量的多酚含量以儿茶素换算为0.014％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。将制作的饲料作为含有本发明的高分子量木质素的饲料使用。
另一方面，与饲料制作分开实施了本发明的高分子量木质素的截留分子量的测定。对于含有硅藻土的不溶性本发明的高分子量木质素，添加50％(wt/v)的氢氧化钠将pH调整为12，将本发明的高分子量木质素溶解。将该本发明的高分子量木质素液用6N盐酸调整为pH7，通过参考例1所记载的方法进行了GPC分子量分析。将结果示于图3中。由该分析结果，确认了所得的木质素为在分子量21,000具有峰的本发明的高分子量木质素，不含有本发明的低分子量木质素。此外，由该分析结果求出的数均分子量为13,800。将此时调整的本发明的高分子量木质素液按照参考例2测定了多酚量，结果以儿茶素换算为0.1重量％。此外，通过参考例3所记载的方法测定了香豆酸、阿魏酸，结果未检测到香豆酸、阿魏酸。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例1同样。将结果示于表1中。
(试验例4)日本对虾的蜕皮促进效果(无添加)
[饲料的调制]
对于配合饲料(ヒガシマル醤油株式会社制，ノーサン印对虾育成用配合饲料HクルマエビスーパーB)，使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面，制作出无添加饲料。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中的无添加饲料，除此以外，与试验例1同样。将结果示于表1中。
(试验例5)日本对虾的蜕皮促进效果(甘蔗渣水热处理液)
[饲料的调制]
将甘蔗渣调整为干燥重量30％，在高压下在180℃进行10分钟水热处理(高压蒸煮处理)。将所得的甘蔗渣热水处理液，使用1N氢氧化钠调整为pH7。将甘蔗渣热水处理液通过参考例1所记载的方法进行了GPC分子量分析，将所得的结果示于图4中。由该分析结果可知，甘蔗渣的热水处理液按照峰高度高的顺序，包含在分子量3,200、分子量6,000和分子量17,000具有分子量峰的木质素。此外，由GPC分子量分析结果求出的数均分子量为2,870。关于甘蔗渣水热处理液，峰高度最高的有效成分在分子量4,000以下具有峰，该峰高度最高的有效成分与本发明的低分子量木质素、本发明的高分子量木质素不同，但是作为组成，含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素。此外，将该甘蔗渣水热处理液按照参考例2测定了多酚量，结果以儿茶素换算为0.001％(固体成分1.0％，单位固体成分的儿茶素换算为0.1％)。将该甘蔗渣水热处理液以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％混合于配合饲料(ヒガシマル醤油株式会社制，ノーサン印对虾育成用配合饲料HクルマエビスーパーB)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.0002％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例1同样。将结果示于表1中。
[表1]
日本对虾的蜕皮促进效果
| 蜕皮次数 | |
| 试验例1(低分子量木质素+高分子量木质素) | 27 |
| 试验例2(低分子量木质素) | 27 |
| 试验例3(高分子量木质素) | 28 |
| 试验例4(无添加) | 24 |
| 试验例5(甘蔗渣水热处理液) | 24 |
如表1所示那样，可知使用了试验例1～3的含有本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素的饲料的情况与使用了试验例4的无添加饲料的情况相比，日本对虾的蜕皮次数增加。
(试验例6)眼斑双锯鱼的生长促进效果(本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例1中制作的甘蔗渣碱热水提取液(固体成分2％，单位固体成分的儿茶素换算为10％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％喷雾、混合于配合饲料(Feed One社制，アンブローズ400)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.02％，本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素以儿茶素换算为0.0128重量％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。
[生长促进效果的评价]
将体长20±3mm的眼斑双锯鱼以每1水槽为10个体(10个体/20L)在3水槽中评价了含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料的水产生物生长促进效果。将天然过滤海水加温作为海水，使其为约25℃，换水率为1天换水50％。光条件为12小时明、12小时暗，将含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料1次/天在刚熄灯后立即喂食。喂食量设为开始时的眼斑双锯鱼体重比的3％。实施7天试验，在试验结束后回收眼斑双锯鱼并测定了每1个体的平均体重。将结果示于表2中。
(试验例7)眼斑双锯鱼的生长促进效果(本发明的低分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例2中制作的本发明的低分子量木质素液(固体成分1.5％，单位固体成分的儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％喷雾、混合于配合饲料(Feed One社制，アンブローズ400)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.014％，本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素以儿茶素换算为0.007重量％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的含有本发明的低分子量木质素的饲料，除此以外，与试验例6同样。将结果示于表2中。
(试验例8)眼斑双锯鱼的生长促进效果(本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例3中制作的不溶性的本发明的高分子量木质素(固体成分85％，单位固体成分的儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％混合于配合饲料(Feed One社制，アンブローズ400)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.014％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的含有本发明的高分子量木质素的饲料，除此以外，与试验例6同样。将结果示于表2中。
(试验例9)眼斑双锯鱼的生长促进效果(无添加)
[饲料的调制]
对于配合饲料(Feed One社制，アンブローズ400)，使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面，制作出无添加饲料。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中的无添加饲料，除此以外，与试验例6同样。将结果示于表2中。
(试验例10)眼斑双锯鱼的生长促进效果(甘蔗渣水热处理液)
[饲料的调制]
将试验例5中制作的甘蔗渣热水处理液(固体成分1％，单位固体成分的儿茶素换算为0.1％)以溶质的重量基准计以单位饲料干燥重量为0.2％混合于配合饲料(Feed One社制，アンブローズ400)(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.0002％)。进一步使饲料重量的1％的油(日清オイリオ株式会社制，日清色拉油)浸渍在饲料表面。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的含有甘蔗渣水热处理液的饲料，除此以外，与试验例6同样。将结果示于表2中。
[表2]
眼斑双锯鱼的生长促进效果
| 平均体重(g) | |
| 试验例6(低分子量木质素+高分子量木质素) | 0.090 |
| 试验例7(低分子量木质素) | 0.090 |
| 试验例8(高分子量木质素) | 0.092 |
| 试验例9(无添加) | 0.085 |
| 试验例10(甘蔗渣水热处理液) | 0.084 |
如表2所示那样，可知使用了试验例6～8的含有本发明的低分子量木质素和/或本发明的高分子量木质素的饲料的情况与使用了试验例9的无添加饲料的情况相比，眼斑双锯鱼的平均体重增加。
(试验例11)日本对虾的生长促进效果(本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例1中调制的甘蔗渣碱热水提取液(固体成分2％，单位固体成分的儿茶素换算为10％)以溶质的重量基准计在配合饲料(バイオ科学社制，エビコング)造粒时以单位饲料干燥重量为0.2％进行喷雾、混合(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.02％，本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素以儿茶素换算为0.0128重量％)。将制作的饲料作为含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料使用。
[生长促进效果的评价]
将平均体重32.2mg(标准偏差11.3)、平均全长15.5mm(标准偏差1.9)的日本对虾以每1水槽为150尾(1,500尾/m2)对含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料的水产生物生长促进效果进行了评价。在水槽底部不铺底砂，将天然过滤海水加温作为海水，使其为20～25℃，换水率为5次/天。光条件为12小时明、12小时暗，将含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料1天喂食3次。喂食量为虾体重比3～5％，根据摄食状况阶段性地提高喂食量。实施50天试验，测定了该期间中的存活数、平均体重、平均全长。将结果示于表3中。
(试验例12)日本对虾的生长促进效果(本发明的低分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例2中调制的低分子量木质素(固体成分1.5％，单位固体成分的儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计在配合饲料(バイオ科学社制，エビコング)造粒时以单位饲料干燥重量为0.2％进行喷雾、混合(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.014％，本发明的低分子量木质素以儿茶素换算为0.007重量％)。将制作的饲料作为含有本发明的低分子量木质素的饲料使用。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例11同样。将结果示于表3中。
(试验例13)日本对虾的生长促进效果(本发明的高分子量木质素)
[饲料的调制]
将试验例3中调制的含有硅藻土的本发明的高分子量木质素(单位固体成分的多酚量以儿茶素换算为7％)以溶质的重量基准计在配合饲料(バイオ科学社制，エビコング)造粒时以单位饲料干燥重量为0.2％进行喷雾、混合(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.014％)。将制作的饲料作为含有本发明的高分子量木质素的饲料使用。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例11同样。将结果示于表3中。
(试验例14)日本对虾的生长促进效果(无添加)
[饲料的调制]
配合饲料(バイオ科学社制，エビコング)中什么都不添加而造粒，制作出无添加饲料。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中的无添加饲料，除此以外，与试验例11同样。将结果示于表3中。
(试验例15)日本对虾的生长促进效果(甘蔗渣水热处理液)
[饲料的调制]
将试验例5中调制的甘蔗渣水热处理液以溶质的重量基准计在配合饲料(バイオ科学社制，エビコング)造粒时以单位饲料干燥重量为0.2％进行混合(单位饲料干燥重量的儿茶素换算为0.0002％)。
[生长促进效果的评价]
使用本试验例中调制的饲料，除此以外，与试验例11同样。将结果示于表3中。
[表3]
日本对虾的生长促进效果
如表3所示那样，可知使用了试验例11～13的含有本发明的低分子量木质素和本发明的高分子量木质素的饲料、含有本发明的低分子量木质素的饲料、含有本发明的高分子量木质素的饲料的情况与试验例14的无添加饲料相比，日本对虾的存活数、体重、全长增加。
(参考例4)木质素磺酸液的GPC分子量分析
将作为一般的木质素市售品的木质素磺酸(使日本制纸ケミカル社制サンエキスP252以3％溶解于用NaOH调整为pH10的水溶液而得)通过参考例1所记载的方法进行了GPC分子量分析。将结果示于图5中。由该结果确认了，所得的木质素含有在分子量100,000具有峰的木质素，不含有本发明的低分子量木质素、高分子量木质素。此外，数均分子量为39,000。
(参考例5)在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在4,000以下具有分子量峰的木质素的GPC分子量分析
将甘蔗渣1kg(从台糖农产株式会社购入，越南制)以干燥重量计为5wt％添加、混合于0.6(wt/wt)％氢氧化钠水溶液，在180℃下使其反应5分钟，使用6N盐酸将pH调整为7后，用笊篱分离固体，用MF膜(商品名：トレフィルHFS型，東レ社制)进行过滤，制作出甘蔗渣碱水热处理液。将该碱水热处理通过参考例1所记载的方法进行了GPC分子量分析。将分析结果示于图6中。由该分析结果确认了，所得的木质素含有在分子量3,700具有峰的木质素，不含有本发明的低分子量木质素、高分子量木质素。此外，数均分子量为3,300。
Claims (8)
1.一种水产生物生长促进剂，其以低分子量木质素和/或高分子量木质素作为有效成分，所述低分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量4,000～9,500的范围具有分子量峰，所述高分子量木质素在使用了UV检测器的GPC分子量分析中，在波长254nm下，在分子量10,000～40,000的范围具有分子量峰。
2.根据权利要求1所述的水产生物生长促进剂，所述低分子量木质素和/或高分子量木质素来源于甘蔗渣的碱热水提取物。
3.根据权利要求1或2所述的水产生物生长促进剂，其促进甲壳类的蜕皮。
4.一种水产生物生长促进用饲料，其包含所述水产生物生长促进剂。
5.根据权利要求4所述的水产生物生长促进用饲料，其包含以多酚量计按照儿茶素换算为0.007重量％以上的所述低分子量木质素和/或高分子量木质素。
6.一种促进水产生物生长的方法，其中，对水产生物给予所述水产生物生长促进剂。
7.一种促进水产生物生长的方法，其中，对水产生物喂食所述水产生物生长促进用饲料。
8.根据权利要求6或7所述的促进水产生物生长的方法，所述水产生物为甲壳类。
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