CN109867657A - 二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用 - Google Patents
二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109867657A CN109867657A CN201910185790.8A CN201910185790A CN109867657A CN 109867657 A CN109867657 A CN 109867657A CN 201910185790 A CN201910185790 A CN 201910185790A CN 109867657 A CN109867657 A CN 109867657A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- dioxa
- pungent
- cancer
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用，属于化学与药物技术领域。该化合物的结构如式（I）所示：式（I）。该化合物是从地衣红雪茶中分离得到的，体外能显著性杀灭和/或抑制人类多种癌症细胞。体内对小鼠移植性肿瘤的生长具有显著性抑制作用。与临床抗肿瘤药物具有协同或相加联合抗肿瘤作用。体外抗癌作用具有明显的靶向性和选择性。能影响癌细胞的周期分布以及基因表达、信号通路和功能，促进癌细胞凋亡。对动物无明显的毒性，还能显著性减轻顺铂对动物的毒性。式（I）化合物可以作为人类癌症的化学治疗药物，作为其它抗癌药物的联合药物、毒性拮抗药物或保健品进行癌症辅助治疗。
Description
技术领域
本发明属于化学与药物技术领域，涉及二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用，特别是涉及3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸、制备方法及其药用组合物和抗肿瘤的应用。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康和生命安全的一个重大疾病，目前已成为人类的主要死因。据Globocan 2012的数据显示，2012年全球恶性肿瘤发病数达到1410万，死亡820万例；且癌症病例呈现逐年增长趋势，到2035年全球癌症新发病例将达到2400万人。《2012中国肿瘤登记年报》披露，中国2012年新发癌症病例312万，平均每分钟有6人确诊为恶性肿瘤。癌症已成为严重威胁人民健康和生命安全的一个主要卫生问题。
癌症在世界上目前仍是一种难治之症。癌症的化学药物治疗作为全身性治疗措施，在癌症的治疗中占有极重要的地位，也是今后彻底解决癌症治疗问题的希望。
临床上目前使用的癌症化疗药物，大多药物存在毒副作用大、疗效不确定、选择性差、靶向性不强以及癌细胞耐药等许多问题，使癌症化学药物治疗在临床上的应用和效果受到很大限制。因此，开发疗效明确、低毒安全、特别是具有选择性和/或靶向性抗癌作用的化疗药物，是抗癌新药研究的一个重要方向和迫切任务。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用。本发明化合物地衣红雪茶中提取分离得到，该化合物、酯或其盐类可作为抗肿瘤化学治疗药物，或作为抗肿瘤药物活性成分的抗肿瘤药物组合物，或作为联合抗肿瘤药物组合物组分，或作为抗肿瘤药物毒副作用的拮抗药物，以及作为辅助抗肿瘤的保健品，且联合抗肿瘤时，能够减轻抗癌药物毒性，易于推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物，该化合物的结构如式（I）所示：
式（I）。
中文名称：3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸；
英文名称：3-ethoxy-10-formyl-9-hydroxy-4,7-dimethyl-6,12-dioxo -6,12-dihydrodibenzo[b,f][1,5]dioxocine-1-carboxylic acid。
本发明同时提供上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），将地衣红雪茶自然干燥后粉碎，以体积浓度为60%-70%乙醇为提取溶剂进行提取，对提取液浓缩，得到膏状AMH初提物
步骤（2），将AMH初提物和蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第一混悬液；然后将第一混悬液与体积浓度为95%乙醇或无水乙醇混合至乙醇的终体积浓度大于80%，振摇后静置进行醇沉，分离上层乙醇提取物，将乙醇提取物浓缩，得到膏状初级抗癌功效部位AMH-A；
步骤（3），将AMH-A与蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第二混悬液；将第二混悬液中缓慢加入到体积为第二混悬液体积2-3倍的氯仿中，边加边搅拌、振摇，静置后分离氯仿萃取液，浓缩，得抗癌功效部位AMH-D；
步骤（4），将AMH-D依次采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和重结晶的方式进行分离纯化，得到式（I）所示化合物。
每公斤地衣干粉可以分离得到纯度大于99.8%的式（1）化合物A约30-40毫克。
进一步，优选的是，提取时的料液比为1g:4-6mL，提取次数为5-6次。
进一步，优选的是，对步骤（2）中对下层沉淀重复醇沉4-5次，合并上层乙醇提取物；步骤（3）中对水相层反复以氯仿萃取6-8次，合并氯仿萃取液。
本发明所述的醇沉为将下层沉淀与体积浓度为95%乙醇或无水乙醇混合至乙醇的终体积浓度大于80%，振摇后静置进行醇沉，分离上层乙醇提取物；所述水相层反复以氯仿萃取具体为：水相层加入到体积为水相层体积2-3倍的氯仿中边加边搅拌、振摇，静置后分离氯仿萃取液。
本发明还提供一种抗肿瘤的药物组合物，活性成分包括上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐。
本领域所属技术人员根据给药对象和肿瘤类型的情况可以确定组合物中具体的治疗有效量。在一些实施方案中，有效量可以占组合物重量的0.01-99%，优选为0.1-99%，更优选为1-90%。
在其中一些实施例中，该药物组合物的剂型为：注射液、纳米脂质体注射液、粉针剂、片剂、口服液、脂质体口服液、胶囊、颗粒剂或冲剂。
本发明另外提供一种联合抗肿瘤的药物组合物，活性成分包括上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐，还包括5-氟尿嘧啶、紫杉醇、顺铂和环磷酰胺中的至少一种，组合物中各组分比例没有限制，可以根据具体情况自由调节。
联合抗肿瘤药物组合物的剂型为：注射液、粉针剂、片剂、口服液、胶囊、颗粒剂或冲剂。
本发明提供上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为以下人类肿瘤中的任一种：宫颈癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、胆管癌、胰腺癌、鼻咽癌、神经胶质瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肉瘤、前列腺癌。
本发明提供上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在制备抗肿瘤药物的毒性拮抗药物中的应用。
该化合物可单独作为临床抗肿瘤药物毒副作用的拮抗药物的活性成分，还可以与其它抗癌药物以联合药物组合物形式应用。其药物剂型为：注射液、粉针剂、片剂、口服液、胶囊、颗粒剂或冲剂。
本发明提供上述二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在辅助抗肿瘤保健品中的应用。
该辅助抗肿瘤保健品的剂型为：片剂、口服液、胶囊、颗粒剂或冲剂。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸为新结构化学物质，可以从地衣红雪茶中提取分离得到。该化合物、酯或其盐类可作为抗肿瘤化学治疗药物，或作为抗肿瘤药物活性成分的抗肿瘤药物组合物，或作为联合抗肿瘤药物组合物组分，或作为抗肿瘤药物毒副作用的拮抗药物，以及作为辅助抗肿瘤的保健品。
3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸体外能显著性杀灭和/或抑制人类多种肿瘤细胞，如人宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE、人宣威肺癌细胞XWLC-05、人白血病细胞K-562、人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞QGY-7703、人胆管癌细胞QBC-939、人神经胶质瘤细胞U-251、人乳腺癌细胞MCF-7、人前列腺癌细胞PC-3、人膀胱癌细胞T-24、人肾癌细胞ACHN、人肺癌细胞A-549、人肺癌NCI-H460、人肺癌NCI-H157、人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-116、人卵巢癌SKOV-3、人胰腺癌PANC-1等。
本发明化合物体内对balb/c裸鼠移植人类肝癌、人类肺癌、人类胃癌和人类宫颈癌，以及昆明种小鼠和ICR小鼠移植的小鼠肉瘤和小鼠肝癌、C57BL/6J小鼠移植的小鼠肺癌等肿瘤，均具有显著性的生长抑制作用。
本发明化合物与临床使用的抗肿瘤化疗药物如顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、环磷酰胺等在体外和/或体内具有协同或相加联合抗肿瘤作用。
本发明化合物具有细胞靶向性抗癌作用，不同癌细胞株的敏感性差异较大，人类宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞T-24、肾癌细胞ACHN、肺癌细胞A-549、宣威肺癌细胞XWLC-05、肝癌细胞HepG2、胆管癌细胞QBC-939、结肠癌HCT-116、白血病K-562、鼻咽癌细胞CNE、卵巢癌SKOV-3、胰腺癌PANC-1和神经胶质瘤细胞U-251在体外对该化合物非常敏感。
本发明化合物具有选择性抗肿瘤作用，在同等剂量下对肿瘤细胞的杀灭/抑制作用显著性大于对人体正常细胞的杀灭/抑制作用。
本发明化合物能显著性促进肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤细胞生长周期与分化、调节肿瘤细胞的基因表达、影响肿瘤细胞的代谢和抑制肿瘤细胞的增殖。
本发明化合物在有效抗肿瘤剂量下，对小鼠的体重增长、脏器发育、血液生化和血常规指标无显著性影响，或毒性作用显著性低于临床抗肿瘤药物如顺铂、5-氟尿嘧啶的毒性作用。
本发明化合物与顺铂联合应用时还能显著性降低顺铂对动物的毒副作用；该化合物在试验剂量下未显示遗传毒性。
附图说明
图1为式（1）化合物的质谱图；
图2为式（1）化合物的核磁氢谱图；
图3为式（1）化合物的核磁碳谱图和DEPT谱图；
图4为式（1）化合物的核磁二维谱图HMBC；
图5为式（1）化合物的核磁二维谱图HSQC；
图6为式（1）化合物的核磁二维谱图Cosy；
图7为式（1）化合物对不同人类肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的剂量-效应关系曲线图；
图8为式（1）化合物对不同人类肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的剂量-效应关系曲线图；
图9为式（1）化合物体外抗肿瘤作用的时间-效应、剂量-效应关系曲线图；
图10为式（1）化合物体外抗肿瘤作用的时间-效应、剂量-效应关系曲线图；
图11为式（1）化合物对肿瘤细胞和人体正常细胞的体外抑制作用的剂量-效应关系曲线图；
图12为式（1）化合物与DDP体内联合抗XWLC-05肿瘤作用（RTV）；
图13为式（1）化合物与DDP联合抗XWLC-05肿瘤作用（RPR）；
图14为式（1）化合物体内抗HepG2肿瘤作用（RTV）；
图15为式（1）化合物体内抗HepG2肿瘤作用（RPR）；
图16为式（1）化合物体内抗HepG2肿瘤作用（TW）；
图17为式（1）化合物体内抗XWLC-05肿瘤作用（RTV）；
图18为式（1）化合物体内抗XWLC-05肿瘤作用（RPR）；
图19为式（1）化合物体内抗Hela肿瘤作用（RTV）；
图20为式（1）化合物体内抗Hela肿瘤作用（RPR）；
图21为式（1）化合物体内抗Hela肿瘤作用（TW）；
图22为式（1）化合物A对凋亡标志物的影响（Western Blot）；
图23为式（1）化合物A短期重复给药对动物体重影响；
图24为式（1）化合物A短期重复给药对动物脏器发育的影响；
图25为式（1）短期重复联合给药（化合物A+DDP）对动物体重的影响；
图26为式（1）短期重复联合给药（化合物A+DDP）对动物脏器发育的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
术语定义
除非另有说明，本文中所用的术语具有如下含义：
本申请中所述的“药物组合物”指本申请式（1）化合物、酯或其药物可接受的盐，与通常被本领域所接受的将生物活性化合物输送至诸如人类等哺乳动物的介质所形成的制剂。这样的介质包括所有药物可接受的载体。
本申请中所述的“联合抗肿瘤药物组合物”指本申请式（1）化合物、酯或其药物可接受的盐，与临床常用抗肿瘤药物共同组成的抗肿瘤药物。
本申请中所述的“药物可接受的载体”意指包括但不限于已经被美国食品与药品管理局(FDA)认可的、可用于人类或动物的任何佐剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、崩解剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
术语“治疗”意为将本发明所述化合物A、酯或其药物可接受的盐或制剂进行给药，以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；
(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
“酯”系指由化合物羧基与其它含有羟基的有机化合物通过酯化反应形成的酯类化合物。
“药物可接受的盐”指“药物可接受的碱加合盐”。
“药物可接受的碱加合盐”指保持游离酸的生物学有效性和性质的那些盐，所述碱加合盐是在生物学或其它方面合适的、向游离酸中加入无机碱或有机碱来制备这些盐。本申请中，由无机碱衍生的盐是优选的，包括但不限于钠、钾、镁、钙盐等。
术语“毒性拮抗”意为将本发明所述化合物、酯或其药物可接受的盐或制剂进行给药，以降低临床抗癌药物在治疗过程中对病人的毒副作用。
“辅助抗肿瘤保健品”是指在肿瘤病人的治疗过程中，用于肿瘤病人的辅助治疗，可能对肿瘤病人的治疗具有增敏、减毒作用，但不以治疗为目的保健品。
实施例1：式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的提取分离及结构鉴定。
1. 从地衣植物中提取分离
步骤（1），将地衣红雪茶自然干燥后粉碎，以体积浓度为60%-70%乙醇为提取溶剂进行提取，对提取液浓缩，得到膏状AMH初提物
步骤（2），将AMH初提物和蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第一混悬液；然后将第一混悬液与体积浓度为95%乙醇或无水乙醇混合至乙醇的终体积浓度大于80%，振摇后静置进行醇沉，分离上层乙醇提取物，将乙醇提取物浓缩，得到膏状初级抗癌功效部位AMH-A；
步骤（3），将AMH-A与蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第二混悬液；将第二混悬液中缓慢加入到体积为第二混悬液体积2-3倍的氯仿中，边加边搅拌、振摇，静置后分离氯仿萃取液，浓缩，得抗癌功效部位AMH-D；
步骤（4），将AMH-D依次采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和重结晶的方式进行分离纯化，得到式（I）所示化合物。
硅胶柱层析洗脱采用氯仿和甲醇的混溶溶剂进行，比例依次为10:1、5:1、2.5:1，每个比例所用体积为柱体积的3倍；2.5:1洗脱得到的部分浓缩后上凝胶柱层析；
凝胶柱层析采用体积比为1：1的氯仿和甲醇的混溶溶剂，TLC跟踪，将含有本发明化合物的部分合并，浓缩，之后再进行重结晶；
重结晶采用的溶剂为氯仿与甲醇的混合溶剂，体积比为5:1。
每公斤地衣干粉可以分离得到纯度大于99.8%的式（1）化合物A约30-40毫克。
2.结构鉴定
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的质谱图（如图1所示），溶剂采用氘代DMSO；
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的核磁氢谱图（如图2所示），溶剂采用氘代DMSO；
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的核磁碳谱图和DEPT谱图（如图3所示）。
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的二维谱图HMBC谱图（如图4所示）。
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的二维谱图HSQC谱图（如图5所示）。
化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的Cosy谱图（如图6所示）。
由图1~图6的数据分析可知，该化合物为3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸。
实施例2：式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的抗肿瘤作用、联合抗肿瘤作用、毒理学安全性和抗肿瘤作用机理的生物学实验结果
下面通过部分具体实验例证来说明本发明的式（1）化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸（以下图表中以A表示，下同）具有显著性、选择性、细胞靶向性抗肿瘤作用，以及与临床抗肿瘤药物的联合抗肿瘤作用、其毒理学安全性和抗肿瘤作用机理。
1. 化合物A体外抑制和杀灭人类癌细胞作用：
体外抗肿瘤试验方法：化合物A以分析纯DMSO溶解，按最终浓度为0、1、2、4、8、16µg/ml（或0、2.5、5、10、20、30、40µg/ml）进行体外抗肿瘤试验。收集对数生长期人类癌细胞，以DMEM/F12完全培养液混悬后接种于96孔板，每孔加入200µl细胞悬液，每浓度、每测定时间点做8个平行复孔。37℃、5%CO2培养箱培养24小时后，收集1个96孔板测定0小时MTT的OD值；吸去其余培养板的培养液，然后按设计分别加入含有相应浓度化合物A的培养液200µl，同时设DMSO溶剂对照和抗癌药物顺铂（DDP）阳性对照，每浓度及对照组做3组平行。细胞在加药后放37℃、5%CO2培养箱继续培养，于加药后24h、48h、72h，分别收集一组细胞，采用MTT法测定每孔的OD值，绘制不同时间、不同剂量下细胞生长曲线，测定化合物A体外抗癌作用的时间-效应和每个时间点的剂量-效应关系。也可以只测定药物作用72小时后的剂量-效应关系。按下式计算癌细胞的生长抑制率：
抑制率（%）=（溶剂对照孔校正OD值-化合物A组的校正OD值）/溶剂对照组校正OD值×100
校正OD值 = 实际测量的OD值-无细胞空白对照组的OD值
结果：式（1）化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸对人类癌细胞株如人宫颈癌细胞Hela、人鼻咽癌细胞CNE、人肺癌细胞A-549、人宣威肺癌细胞XWLC-05、人肺癌NCI-H460、人肺癌NCI-H157、人白血病细胞K-562、人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞QGY-7703、人胆管癌细胞QBC-939、人神经胶质瘤细胞U-251、人乳腺癌细胞MCF-7、人前列腺癌细胞PC-3、人膀胱癌细胞T-24、人肾癌细胞ACHN、人结肠癌细胞HCT-116等均具有显著性体外抗癌作用，其体外抗癌作用具有明显的剂量-效应和/或时间-效应关系，随着剂量的增加和/或药物处理时间的延长，其体外抗肿瘤作用增强。在体外抗癌活性筛选试验中，式（1）化合物处理癌细胞72小时后，在显微镜下见对人胃癌细胞SGC-7901、人卵巢癌细胞SKOV-3、人胰腺癌PANC-1等具有明显体外抑制或杀灭作用。本发明化合物A对部分癌细胞的体外抗癌剂量-效应关系见图7和图8、时间-效应与剂量-效应关系结果见图9和图10。
化合物A对不同癌细胞株的抑制率存在显著性差异，大多数人类癌细胞对化合物A很敏感，化合物A的体外抗癌作用具有细胞选择性。人类宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞T-24、肾癌细胞ACHN、肺癌细胞A-549、宣威肺癌细胞XWLC-05、肝癌细胞HepG2、胆管癌细胞QBC-939、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌HCT-116、白血病K-562、鼻咽癌细胞CNE、胃癌细胞SGC-7901、卵巢癌SKOV-3、胰腺癌PANC-1和神经胶质瘤细胞U-251在体外对化合物A非常敏感，而前列腺癌PC-3、肺癌NCI-H460、肺癌NCI-H157、肝癌QGY-7703对化合物A敏感性较差。药物处理72小时，化合物A对Hela、CNE、XWLC-05、K-562、HepG2、QBC-939、U-251、MCF-7、T-24、ACHN、A-549、HCT-116 、QGY-7703、NCI-H157、NCI-H460和PC-3的IC50(半数抑制浓度)分别为5.07、5.88、3.01、9.80、4.50、5.25、9.05、4.76、2.96、2.61、3.41、8.25、14.20、16.70、17.27和>20.00μg/ml。
2. 选择性抗癌作用
体外细胞培养试验发现，化合物A在同等的剂量和试验条件下，对人正常血管内皮细胞株HUVEC、肺上皮细胞株Beas-2b的生长抑制/杀灭作用显著性低于对许多人类癌细胞株的生长抑制/杀灭作用，化合物A对HUVEC和Beas-2b的IC50(半数抑制浓度)分别为39.58μg/ml和16.95μg/ml，远远大于对大多数人类癌细胞的半数抑制浓度（见图11）。
3.细胞靶向性抗癌作用
体外抗癌试验结果表明，不同人类癌细胞株对化合物A的敏感性存在显著性差异，不同癌细胞的IC50(半数抑制浓度)差异较大，化合物A具有细胞靶向性抗癌作用，结果见图7和图8。
在已检测的人类癌细胞株中，人类宫颈癌细胞Hela、膀胱癌细胞T-24、肾癌细胞ACHN、宣威肺癌细胞XWLC-05、乳腺癌MCF-7、肺癌A-549、肝癌HepG2、胆管癌细胞QBC-939、结肠癌HCT-116、白血病K-562、鼻咽癌细胞CNE、神经胶质瘤细胞U-251、胃癌细胞SGC-7901、卵巢癌细胞SKOV-3和胰腺癌细胞PANC-1对化合物A非常敏感（IC50<10μg/ml），而人前列腺癌PC-3、肺癌细胞NCI-H460、肺癌细胞NCI-H157、肝癌QGY-7703对化合物A敏感较差（IC50>10μg/ml）。
4.对临床抗癌药物的增敏作用
4.1 体外联合抗癌作用
体外联合抗癌试验：试验方法同体外抗肿瘤试验方法，区别在于在给药时同时给予本发明的化合物A和临床抗癌药物。
结果显示，化合物A与紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂联合用药，对某些癌细胞株具有相加抑制和/或杀灭作用，化合物A可以作为临床抗癌药物的增敏药物。例如，联合应用对人肺癌A-549的体外抑制作用见表1，对宫颈癌Hela的体外作用见表2。
表1. 化合物A与临床抗癌药物联合应用对A-549的抑制作用（抑制率，%）
注：紫杉醇浓度为0.5μm，5-氟尿嘧啶浓度为10μm，顺铂浓度为5μm；括号内为联合作用Q值。
表2. 化合物A与临床抗癌药物联合应用对Hela的抑制作用（抑制率，%）
注：紫杉醇浓度为0.5μm，5-氟尿嘧啶浓度为10μm，顺铂浓度为5μm；括号内为联合作用Q值。
4.2 体内联合抗癌作用：试验方法同裸鼠体内抗移植性人类肿瘤试验方法，区别在于联合作用组在给药时，先腹腔注射给予本发明化合物A，30分钟后再腹腔注射给予联合使用的临床抗癌药物顺铂或环磷酰胺。
化合物A（10mg/kg）与临床抗癌药物顺铂（5mg/kg）联合使用时，对动物移植性肿瘤如宣威肺癌具有明显的体内协同抗肿瘤作用，结果见图12、图13。在小鼠体内抗S-180肉瘤试验中，化合物A（10mg/kg）与环磷酰胺（40mg/kg）联合用药时，联合用药组接种的肿瘤几乎无生长，具有很强的联合协同抗肿瘤作用。
5. 化合物A抑制小鼠体内移植性肿瘤生长作用
5.1 裸鼠体内抗移植性人类肿瘤试验方法：采用细胞培养制备人类癌细胞样品，用无菌、无FBS的DMEM/F12培养液调整细胞浓度。对经适应性饲养1周的balb/c裸鼠（体重18-20g），每只在右侧背部皮下无菌操作接种细胞悬液0.1ml。裸鼠饲养在SPF实验室。接种细胞后的第12天，大部分小鼠皮下出现肉眼可见肿瘤、肿瘤平均体积达100-300mm3左右，用自动读数的游标卡尺测量每只荷瘤小鼠肿瘤的长径(a)和横径(b)，采用公式：V=a×b2/2计算每只小鼠的肿瘤体积。将荷瘤小鼠按照肿瘤体积分层后随机分为溶剂对照组、抗癌药物阳性对照组和不同剂量化合物A试验组，每组5-8只荷瘤小鼠。化合物A以体积百分数10%质谱纯DMSO、体积百分数15% Cremophor EL和体积百分数75% PBS为溶剂配制，小鼠给药剂量为20mg/kg (HepG2肿瘤)，或剂量为10、20、30mg/kg（XWLC-05）或剂量为50mg/kg（Hela肿瘤），对照组小鼠给予同等体积的溶剂。小鼠从分组当天开始腹腔注射给药，隔天给药1次，每4天测定1次肿瘤体积和体重。给药10-16次后，测小鼠体重，将小鼠取血后脱臼处死，测量肿瘤体积，完整剥离肿瘤、肝、脾、肾、心和睾丸，以精密电子秤测定肿瘤和各脏器重量。
按照下式计算各时间点的肿瘤相对增值率（%）：相对增值率(%) =TRTV/CRTV×100,TRTV为给药组肿瘤相对体积，CRTV为溶剂对照组肿瘤相对体积；RTV=Vt/V0, V0为分组给药时的肿瘤体积，Vt为每一次测量时肿瘤体积。
按照下式计算肿瘤重量抑制率：抑制率(%)= (溶剂对照组平均肿瘤重量-给药组平均肿瘤重量)/溶剂对照组平均肿瘤重量×100%
按照下式计算各脏器系数：脏器系数=脏器重量/体重×100%
5.1.1 对人类肝癌HepG2的体内生长抑制作用
各时间点的肝癌HepG2肿瘤相对体积（RTV）见图14。各时间点的肝癌HepG2肿瘤相对增殖率（RPR）见图15。试验结束时各组的HepG2肿瘤重量（TW）见图16。
结果显示，试验结束时，本发明化合物A组的RTV为7.15，而溶剂对照组RTV为13.85；化合物A组的RPR在给药4次后（给药第8天）即开始低于60%，实验结束时RPR为51.61%。试验结束时，共给药给药16次（第32天），化合物A组的平均肿瘤重量为0.9520g，为溶剂对照组（1.6298g）的58.41%。本发明的化合物A显示明显的体内抑制肝癌HepG2生长作用。
5.1.2 对人类宣威肺癌XWLC-05的体内生长抑制作用
各时间点的肝癌XWLC-05肿瘤相对体积（RTV）见图17。各时间点的肝癌XWLC-05肿瘤相对增殖率（RPR）见图18。
在裸鼠体内抗肺癌试验中，本发明化合物设置了10mg/kg（A1）、20mg/kg（A2）和30mg/kg（A3）体重三个剂量组，DDP的剂量为5mg/kg。试验结束时，A1、A2、A3组的RTV分别为6.37、7.01和6.46，低于溶剂对照组的7.70；RPR分别为71.46%、70.04%和68.95%，低于溶剂对照组的100%；肿瘤重量分别为1.2130g、1.3331g和1.3106g，低于溶剂对照组的1.4147g。统计分析和新药判断标准看，本发明化合物对人类的宣威肺癌（XWLC-05）的生长，尽管出现抑制作用，但没有达到体内抗癌活性标准。
5.1.3 对人类宫颈癌Hela的体内生长抑制作用
各时间点的肝癌Hela肿瘤相对体积（RTV）见图19。各时间点的肝癌Hela肿瘤相对增殖率（RPR）见图20。试验结束时各组的Hela肿瘤重量（TW）见图21。
结果显示，本发明化合物A组在给药12次后的肿瘤体积为496.19mm3，溶剂对照组的肿瘤体积为844.18mm3；化合物A组的RTV为5.82，溶剂对照组为8.72；化合物A组的RTV只有对照组的66.73%，其中在给药第10次时的RPR只有对照组的53.86%。结果显示，化合物A组对裸鼠移植人类宫颈癌Hela具有体内抗癌作用。
5.2 体内抗移植性动物肿瘤试验方法：将动物肿瘤细胞（S-180、H-22、3ll）接种于小鼠腹腔，约5天后见形成明显的腹水，以无菌操作抽取白色米汤状腹水，以生理盐水稀释成1×108细胞/ml，每只小鼠右侧腋下接种0.1ml。小鼠随后按照体重进行随机分组，每组小鼠6-8只，第二天开始腹腔注射给药（阴性对照组给予等量的溶剂），每天给药一次，剂量为20mg/kg，连续给药7-10天。实验结束时，脱臼处死动物，小心剥离每只肿瘤并称重，统计分析每组动物的肿瘤重量差异。
结果：化合物A能显著性抑制小鼠S-180、H-22和3ll的生长，并与环磷酰胺具有明显的体内协同抗肿瘤作用。
实施例3：式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸抗癌作用机制
1.促进癌细胞凋亡作用
采用Western Blot检测发现，式（1）化合物A能明显促进癌细胞凋亡标志物CleavedPARP的形成，结果见图22。
2.对癌细胞生长周期的影响
实验方法：肝癌细胞HepG2经式（1）化合物A处理48h后，采用流式细胞仪(FACS)检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果见表5。
结果：式（1）化合物A能明显影响癌细胞的分化和周期,阻滞细胞于G1期，减少分裂期S期细胞。
表3. 对细胞周期的影响（FCM，HepG2）
3.对癌细胞的基因表达影响
MCF-7细胞药物处理48h后的基因芯片检测结果表明，式（1）化合物A能显著性影响MCF-7癌细胞的基因表达，上调40个mRNA（最大值2.31倍）、下调31个mRNA（最大值-2.71倍）；上调118个ncRNA（最大值3.39倍）、下调567个ncRNA（最大值-3.56倍）。式（1）化合物A能显著性影响10条细胞信号通路。能显著性影响癌细胞的50个功能和癌细胞的多项代谢。
实施例4：式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸的毒理学安全性
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物肝微粒体酶试验（Ames试验）检测表明，式（1）化合物A在2mg/皿的剂量下未见致突变作用。未发现式（1）化合物A对动物有明显的急性毒性；短期重复剂量给药试验中，化合物A在试验剂量下对动物的造血系统、肝功能、肾功能无明显影响（见表6、表7），对动物体重增长和主要脏器发育无明显影响（见图23、图24）。
表4. 血液生化指标
*:与溶剂对照组比较p<0.05
表5. 血液常规指标
实施例5：式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸拮抗抗癌药物对动物的毒性作用
在进行化合物A与DDP的体内联合抗癌试验中，DDP组在剂量为5mg/kg，小鼠出现极度消瘦、皮肤粗糙、不活跃，并在试验后期出现个别死亡；而DDP（剂量5mg/kg）与化合物A（剂量10mg/kg）联合用药组小鼠生长良好、动物活泼、皮肤红润、无动物死亡。联合用药中，化合物A能明显减轻抗癌药物顺铂对动物的毒性作用（见图25、图26），联合用药组动物的体重显著性高于DDP阳性药物组。化合物A不影响动物的肝肾功能等血液生化指标和血常规指标，反而能显著性增加小鼠血液总蛋白和白蛋白的水平（见表6）。
实施例6
式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸与碳酸氢钠在加热条件下进行中和反应，然后用稀盐酸调PH值至7.0-7.5，加热、蒸发、结晶即形成式（1）化合物的钠盐，能溶于水。式（1）化合物也能与其它碱性离子或基团形成盐类。
实施例7
式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸与氢氧化钠水溶液能在室温下快速发生化学反应而形成水溶性物质，该物质用稀盐酸调PH值至3.0以下即形成不溶于水的新化合物A’，采用滤纸过滤、用蒸馏水洗涤，可以得到化合物A’。化合物A’极易溶于甲醇并形成无色结晶。式（1）化合物也能与其它碱性离子或基团形成盐类。
实施例8
式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸，以少量DMSO溶解后，加入蓖麻油聚氧乙烯醚或药物允许的其它助溶剂混悬，再加入生理盐水精滤，灌封灭菌制成注射液。DMSO：蓖麻油聚氧乙烯醚：生理盐水的体积比为10:15:75。
实施例9
式（1）所示化合物3-乙氧基-10-醛基-9-羟基-4,7-二甲基-6,12-二氧-6,12-二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环-1-羧酸200mg，以20ml氯仿或乙酸乙酯等有机溶剂溶解后，加入大豆磷脂2-4.8g、胆固醇0.2-0.8g，加入聚乙二醇0-1.2g，振摇溶解。然后在60℃水浴下旋转蒸发，去除有机溶剂，使化合物A、大豆磷脂、胆固醇和聚乙二醇在旋蒸瓶壁形成薄膜。加入40ml PBS缓冲溶液，继续旋转洗膜30-60分钟，然后在超声洗涤器超声30-60分钟，再采用强力超声破碎机超声处理5-10分钟即形成药物脂质体。
上述药物脂质体可以做成脂质体口服液或饮料。
上述药物脂质体冷冻干燥成粉状后可以制成片剂、颗粒剂、胶囊等药物制剂。
上述脂质体以1000nm滤头过滤，滤液即为纳米脂质体口服液。
上述脂质体以220nm无菌滤头过滤，滤液即为纳米脂质体注射液。
实施例10
式（1）化合物的盐类，按常规加注射用水溶解，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例11
式（1）化合物的盐类，以乙醇、甲醇或蒸馏水溶解后，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于消毒的安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例12
式（1）化合物、酯或其盐类，按制剂需要的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例13
式（1）化合物、酯或其盐类，按制剂需要的比例加入赋形剂，制粒压片制成片剂。
实施例14
式（1）化合物、酯或其盐类，按常规口服液制法制成口服液。
实施例15
式（1）化合物、酯或其盐类，按制剂需要的比例加入赋形剂，制成胶囊、或颗粒剂、或冲剂。
实施例16
式（1）化合物、酯或其盐类，按产品需要的比例加入食品或其它载体，制成保健品或其它功能性用品。
实施例17
式（1）化合物、酯或其盐类，按治疗需要，与其它抗肿瘤药物按比例混合，制成各种制剂，形成联合抗肿瘤药物组合物。与其它临床抗肿瘤药物同时或分别应用，可以减轻临床抗肿瘤药物的毒性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物，其特征在于，该化合物的结构如式（I）所示：
式（I）。
2.权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），将地衣红雪茶自然干燥后粉碎，以体积浓度为60%-70%乙醇为提取溶剂进行提取，对提取液浓缩，得到膏状AMH初提物
步骤（2），将AMH初提物和蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第一混悬液；然后将第一混悬液与体积浓度为95%乙醇或无水乙醇混合至乙醇的终体积浓度大于80%，振摇后静置进行醇沉，分离上层乙醇提取物，将乙醇提取物浓缩，得到膏状初级抗癌功效部位AMH-A；
步骤（3），将AMH-A与蒸馏水按体积比为1:1混匀，得到第二混悬液；将第二混悬液中加入到体积为第二混悬液体积2-3倍的氯仿中，边加边搅拌、振摇，静置后分离氯仿萃取液，浓缩，得抗癌功效部位AMH-D；
步骤（4），将AMH-D依次采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和重结晶的方式进行分离纯化，得到式（I）所示化合物。
3.根据权利要求2所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物的制备方法，其特征在于，提取时的料液比为1g:4-6mL，提取次数为5-6次。
4.根据权利要求2所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物的制备方法，其特征在于，对步骤（2）中对下层沉淀重复醇沉4-5次，合并上层乙醇提取物；步骤（3）中对水相层反复以氯仿萃取6-8次，合并氯仿萃取液。
5.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，药物组合物的剂型为注射液、粉针剂、片剂、口服液、胶囊、颗粒剂或冲剂。
7.一种联合抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐，还包括5-氟尿嘧啶、紫杉醇、顺铂和环磷酰胺中的至少一种。
8.权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在制备抗肿瘤药物的毒性拮抗药物中的应用。
10.权利要求1所述的二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、酯或其药物可接受的盐在辅助抗肿瘤保健品中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811420247 | 2018-11-26 | ||
| CN2018114202473 | 2018-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109867657A true CN109867657A (zh) | 2019-06-11 |
| CN109867657B CN109867657B (zh) | 2021-04-09 |
Family
ID=66920231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910185790.8A Expired - Fee Related CN109867657B (zh) | 2018-11-26 | 2019-03-12 | 二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109867657B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107519216A (zh) * | 2017-09-12 | 2017-12-29 | 昆明医科大学 | 红雪茶抗肿瘤活性部位及其制备方法与应用 |
| CN107519215A (zh) * | 2017-09-12 | 2017-12-29 | 昆明医科大学 | 红雪茶抗突变和预防肿瘤活性部位及其制备方法与应用 |
-
2019
- 2019-03-12 CN CN201910185790.8A patent/CN109867657B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107519216A (zh) * | 2017-09-12 | 2017-12-29 | 昆明医科大学 | 红雪茶抗肿瘤活性部位及其制备方法与应用 |
| CN107519215A (zh) * | 2017-09-12 | 2017-12-29 | 昆明医科大学 | 红雪茶抗突变和预防肿瘤活性部位及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡松杉等: "提取方法对地衣提取物抗肿瘤活性的影响", 《天然产物研究与开发》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109867657B (zh) | 2021-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102375444B1 (ko) | 종양을 치료 및/또는 예방하는 약물 제조에서 이소발레릴 스피라마이신i, ii 및/또는 iii의 응용 및 약물 | |
| CN106963769B (zh) | 含pi3k抑制剂和perk抑制剂的药物组合物及其应用 | |
| CN103179967A (zh) | 抗肿瘤药物组合物 | |
| CN103877101A (zh) | 葫芦素在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| WO2017008597A1 (zh) | 一种抑瘤功能茶树良种的选育方法 | |
| CN101940569B (zh) | 含有索拉非尼和青蒿素及青蒿素类衍生物的药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用 | |
| CN110041342A (zh) | 一种含硒化合物及其用途 | |
| CN107286123B (zh) | 一种二苯呋喃类化合物的制备方法与应用 | |
| CN102908340B (zh) | 一种含异甘草黄酮醇的抗肿瘤药物及其应用 | |
| CN102688489B (zh) | 含有雷公藤甲素及雷公藤甲素类衍生物和Bcl-2抑制剂的药物组合物及其应用 | |
| CN111437274A (zh) | 治疗癌症的组合物及应用 | |
| CN107759538B (zh) | 2,3-环氧-2-壬砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌及其制备方法和含其的药物 | |
| CN106748939A (zh) | 一类新型溴酚氨基硫脲类化合物及其制备和药物与用途 | |
| CN106317033A (zh) | 一种水飞蓟宾23‑取代衍生物及其注射剂的制备方法和用途 | |
| CN109867657A (zh) | 二羟二苯并[b,f][1,5]二氧杂辛环类化合物、制备方法及其药用组合物和应用 | |
| CN103483187B (zh) | 4-乙氧基-2-羟基-6-甲基苯甲酸及其药用组合物和应用 | |
| CN101134768A (zh) | 一种葫芦素原料的精制方法及其制剂 | |
| CN111393278B (zh) | 一种长松萝衍生物及其在制备治疗胆囊癌药物中的用途 | |
| CN106727617B (zh) | 一种抗癌药物组合物的纳米制剂和制备方法及其在治疗恶性肿瘤中的应用 | |
| CN107793380B (zh) | 2,3-环氧-2-丙砜-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌及其制备方法和含其的药物 | |
| CN107412736B (zh) | 一种抗肿瘤联合用药物及其在制备抗癌药物中的用途 | |
| CN107519216A (zh) | 红雪茶抗肿瘤活性部位及其制备方法与应用 | |
| CN109705183A (zh) | 臭七次生代谢物及其药物组合物与其制备方法和其应用 | |
| CN108125997A (zh) | 刺山柑乙酸乙酯部位在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN106581012B (zh) | 一种抗癌药物组合物及其制剂和制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210409 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |