CN109852674A

CN109852674A - 基于随机扩增标记和原位合成微流体芯片的水产病原微生物检测方法

Info

Publication number: CN109852674A
Application number: CN201910062234.1A
Authority: CN
Inventors: 冯俊丽; 汪艺; 朱勤超
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2039-01-23
Also published as: CN109852674B

Abstract

本发明公开了一种原位合成微流体芯片，为895条寡核苷酸探针，包含42条阳性/阴性对照探针，具体如表1所述。本发明还同时提供了利用上述原位合成微流体芯片进行的水产病原微生物检测方法，包括以下步骤：制备寡聚核苷酸芯片；随机扩增法标记病原微生物基因片段；芯片杂交；根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。本发明利用该芯片的高通量检测能力，和随机扩增法简便、高效的特性，对我国水产养殖动物的主要病原微生物的保守基因和变异基因片段进行快速平行检测。

Description

基于随机扩增标记和原位合成微流体芯片的水产病原微生物检测方法

技术领域

本发明涉及水产病原微生物的检测和鉴定方法，尤其涉及利用随机扩增标记法和原位合成微流体芯片技术检测水产病原微生物的方法。

背景技术

近年来,我国渔业生产取得了迅猛发展，在农业产值中所占的比重稳步上升，已成为现代农业的四大支柱产业(粮食、肉类、水产和禽蛋)之一。水产养殖业也呈现出养殖规模和养殖技术的空前提高，尤其在集约化养殖和工厂化养殖方面发展迅速。但在目前高密度化、集约化、多品种混养的养殖环境和模式下，各种水产养殖动物病害频发,给养殖者造成了重大损失，已成为制约该产业健康、持续、快速、稳定发展的重要因素之一。例如，根据《2016年浙江省水产养殖病害形式分析》报告，2016年浙江省全省21个水产养殖监测品种中有18个品种全部发病，病害种类达60种，其中包括病毒性疾病5种、细菌性疾病24种、真菌性疾病3种、寄生虫性疾病12种、非生物源病害16种，造成5000万元以上的直接经济损失，这还不包括因为病害威胁导致的生产收缩和产品质量安全下降所带来的损失。

水产病害的频发导致渔药滥用问题突出，这不但使水产品的质量安全受到严重的影响，也造成了更为严重的环境污染问题。此外，还导致病原细菌、病毒的变异和重组几率大大增加，以及新的生物源性病害出现。例如，近年对虾养殖过程中比较严重的“偷死症”(“死底症”)曾造成2010年华南地区南美白对虾养殖业20年来最严重的灾难(死亡率达80％以上)，然而到现在人们尚不明确其病因，比较流行的说法是弧菌感染、新病毒的爆发或养殖水环境的恶化。这反映了目前所用的传统病原微生物分离培养及症状观察，已难以满足实际生产需要。并且针对单一(或少数)病原的检测和诊断不能全面反映病害发生的原因和状况，不利于制定有效的防治措施。

及时、准确、高效的监测病原微生物的种类、了解其流行和分布特征是有效控制养殖动物的病害传播、针对性的安全合理用药的首要条件。随着分子生物学相关学科的迅速发展，越来越多的病原微生物基因序列得到测定，水产病害相关领域数据库的信息量迅速增加，使基因芯片在水产动物病毒诊断领域的应用基础已经完全具备，为解决上述问题提供了新思路。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种原位合成微流体芯片，以及一种基于随机扩增法的病原基因片段扩增和标记方法。本发明利用该芯片的高通量检测能力，和随机扩增法简便、高效的特性，对我国水产养殖动物的主要病原微生物的保守基因和变异基因片段进行快速平行检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种原位合成微流体芯片，为895条寡核苷酸探针，包含42条阳性/阴性对照探针，具体如《权利要求书》的表1所述；

本发明还同时提供了利用上述原位合成微流体芯片进行的水产病原微生物检测方法，包括以下步骤：

1)、制备寡聚核苷酸芯片(如表1所述)；

2)、随机扩增法标记病原微生物基因片段；

3)、芯片杂交；

4)、根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。

作为本发明的水产病原微生物检测方法的改进，步骤2)包括以下步骤：

①、取水产样品(包括鱼、虾)0.2g，提取总DNA和总RNA(可利用商品化的试剂盒(DNAiso/RNAiso Reagent kit)分别提取)；

②、总RNA利用反转录试剂盒(PrimeScript ^TMⅡ1st strand cDNA synthesiskit)合成第一链cDNA，并利用ssDNA连接酶连接环化(CircLigase II ssDNALigase kit)；

③、所得的环化产物经清洁回收后(MiniBEST DNAfragment purification kit)，用phi29聚合酶30℃随机等温扩增2h，扩增所用的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN-3′；

④、扩增产物随即进行第二轮PCR反应，PCR反应的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATC-3′，反应体系中设定Cy3标记的dCTP(即，以Cy3标记的dCTP代替普通dCT P)，以此对产物进行Cy3荧光标记；

⑤、带Cy3荧光标记的第二轮PCR产物经DNase I消化，并剪切为50-500bp的小片段(以便进行后续的杂交反应)。

作为本发明的水产病原微生物检测方法的进一步改进，步骤3)为：

将Cy3标记的病原微生物基因片段与杂交缓冲液等体积混合，95℃变性5min后迅速置于冰上预冷3min；再加入到进样管中，32℃，双向循环杂交2-4h，流速为500μL/min；

杂交结束后，用Wash buffer 40℃循环清洗(循环清洗20min，速度为100μL/min)；

循环清洗结束后，取出芯片，以Microarry Scanner Genepix 4000B扫描，扫描分辨率为10μm，波长为532nm，读取扫描结果，保存图片；

所述杂交缓冲液为6×SSPE，25％甲酰胺，pH 6.6-6.8；

即，杂交缓冲液的配制方法为：在100μl的6×SSPE缓冲液中加入25μl甲酰胺，然后调节pH值至6.6-6.8；

所述Wash buffer(洗脱缓冲液)为：500μL杂交缓冲液,480μL H₂O,20μL 10％SDS；

即，Wash buffer(洗脱缓冲液)的配制方法为：500μl杂交缓冲液中加入20μl质量浓度为10％的SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液，H₂O定容至1mL。

作为本发明的水产病原微生物检测方法的进一步改进，步骤4)为：

用芯片分析软件(Array-Pro image analysis)获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

最后根据各个检测基因、参照基因以及芯片质控探针的信号值，分析芯片杂交结果的可信度，判断该检测样品中是否含有水产病原微生物，以及病原微生物的种类。

每条探针设置4个重复；

针对每个检测基因，当有3条以上的探针信号强度超过500、而且4个重复之间的信号标准差小于50％时，判定该基因被检出；当针对同一病原微生物的多个基因(至少一个)被检出，认为该病原微生物存在于样品。

在本发明中，当芯片质控探针、阳性/阴性对照探针杂交结果正确(即，满足质控探针杂交结果正确，阳性对照探针杂交信号强，阴性对照探针杂交信号弱或无杂交信号)，我们认为杂交过程操作无误、芯片结果可信。

阳性信号需要满足以下2个要求：(1)信号强度高于背景强度的3倍；(2)4个重复点之间的信号值标准差小于50％；

本发明的设计思路，包括以下步骤：

1)、水产病原微生物品种鉴定标记基因的筛选；

2)、病原微生物检测芯片探针的设计和寡聚核苷酸芯片的制备；

3)、随机扩增法标记病原微生物基因片段；

4)、芯片杂交；

5)、根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。

水产病原微生物品种鉴定标记基因的筛选方法为：根据已发表文献、NCBI数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/收集得到目前已公开报道的水产病原微生物鉴定标记基因信息。分析发现：鳗弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、费氏弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、拟态弧菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、铜绿假单胞菌是养殖鱼类主要细菌性病原。淋巴囊肿病毒、虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、草鱼出血热病毒、对虾白斑症病毒、对虾杆状病毒、桃拉综合症病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、肝胰脏细小病毒和传染性肌肉坏死病毒是养殖鱼、虾类主要病毒性病原。

16S rRNA基因序列常用于细菌的种属鉴定，但由于弧菌存在16S rRNA基因多拷贝现象，导致其在种属鉴定的应用上存在局限性和不确定性。管家基因如gyrB、recA和dnaJ在鉴定近缘弧菌种属方面的表现更具优势。因此，在分析以上病原微生物相关基因的基础上，结合文献报道，选择gyrB、recA和dnaJ基因作为水产致病弧菌的种属鉴定标记基因，16SrRNA和gyrB作为气单胞菌和假单胞菌的种属鉴定标记基因。对于病毒性病原，分别选择病毒特异性的衣壳蛋白基因、核蛋白基因、氨基酸跨膜转运蛋白基因作为鉴定标记基因。

所述病原微生物检测芯片探针的设计和寡聚核苷酸芯片的制备为：下载上述基因序列信息，利用DNAStar,BioEdit,CLASTW等软件进行序列比对分析后，选择合适区段作为模板，利用Array Designer 2(PREMIER Biosoft)、Primer 5.0、Primer Express等软件设计并筛选互补的寡核苷酸杂交探针；探针长度约为20-40nt，GC含量40～60％，自身无二级结构。共设计合成了895条寡核苷酸探针(详见表1)，具体针对鳗弧菌54条、副溶血性弧菌56条、溶藻弧菌59条、哈维氏弧菌53条、费氏弧菌56条、霍乱弧菌56条、创伤弧菌61条、河流弧菌55条、拟态弧菌56条、嗜水气单胞菌32条、豚鼠气单胞菌34条、温和气单胞菌34条、铜绿假单胞菌32条、淋巴囊肿病毒18条、大黄鱼虹彩病毒20条、褐点石斑鱼虹彩病毒20条、传染性脾肾坏死病毒15条、草鱼出血热病毒20条、对虾白斑症病毒20条、对虾杆状病毒20条、桃拉综合症病毒21条、传染性皮下及造血组织坏死病毒20条、传染性肌肉坏死病毒20条、和虾黄头病毒21条。并包含24条阳性对照探针(虾激动蛋白基因探针10条，细胞色素C氧化酶基因探针10条和细菌16S rRNA基因片段通用探针4条)；以及18条阴性对照探针(特异性靶向苜蓿基因组的10条探针，人乳头瘤病毒5条探针，和无靶标探针序列3条)。探针委托美国Atactic公司采用μParaflo^TM技术在31×128矩阵的微流体芯片上原位合成，每条探针重复4次。

寡聚核苷酸芯片的制备过程是在醛基化修饰玻片上，依次合成化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列。然后对合成好的芯片在芯片扫描仪(如GenePix 4000B,MolecularDevice)上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；当本底信号强度小于100，认为芯片符合要求。

与现有技术相比，本发明根据水产养殖动物的主要病原微生物的种属鉴定标记基因序列信息设计了寡聚核苷酸探针，并用随机扩增法对病原基因片段进行扩增和标记，以实现在一张芯片上同时检测多种水产病原微生物的存在情况。该试验体系可用于有效掌控水产病原微生物的流行、变异和重组情况，及时发现和确定新出现的病原类型，为病害发生提供早期预警资料，为我国水产养殖业的健康稳步发展提供技术保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为探针在芯片上的排列示意图；

图2为利用随机扩增标记和原位合成微流体芯片对“养殖大黄鱼”1#样品中水产病原微生物的杂交检测结果；

图3为利用随机扩增标记和原位合成微流体芯片对“养殖南美白对虾”2#样品中水产病原微生物的杂交检测结果。

具体实施方式

实施例1、采用随机扩增标记法和原位合成微流体芯片，以“养殖大黄鱼”1#为待测样本，检测其所带有的病原微生物，依次进行以下步骤：

1)、水产病原微生物检测芯片探针的设计：

设计如述的表1所述的895条寡核苷酸探针(包含42条质控探针，即，包含42条阳性/阴性对照探针)；每条探针重复4次。

2)、寡聚核苷酸芯片的制备

制备寡聚核苷酸芯片：

在醛基化修饰玻片上，依次合成化学修饰过的寡聚核苷酸探针序列，探针在芯片上的排列示意图如图1所示(可随机排列)。

对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；当本底信号强度小于100，认为芯片符合要求。

3)、待测“养殖大黄鱼”1#样品中病原微生物基因组的提取：

取0.2g样品(肌肉样品)，液氮研磨，装入1.5ml无菌的eppendorf管中；利用商品化的DNA提取试剂盒(DNAiso Reagent kit，Takara)提取总DNA，RNA提取试剂盒(RNAisoReagent kit，Takara)提取总RNA。

4)、随机扩增法对病原微生物基因片段进行荧光标记：分别采用以下2种方法分别对水产病原微生物DNA或RNA基因片段进行荧光标记：

方法A(基因组为RNA的病原微生物)的具体步骤如下：

①以待检样品RNA为模板，利用PrimeScript ^TMⅡ1st strand cDNA synthesiskit(Takara)合成cDNA。反应所用的引物为6个碱基的随机引物，反应体系为RNA模板2.0μL，随机引物(50μM)1.0μL，dNTP(10mM each)1.0μL，DEPC-H₂O 6.0μL，以上试剂混匀后65℃保温5min后在放置冰上冷却，再依次加入5×PrimeScriptⅡbuffer 4.0μL,RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，PrimeScriptⅡRTase(200U/μL)1.0μL，DEPC-H₂O 4.5μL。总体积为20μL，混匀后稍离心，30℃10min进行反转录反应。反应结束后95℃5min使酶失活，产物放于-20℃冰箱备用。

②对得到的cDNA进行环化处理，具体反应体系为10μL cDNA中加入CircLigase IIbuffer2.0μL,CircLigase II ssDNALigase(100U)1.0μL,MnCl₂(50mM)1.0μL,ddH₂O 6.0μL。总体积为20μL，混匀后稍离心，60℃保温16h后，再85℃加热10min使酶失活。反应产物经MiniBEST DNA片段清洁试剂盒清洁后。

③环化产物利用phi29DNA聚合酶进行等温扩增，等温扩增体系为10×phi29DNApolymerase buffer 2.5μL，BSA(10mg/ml)0.5μL，随机引物primer-A(100mM,5′-GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN-3′)1.0μL，dNTP(10mM each)1.0μL，phi29DNA polymerase(3U/μL)0.2μL，模板(DNA或环化的cDNA)2.0μL，ddH₂O 17.8μL，总体积为25μL。反应混合物30℃保温2h后，再65℃加热10min使酶失活。

④等温扩增反应产物直接进行第二轮PCR反应，扩增体系为2.5μL 10×PCRbuffer,1.25μLdNTP混合物(2.0mM dGTP、dATP、dTTP),2.5μL Cy3-dCTP(1mM)，1.0μLprimer-B(100mM,5′-GTTTCCCAGTCACGATC-3′)，5.0μL phi29反应产物，1.0μL Taq DNA聚合酶，ddH₂O11.75μL。反应混合物先经52℃2min，72℃5min和95℃2min后，再95℃变性30s，52℃复性30s，72℃延伸30s，循环35次。最后72℃延伸5min。

⑤对得到的PCR产物进行片段化处理(剪切为50-500bp的小片段)，具体为PCR产物5.0μL，10×DNase I buffer 2.0μL，DNase I 1.0μL，ddH₂O 12.0μL。37℃反应20min后，加入1.0μL EDTA(0.5M)，80℃加热处理2min后，以PCR清洁试剂盒清洁产物，并以锡箔纸包裹避免Cy3荧光淬灭，-80℃保存备用。

方法B(基因组为DNA的病原微生物)的操作步骤同上述相同，但省去①和②，直接进行③、④和⑤步骤。即：以待检样品DNA为模板，直接进行phi29DNA聚合酶等温扩增，以及后续的第二轮PCR反应和清洁步骤。

5)、芯片杂交：

将步骤4)所得的纯化后的CY3标记产物分别进行以下操作：

标记好的样品中，加入等体积的杂交缓冲液(6×SSPE,25％甲酰胺,pH6.6-6.8)，95℃变性5min后迅速置于冰上预冷3min；再加入到进样管中，30℃，双向循环杂交16h(过夜)，速度500μl/min；杂交结束后，用1ml洗脱缓冲液(500μl杂交缓冲液,480μlH₂O,20μL10％SDS)32℃循环清洗20min(100μl/min)，再用1ml洗脱缓冲液40℃循环清洗20min(100μl/min)；取出芯片，以Microarry Scanner Genepix4000B扫描，扫描分辨率为10μm，波长为635nm，读取扫描结果，保存图片后分析芯片数据。

杂交缓冲液的配制方法为：在100μl的6×SSPE缓冲液中加入25μl甲酰胺，然后调节pH值至6.6-6.8；

洗脱缓冲液的配制方法为：500μl杂交缓冲液中加入20μl浓度为10％的SDS(十二烷基硫酸钠)水溶液，H₂O定容至1mL；

6)、根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物：

用芯片分析软件(Array-Pro image analysis)获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；当芯片质控探针、阳性/阴性对照探针杂交结果正确(即，满足质控探针杂交结果正确，阳性对照探针杂交信号强，阴性对照探针杂交信号弱或无杂交信号)，认定杂交过程操作无误、芯片结果可信。针对每个检测基因，当有3条以上的探针信号强度超过500、而且4个重复之间的信号标准差小于50％时，认定该基因被检出。当针对同一病原微生物的1个或多个基因被检出，认为该病原微生物存在于样品。

最终结果如图2所示：溶藻弧菌的gyr B、rec A和dna J基因被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的52.36％(10条)、25％(5条)和45％(9条)。嗜水气单胞菌的16S rRNA和gyr B基因被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的47.06％(8条)和40％(6条)。其他病原微生物探针信号未被检出，说明不含有其他病原微生物。

验证实验、将实施例1的“养殖大黄鱼”1#样品，按照目前常用的PCR方法，对其进行致病菌检测，并将PCR结果送测序公司进行序列分析。检测结果显示：“养殖大黄鱼”1#样品中检出溶藻弧菌和嗜水气单胞菌，其他病原微生物未被检出。

对比例1、将实施例1步骤4)的“随机扩增法对病原微生物基因片段进行荧光标记”，扩增体系中随机引物primer-A和primer-B换成9mer的随机引物(5′-NNNNNNNNN-3′),其余等同于实施例1。所得芯片杂交信号强度明显降低，具体检测结果为仅溶藻弧菌的gyrB和嗜水气单胞菌的16S rRNA被检出，探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的5.26％(1条)和17.65％(3条)。

实施例2、采用上述随机扩增标记法和原位合成微流体芯片，以“养殖南美白对虾”2#为待测样本，检测其所带有的病原微生物，依次进行以下步骤：

以0.2g虾肉样品替代实施例1中的“养殖大黄鱼”1#样品，其余等同于实施例1。

最终结果如图3所示，“养殖南美白对虾”2#中检出溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、对虾白斑症病毒和传染性皮下及造血组织坏死病毒；具体为：溶藻弧菌的gyr B、rec A和dna J基因被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的47.36％(9条)、50％(10条)和30％(6条)。嗜水气单胞菌的16S rRNA和gyr B基因被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的58.82％(10条)和33.3％(5条)。温和气单胞菌的16S rRNA和gyr B基因被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的50％(8条)和38.89％(7条)。对虾白斑症病毒的Orf 23/24基因被检出，检出探针条数占所设计探针条数的35％(7条)。传染性皮下及造血组织坏死病毒的未知基因片段被检出，检出探针条数占所设计探针条数的15％(3条)。

验证实验、将实施例2的“养殖南美白对虾”2#样品，按照目前常用的PCR方法，对其进行致病菌检测，并将PCR结果送测序公司进行序列分析。检测结果显示：“养殖南美白对虾”2#样品中检出溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、对虾白斑症病毒和传染性皮下及造血组织坏死病毒。

对比例2、将实施例2步骤4)的“随机扩增法对病原微生物基因片段进行荧光标记”，扩增体系中随机引物primer-A和primer-B换成9mer的随机引物(5′-NNNNNNNNN-3′),其余等同于实施例2。所得芯片杂交信号强度明显降低，具体检测结果为“养殖南美白对虾”2#样品中溶藻弧菌的gyr B和dna J基因被检出，检出探针条数分别占所设计探针条数的5.26％(1条)和5％(1条)。嗜水气单胞菌的gyr B被检出，探针条数占所设计探针条数的13.33％(2条)。。温和气单胞菌的16S rRNA被检出，检出探针条数分别占针对这些基因所设计探针条数的6.25％(1条)。对虾白斑症病毒无探针检出，传染性皮下及造血组织坏死病毒1条探针检出，占所设计探针条数的5％。

实施例3、采用上述随机扩增标记法和原位合成微流体芯片，对市场上随机购买的养殖鱼样品所携带的病原微生物进行检测，依次进行以下步骤：

取0.2g样品，利用商品化的DNA/RNA提取试剂盒提取总DNA/RNA。采用随机扩增标记法对病原微生物基因片段进行Cy3标记，与微流体芯片杂交后检测其所带有的病原微生物。利用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，当芯片质控探针、阳性/阴性对照探针杂交结果正确，我们认为杂交过程操作无误、芯片结果可信。针对每个检测基因，当有3条以上的探针信号强度超过500、而且4个重复之间的信号标准差小于50％时，我们认为该基因被检出。当针对同一病原微生物的多个基因被检出，认为该病原微生物存在于样品。检测结果显示：市场上随机购买的养殖鱼样品中溶藻弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌被检出。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 基于随机扩增标记和原位合成微流体芯片的水产病原微生物检测方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgtgaatag cgccgttacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccacggtaa tcccatcgtc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catggcggta ggtttgcgta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccattgcaga ctcaacagct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggaagtta ttatgacggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggattaccgt ggaagtggcg 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagtattaag gtactgaagg gtc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accgcaataa aacgccgatc 20

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catcgagtat taaggtactg aagggtc 27

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtgggtgaa accgataaaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgatgggat taccgtggaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccgataa aaccgggaca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaaccggga caaccctgcg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccacttagc gggtttccgt 20

Claims

1.原位合成微流体芯片，其特征是：为895条寡核苷酸探针，包含42条阳性/阴性对照探针，如下表1所述；

表1、水产病原微生物芯片检测探针

2.利用权利要求1所述的原位合成微流体芯片进行的水产病原微生物检测方法，其特征是包括以下步骤：

1)、制备寡聚核苷酸芯片；

2)、随机扩增法标记病原微生物基因片段；

3)、芯片杂交；

4)、根据杂交结果判定样品中是否含有水产病原微生物。

3.根据权利要求2所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤2)包括以下步骤：

①、取水产样品0.2g，提取总DNA和总RNA；

②、总RNA利用反转录试剂盒合成第一链cDNA，并利用ssDNA连接酶连接环化；

③、所得的环化产物经清洁回收后，用phi29聚合酶30℃随机等温扩增2h，扩增所用的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATCNNNNNNNNN-3′；

④、扩增产物随即进行第二轮PCR反应，PCR反应的引物为5′-GTTTCCCAGTCACGATC-3′，反应体系中设定Cy3标记的dCTP，以此对产物进行Cy3荧光标记；

⑤、带Cy3荧光标记的第二轮PCR产物经DNase I消化，并剪切为50～500bp的小片段。

4.根据权利要求3所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤3)为：

杂交结束后，用Wash buffer 40℃循环清洗；

所述杂交缓冲液为6×SSPE，25％甲酰胺，pH 6.6-6.8；

所述Wash buffer为：500μL杂交缓冲液,480μL H₂O,20μL 10％SDS。

5.根据权利要求4所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤4)为：

用芯片分析软件获取每个探针的荧光信号强度和标准误，信号值经过背景噪音减除后，通过调整该扫描通道下的平均信号值到同一水平对数据进行归一化处理；

6.根据权利要求5所述的水产病原微生物检测方法，其特征是，所述步骤4)为：

每条探针设置4个重复；

针对每个检测基因，当有3条以上的探针信号强度超过500、而且4个重复之间的信号标准差小于50％时，判定该基因被检出；当针对同一病原微生物的多个基因被检出，认为该病原微生物存在于样品。