CN109851614B - 一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂及其制备方法和应用。所述抑制剂的结构如式(Ⅰ)所示；其中A为五元含氮芳杂环，X、Y、Z各自独立地为C、O、S或N，所述R为单取代基、多取代基或与A成环。本发明所述肽脱甲酰基酶抑制剂结构新颖、活性较佳、毒性小，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出明显的抑制作用，甚至对于具有多重耐药性的细菌，同样具有很好的抑制作用；同时，所述化合物对于结直肠癌、肺癌和骨肉瘤等肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖，可制备成为抗菌药物或者抗肿瘤药物进行应用。

Description

一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗菌和抗癌药物技术研究领域，更具体地，涉及一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术

在人类抗争细菌的同时，由于抗生素的广泛使用，导致细菌耐药性的出现。细菌耐药性已成为全球性健康问题，但目前新药开发的速度仍不足以减轻细菌耐药性带来的严重健康威胁，面对“超级细菌”，人类已经无药可用。因此，人们必须深入地了解细菌耐药性，寻找新的药物靶标和治疗方法，开发出新的工具来对抗细菌。

自抗生素开发的“黄金时代”过去至今，只有少数具有全新作用机制的抗生素上市。尽管细菌耐药性一直是全球性的人类健康问题，但在经济因素和政策因素的影响下，制药企业对于新型抗菌药物的研究热情逐渐变淡，大部分抗菌药物仍然针对的是比较热门的耐药菌，对于难治型、新型耐药菌以及革兰氏阴性菌的药物少之又少。

肽脱甲酰基酶(Peptide deformylase,PDF)是一种新的抗菌药物靶标，它是细菌的蛋白质合成过程中所必需的酶，而真核细胞的蛋白质合成过程不需要它。肽脱甲酰基酶抑制剂可以选择性的抑制细菌的蛋白质合成，而不影响正常人体细胞的功能。研究表明，通过抑制肽脱甲酰基酶的活性可以抑制细菌的生长。鉴于抗生素耐药情况日益严峻，开发新的作用机制的抗生素迫在眉睫，而肽脱甲酰基酶抑制剂则是近年来研究比较热的新作用靶点抗生素之一，因此肽脱甲酰基酶抑制剂有望成为新一类的抗菌药物。

同时，PDF也存在于真核生物的线粒体中，在线粒体蛋白合成过程中同样发挥着重要作用。目前已有相关文献报道了PDF抑制剂对于肿瘤细胞具有一定的抑制活性，例如在2003 年Mona D.Lee最先发现细菌PDF抑制剂Actinonin对肿瘤细胞HL60(IC₅₀为8.8μM)、Daudi 细胞(IC₅₀为5.3μM)的肿瘤增殖抑制活性；其在2004年进一步发现，Actinonin对多达16种肿瘤细胞均具有良好的体外增殖抑制效应，且其对正常细胞的增殖抑制效应较弱(IC₅₀五倍大于肿瘤细胞)，荷瘤裸鼠(CWR22，A549)干预实验发现，Actinonin同时具有非常有效的体内抗肿瘤活性。在2010年，Sindy Escobar-Alvarez等通过不同结构的HsPDF抑制剂进一步的研究发现，抑制HsPDF的功能将减少线粒体蛋白合成、损伤线粒体的呼吸功能和细胞ATP生成明显降低等最终导致肿瘤细胞的死亡。在2013年，Harsharan Randhawa等采用QPCR技术，首次发现PDF基因在多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中均存在高表达的现象。2014年ASheth等通过免疫荧光及QPCR进一步证实HsPDF在多种肿瘤细胞中的过表达现象，并初步探讨了HsPDF与转录因子c-Myc的关系，研究发现c-Myc调控HsPDF的表达，过表达HsPDF 的肿瘤细胞也存在过表达c-Myc的现象，当c-Myc的表达量降低时，HsPDF的表达量也随之降低。另外HsPDF抑制剂Actinonin对c-Myc阳性的肿瘤细胞凋亡诱导效应更为明显。上述研究表明，HsPDF抑制剂Actinoninn能导致肿瘤细胞发生线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)，提示这可能是Actinoninn介导肿瘤细胞凋亡的另一主要机制。综上所述，HsPDF有望可能成为极具潜力的新型抗肿瘤靶标。但基于HsPDF进行抗肿瘤的研究起步较晚，除了Actinonin 外，尚无良好的HsPDF抑制剂被研究报道。

因此，研究肽脱甲酰基酶抑制剂可获得具有多种生物活性的化合物，如同时具有抑菌活性和抗肿瘤细胞的化合物，具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂。本发明所述肽脱甲酰基酶抑制剂结构新颖、活性较佳、毒性小，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出明显的抑制作用，甚至对于具有多重耐药性的细菌，同样具有很好的抑制作用；同时，所述化合物对于结直肠癌、肺癌和骨肉瘤等肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖，可制备成为抗菌药物或者抗肿瘤药物进行应用。

本发明的另一目的在于提供所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂，所述抑制剂的结构如式(Ⅰ)所示：

其中A为五元含氮芳杂环，X、Y、Z各自独立地为C、O、S或N，所述R为单取代基、多取代基或与A成环；

当R为单取代基时，选自氢、C_1～4烷基、C_3～4环烷基、C_1～4卤代烷基、C_1～4烷氧基、C_1～4卤代烷氧基、苯基、卤代苯基、C_1～4烷基取代苯基、C_3～4环烷基取代苯基、C_1～4卤代烷基取代苯基、2-噻吩基、2-吡啶基、卤代2-吡啶基、2-吡嗪基、卤代2-吡啶基、N-哌啶基或N-C_1～4烷基哌啶基；

当R与A成环时，所述A环还设有取代基R₁，所述R₁选自氢、卤素、C_1～4烷基、C_3～4环烷基、苯基、卤代苯基、苄基或卤代苄基；所述R选自苯基、卤代苯基或C_1～4烷基取代苯基。

优选地，所述A选自如下任一取代基：

优选地，当R为单取代基时，选自氢、C_1～2烷基、C_3～4环烷基、C_1～2卤代烷基、C_1～2烷氧基、C_1～2卤代烷氧基、苯基、卤代苯基、C_1～2烷基取代苯基、C_3～4环烷基取代苯基、C_1～2卤代烷基取代苯基、2-噻吩基、2-吡啶基、卤代2-吡啶基、2-吡嗪基、卤代2-吡啶基、N-哌啶基或N-C_1～4烷基哌啶基；

当R与A成环时，所述A环还设有取代基R₁，所述R₁选自氢、卤素、C_1～2烷基、苯基或苄基；所述R选自苯基、卤代苯基或C_1～2烷基取代苯基。

优选地，当A为

时，所述R为氢；

当A为

时，所述R为氢或R与A成环,所述A环还设有取代基R₁，所述R₁选自氢、甲基、乙基、苯基或苄基；所述R为苯基或卤代苯基；

当A为

时，所述R为苯基、卤代苯基或C_1～2烷基取代苯基；

当A为

时，所述R为氢、C_1～2烷基、C_1～2卤代烷基、N-哌啶基或N-C_1～4烷基哌啶基；

当A为

时，所述R为氢、C_1～2烷基、C_1～2卤代烷基、C_3～4环烷基或2-噻吩基；

当A为

时，所述R为氢、C_1～2烷基、C_1～2卤代烷基、5-氟-2吡啶基、2-吡嗪基、苯基、4-甲基苯基、4-溴苯基、4-乙基苯基、4-三氟甲基苯基、2-氯-4-三氟甲基苯基、2-

氟-4-三氟甲基苯基、2,4,5-三氟苯基、2-三氟甲基-4-氟苯基、4-环丙基苯基、4-丁基苯基；

当A为

时，所述R为氢、C_1～2烷基、C_1～2卤代烷基、苯基或2,4,-二氟苯基。优选地，所述抑制剂的结构选自如下结构中的任一一种：

更优选地，所述抑制剂的结构选自如下结构中的任一一种：

本发明同时还保护所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

S1.以式(1)和式(2)所示化合物为原料，在缩合剂HATU和DIPEA存在条件下，反应制备得到式(3)所示化合物；

S2.式(3)所示化合物在二氯甲烷和三氟乙酸存在条件下反应，得到式(4)所示化合物；

S3.式(4)所示化合物在缩合剂HATU和DIPEA存在条件下，与盐酸羟胺反应，即可制备得到目标产物；

优选地，步骤S1中式(1)所述化合物、式(2)所示化合物、DIPEA、HATU的摩尔比为1:1.1～1.5:2.0～5.0:1.0～2.0；反应液中，式(1)所述化合物的浓度0.1～0.5g/mL；反应温度为0～40℃；反应时间为1～6小时。

优选地，步骤S2中式(3)所述化合物和TFA的摩尔比为1:3～15；反应液中，式(3)所述化合物的浓度0.1～0.5g/mL；反应温度为-5～40℃；反应时间3～15小时。

优选地，步骤S3中式(4)所述化合物、NH₂OH·HCl、DIPEA、HATU的摩尔比为1:1.1～1.5:2.0～5.0:1.0～2.0；反应液中，式(4)所述化合物的浓度0.1～0.5g/mL，反应温度为0～ 40℃；反应时间1～6小时。

所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂在制备成为肽脱甲酰基酶抑制剂药物中的应用也在本发明的保护范围内。

优选地，所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂制备成为抑菌剂药物中的应用。

优选地，所述抑菌剂药物为抗大肠杆菌、抗金黄色葡萄球菌或抗多重耐药菌的药物。

优选地，所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂制备成为抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述抗肿瘤药物为抗人结肠癌、人非小细胞肺癌、人骨肉瘤或人急性早幼粒白血病药物中的一种或多种。

本项目合成的一系列肽脱甲酰基酶抑制剂具有较好的抗肿瘤活性，可以为后续PDF抑制剂研究提供思路，也有助于之后对HsPDF抗肿瘤机制的研究。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述肽脱甲酰基酶抑制剂结构新颖、活性较佳、毒性小，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出明显的抑制作用，甚至对于具有多重耐药性的细菌，同样具有很好的抑制作用；同时，所述化合物对于结直肠癌、肺癌和骨肉瘤等肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖，可制备成为抗菌药物或者抗肿瘤药物进行应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1化合物1至3的制备

具体制备路线如下：

1、中间体A的制备方法：

步骤1：在密封管中加入羧酸(1当量)、邻氨基苯硫醇(1.3当量)、N,N-二异丙基乙胺(2当量)和丙基膦酸酐(1当量)。将密封管放入微波反应器，100℃下反应10分钟。反应完，加入水稀释反应液，用饱和碳酸氢钠溶液碱化，加入乙酸乙酯，分离上层有机相，水相反萃一次。合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，经柱层析纯化得到纯的产物。

步骤2：将步骤1所得产物溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，旋干得粗品。

2、中间体B，C的制备方法：

步骤1：在密封管中加入羧酸(1当量)、邻苯二胺(1.1当量)、N,N-二异丙基乙胺(2当量)和丙基膦酸酐(1当量)。将密封管放入微波反应器，160℃下反应30分钟。反应完，加入水稀释反应液，用饱和碳酸氢钠溶液碱化，加入乙酸乙酯，分离上层有机相，水相反萃一次。合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后浓缩，经柱层析纯化得到纯的产物。

步骤2：将步骤1所得产物(1当量)溶于DMF，氮气保护，冰水浴下加入氢化钠固体(5当量)，保持0℃反应半小时，随后缓慢加入亲核试剂(1.2-3当量)。待原料反应完全，加入水/甲醇淬灭。加入乙酸乙酯将反应液稀释，用水洗两次，有机相用饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥后，浓缩并柱层析纯化。

步骤3：将步骤2所得产物溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，旋干得粗品。

化合物1的制备，路线如下所示：

步骤S1：以中间体A原料，加入首先将酸溶解在DMF中，冰浴下依次加入5倍当量的DIPEA，缩合剂HATU(1.02个当量)，搅拌15分钟后加入所合成的胺(1.0个当量)，反应完毕，反应液用乙酸乙酯稀释后，加10％的柠檬酸水溶液洗涤2次，水相用乙酸乙酯萃取 2次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得粗品，直接用于下一步；

步骤S2：将步骤S1得到的粗品溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，加饱和碳酸钠水溶液中和，分得有机相。水相用二氯甲烷萃取一次，合并有机相，无水硫酸钠干燥、旋干得粗品；

步骤S3：取上一步所得酸溶于DMF中，冰浴下依次加入5倍当量的DIPEA，缩合剂HATU (1.05个当量)，搅拌15分钟后加入盐酸羟胺(4个当量)，反应完毕，制备得目标化合物1。

化合物1的谱图数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.24(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H), 7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(t,J＝7.2Hz,1H),7.28(t,J＝7.0Hz,1H),5.57(d,J＝5.1Hz,1H), 3.99(d,J＝9.7Hz,1H),3.49(d,J＝9.3Hz,1H),3.07(d,J＝5.4Hz,1H),2.49(dd,J＝11.8,9.1 Hz,1H),2.43–2.34(m,1H),2.14(dd,J＝13.9,2.9Hz,1H),1.92(d,J＝13.0Hz,1H),1.72-1.63 (m,4H),1.58–1.46(m,4H),1.41(d,J＝6.4Hz,1H),1.30–1.22(m,1H),1.07(s,1H),0.97– 0.90(m,1H),0.71(s,1H),0.63(s,1H),0.55(s,2H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₃H₂₉N₃O₃S[M+H]⁺＝428.2002；found 428.2003.

化合物2和3的制备方法同化合物1的制备过程，不同之处在于将步骤S1中的中间体A 替换成为中间体B或者C，即可得到化合物2和3。

化合物2的路线：

化合物2的谱图数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.70(d,J＝7.2Hz,1H),7.37–7.16(m, 6H),7.04(d,J＝5.8Hz,2H),5.63(d,J＝16.8Hz,1H),5.46(d,J＝16.8Hz,1H),5.29(t,J＝7.5 Hz,1H),4.04(d,J＝9.2Hz,1H),3.66(d,J＝9.4Hz,1H),3.03(s,1H),2.37-2.13(m,2H),1.74(s, 1H),1.69–1.48(m,7H),1.41(d,J＝6.9Hz,1H),1.25(d,J＝10.2Hz,3H),1.01(s,1H),0.88(s, 1H),0.71(s,1H),0.55(d,J＝8.8Hz,1H),0.39(s,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₃₀H₃₆N₄O₃[M+H]⁺＝501.2860；found 501.2867.

化合物3的路线：

化合物3的谱图数据：¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.11(s,1H),7.60(d,J＝7.5Hz,1H), 7.24–7.12(m,4H),5.35(t,J＝7.9Hz,1H),3.94(d,J＝9.8Hz,1H),3.79(d,J＝9.8Hz,1H),3.71 (s,3H),3.05(d,J＝5.7Hz,1H),2.39–2.21(m,2H),2.12–2.04(m,1H),1.96(dd,J＝12.5,7.9 Hz,1H),1.66(s,1H),1.57–1.41(m,7H),1.15(d,J＝7.3Hz,1H),0.98(dd,J＝11.5,7.6Hz,1H), 0.82(dd,J＝11.2,5.2Hz,2H),0.75–0.69(m,1H),0.60(dd,J＝12.1,6.9Hz,1H),0.55(d,J＝4.5 Hz,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₄H₃₂N₄O₃[M+H]⁺＝425.2547；found 425.2552.

实施例2化合物4至7的制备

制备路线如下所示：

1、中间体D的制备方法：

步骤1：称取羧酸(8.3g,30mmol)置于反应瓶，溶于四氢呋喃，冰水浴下搅拌。加入HOBt(1.5当量)和DIPEA(3当量)，0℃下反应15分钟后加入EDCI(1.5当量)，半小时后加入氨水(1.1当量)。待原料反应完后，旋干反应液。加入水和乙酸乙酯，萃取。水相再反萃一次，合并有机相。有机相一次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗1次，再用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后的得到油状产物。

步骤2：称取上步反应产物(590mg,2.1mmol)置于反应瓶，溶于6mL四氢呋喃，分批加入劳森试剂(1.2当量)，室温下搅拌，过夜。待原料基本反应完，向体系内加入乙酸乙酯稀释反应液，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，至不产生气泡。分出有机相，再用饱和碳酸氢钠溶液洗2次、饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后得到白色固体粗产物，经柱层析纯化得到产物。

步骤3：将上步反应产物(1当量)溶于无水四氢呋喃，加入2-溴-1,1-二乙氨基乙烷(1 当量)，67℃下加热回流，反应过夜。待原料反应完，停止加热。旋干反应液，用乙酸乙酯溶解。再用饱和碳酸氢钠溶液洗2次，饱和食盐水洗1次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤旋干后得到油状粗产物，经柱层析得到纯产物。

步骤4：称取上步反应产物(1当量)置于反应瓶，加入HBr/HCOOH(10当量)溶液，室温下搅拌。待原料反应完，旋干反应液，得到油状粗产物。

2、中间体E的制备方法：

步骤1：冰水浴下将醛溶于氨甲醇溶液中，搅拌15分钟。随后缓慢滴加40％乙二醛水溶液(5当量)，自然升至室温并搅拌过夜。待原料基本反应完，旋干反应液，加入乙酸乙酯，过滤除去不溶杂质。有机相用饱和食盐水洗一次，干燥并旋干得到油状粗产品。经柱层析得到产物。

步骤2：将上步反应产物溶于二氯甲烷，加入Dess-Martin氧化剂(5当量),室温下搅拌。反应3小时后，原料基本反应完。过滤反应液，滤液旋干后溶于二氯甲烷，并用饱和碳酸钠溶液洗3次、饱和食盐水洗一次，干燥并旋干，得到粗产物

步骤3：将步骤2所得产物溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，旋干得粗品。

步骤4：称取上步反应产物(1当量)置于反应瓶，加入TFA/DCM(10当量)溶液，室温下搅拌。待原料反应完，旋干反应液，得到粗产物。

3、中间体F的制备方法：

步骤1：称取酰胺(1当量)于反应瓶，溶于DMF-DMA，110℃下加热回流8小时。原料反应完，停止加热，旋干反应液，直接用于下一步。

步骤2：将上步反应产物溶于乙醇，加入乙酸，冰水浴下搅拌。缓慢滴加水合肼(10当量)。半小时后，将反应置于60℃下反应4小时后停止加热。冷却至室温后，加入水和乙酸乙酯，萃取分离有机相，有机相用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤旋干后经柱层析纯化得到产物。

步骤3：称取上步反应产物置于反应瓶，加入3mL HBr/HCOOH溶液，室温下搅拌。待原料反应完，旋干反应液，得到粗产物。

4、中间体G的制备方法：

步骤1：将酰胺(1当量)置于反应瓶，溶于DMF，冰水浴下搅拌15分钟后分批加入三聚氯氰(0.65当量)。待原料反应完，加入水淬灭反应，再加入30ml乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经柱层析得产物。

步骤2：称取上步反应产物(1当量)于反应瓶，加入叠氮化钠(2当量)和溴化锌(0.5当量)，溶于异丙醇，再加入1/4体积水。加热至80℃，反应3小时后停止加热。加水淬灭反应，并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，浓缩后经柱层析纯化得到产物。

步骤3：将上步反应产物置于反应瓶，加入无水甲醇，10％钯碳(20％)，换气，通入氢气。室温下搅拌3小时。待原料反应完，过滤，滤液减压浓缩得到粗产品。

然后，参照实施例1中化合物1的制备过程，不同之处在于将中间体A替换成为中间体 D、E、F或G，即可制备得到化合物4至7。

化合物4的路线：

化合物4的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.69(d,J＝3.2Hz,1H),7.46(d,J＝3.1 Hz,1H),5.54(d,J＝7.9Hz,1H),4.06(d,J＝9.7Hz,1H),3.52(d,J＝9.7Hz,1H),3.21–3.05(m, 1H),2.57(dd,J＝12.5,8.3Hz,1H),2.41(dd,J＝14.7,9.1Hz,1H),2.29–2.16(m,1H),1.93– 1.71(m,5H),1.68–1.50(m,4H),1.43–1.31(m,1H),1.19-1.07(m,2H),0.73(dd,J＝11.6,6.5 Hz,1H),0.61(d,J＝5.5Hz,2H),0.44–0.33(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₉H₂₇N₃O₃S[M+H]⁺＝378.1846；found 378.1848.

化合物5的路线：

化合物5的谱图数据：¹H NMR(500MHz,D₂O)δ8.14(s,1H),7.07(d,J＝2.2Hz,2H),5.13 (t,J＝6.5Hz,1H),3.50(d,J＝2.1Hz,2H),2.75(d,J＝6.4Hz,1H),2.21–2.11(m,1H),2.10– 2.02(m,2H),1.84–1.73(m,1H),1.44(s,1H),1.37(s,1H),1.29(s,4H),1.24–1.16(m,2H),1.12 (d,J＝6.3Hz,1H),0.79-0.71(m,2H),0.56–0.32(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₉H₂₈N₄O₃[M+H]⁺＝361.2234；found 361.2226.

化合物6的路线：

化合物6的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.29-8.19(m,1H),5.43–5.30(m,1H), 3.92(d,J＝9.6Hz,1H),3.69(dd,J＝21.0,10.6Hz,1H),3.11–2.82(m,1H),2.63(dd,J＝16.9, 10.2Hz,1H),2.45(dd,J＝16.9,4.1Hz,1H),2.36–2.21(m,1H),2.08–1.93(m,2H),1.85–1.69 (m,3H),1.70–1.47(m,6H),1.36(dd,J＝13.5,6.8Hz,1H),1.27–1.00(m,3H),0.74–0.47(m, 4H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₈H₂₇N₅O₃[M+H]⁺＝362.2187；found 362.2183.

化合物7的路线：

化合物7的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ5.54–5.45(m,1H),3.93(d,J＝9.6Hz, 1H),3.66(d,J＝9.6Hz,1H),3.11–2.98(m,1H),2.49–2.31(m,2H),2.26–2.17(m,1H),2.08– 1.95(m,2H),1.87–1.74(m,2H),1.71–1.49(m,8H),1.39–1.27(m,4H),1.21–0.96(m,3H), 0.83–0.53(m,5H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₇H₂₆N₆O₃[M+H]⁺＝363.2139；found 363.2144.

实施例3化合物8的制备

化合物8的制备路线如下所示：

中间体H的制备：

步骤1：将醛(1当量)溶于15ml甲醇，冰水浴下搅拌。加入碳酸氢钠固体(1.2当量)和盐酸羟胺(1.2当量)，自然升至室温，搅拌过夜。反应完全后，旋干甲醇，加入乙酸乙酯，有机相用饱和食盐水洗一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤后旋干得到产物。

步骤2：将上步反应产物(1当量)置于反应瓶，溶于10mL DMF，冰水浴下搅拌，先加入N-氯代丁二酰亚胺(0.2当量)，反应半小时后撤去冰水浴，加入剩余的NCS(0.8当量)，室温下反应10小时。加入水和乙酸乙酯，萃取，有机相用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩，经柱层析得到粗产物。

步骤3：称取上步反应产物(1当量)于反应瓶，将其溶于二氯甲烷，缓慢加入苯乙炔(1.5 当量)，搅拌十分钟后，缓慢滴加三乙胺(1.5当量)，室温下搅拌过夜。待原料反应完，旋干反应液，经柱层析得到产物。

步骤4：将上步反应产物(1当量)溶于二氯甲烷。加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌3小时。待原料反应完后，旋干，得到油状粗产物。

然后，参照实施例1中化合物1的制备过程，不同之处在于将中间体A替换成为中间体 H，即可制备得到化合物8。

化合物8的路线：

化合物8的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.77(d,J＝6.6Hz,2H),7.54–7.42(m, 3H),6.65(s,1H),5.36(dd,J＝8.1,3.2Hz,1H),3.99(d,J＝9.8Hz,1H),3.60(d,J＝9.8Hz,1H), 3.12–3.03(m,1H),2.51–2.37(m,2H),2.21(dd,J＝14.7,5.4Hz,1H),1.92(dd,J＝12.8,3.0Hz, 1H),1.94-1.90(m,2H),1.76–1.68(m,2H),1.66–1.54(m,3H),1.51–1.41(m,1H),1.41–1.30 (m,1H),1.21–1.02(m,2H),0.77–0.48(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₃₁N₃O₄[M+H]⁺＝438.2387；found 438.2390.

实施例4化合物9至11的制备

化合物9至11的制备路线如下所示：

然后，参照实施例1中化合物1的制备过程，不同之处在于将中间体A替换成为中间体 D、E、F或G，即可制备得到化合物4至7。

1、中间体I制备方法：

步骤1：将羧酸(1当量)和碳酸钾(2当量)放在烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺DMF(35mL)使之溶解，冰浴下缓慢滴加碘甲烷(2.5当量)，0℃下搅拌60分钟。反应体系于室温下搅拌12小时。待反应结束，反应液用亚硫酸钠溶液淬灭，室温搅拌30分钟。反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用水洗涤三次除去残留DMF。最后有机相经干燥、浓缩后得粗品。

步骤2：将粗品溶于水合肼(1.5当量)，100℃加热。待反应结束，反应液用乙酸乙酯稀释，有机相用水洗两次。最后有机相经干燥、浓缩后得到油状粗品。

步骤3：将步骤2所得产物(1当量)溶于四氢呋喃，加入三乙胺(5当量)，缓慢滴入三氟乙酸酐(3当量)，80℃加热回流并过夜。待原料反应完，旋干反应液，加入乙酸乙酯溶解，分别用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗一次，有机相用饱和无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经柱层析纯化，得到纯的产物。

步骤4：将步骤3所得产物溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，旋干得粗品。

2、中间体J制备方法：

步骤1：将Boc保护的羧酸(1当量)置于反应瓶，用二氯甲烷(50mL)溶解，加入三氟乙酸(10当量)，室温搅拌3小时。待反应结束后，旋干反应液。加入水，碳酸氢钠固体 (5当量)，冰水浴搅拌。缓慢滴加氯甲酸苄酯(1.1当量)，0℃搅拌30分钟后，室温搅拌过夜。待反应结束后，用10％柠檬酸溶液调节溶液PH至酸性，分次加入二氯甲烷，萃取三次。合并有机相，经干燥、浓缩后得到产物。

步骤2：将Cbz-酸(1当量)置于反应瓶，加入DMF，冰水浴下搅拌。依次加入DIPEA (3当量)、缩合剂HATU(1.2当量)，0℃下反应15分钟后加入环丙基甲酰肼(1.2当量)，室温搅拌过夜。待反应结束后，加入水淬灭反应，加入乙酸乙酯稀释反应液，萃取。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗一次，经干燥、浓缩后得到粗产物。

步骤3：将上步反应产物置于反应瓶，加入乙腈，三氯氧磷(2当量)，70℃下搅拌6小时。待原料反应完，加入饱和碳酸氢钠水溶液，搅拌30分钟。加入乙酸乙酯，萃取。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗一次，经干燥、浓缩后得到油状粗产物。粗品通过柱层析分离纯化得到产物。

步骤4：将上步反应产物(1当量)置于反应瓶，加入无水甲醇，10％钯碳(20％)，换气，通入氢气。室温下搅拌3小时。待原料反应完，过滤，滤液减压浓缩得到粗产物。

3、中间体K制备方法：

步骤1：将醛(1当量)置于反应瓶，加入三氯甲烷使之溶解，加入2-噻吩甲醛(1当量)，两滴甲酸。换气，通入氮气，于70℃加热回流并过夜。待原料反应完后，冷却至室温，旋干反应液。加入乙酸乙酯、石油醚，析出白色固体。过滤并用油泵抽干残留溶剂后得到产物。

步骤2：将上步反应产物(1当量)置于反应瓶，加入二氯甲烷，加入二乙酸碘苯(2当量)，室温下搅拌过夜。待原料反应完后，旋干反应液。经柱层析纯化产物。

步骤3：将步骤2所得产物溶于二氯甲烷，滴加三氟醋酸(10个当量)。在室温搅拌反应2小时后，旋干得粗品。

然后，参照实施例1中化合物1的制备过程，不同之处在于将中间体A替换成为中间体 I、J或K，即可制备得到化合物9至11。

化合物9的路线：

化合物9的谱图数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.52(s,1H),3.94(d,J＝9.4Hz,1H),3.57(d,J＝9.3Hz,1H),3.07(s,1H),2.49–2.44(m,1H),2.30(d,J＝12.4Hz,1H),1.98(dd,J＝ 12.7,3.3Hz,1H),1.75(s,3H),1.59-1.54(m,5H),1.39–1.26(m,2H),1.13-1.02(m,2H),0.81 –0.53(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₉H₂₅F₃N₄O₄[M+H]⁺＝431.1901；found 431.1901.

化合物10的路线：

化合物10的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ5.35–5.27(m,1H),3.93(d,J＝9.7Hz,1H),3.57(d,J＝9.7Hz,1H),3.35–3.24(m,1H),3.06(ddd,J＝14.5,9.2,5.7Hz,1H),2.45- 2.35(m,2H),2.24–2.14(m,2H),1.95–1.87(m,1H),1.79(s,3H),1.60(ddd,J＝17.8,15.0,10.7 Hz,5H),1.39–1.30(m,1H),1.17(dt,J＝11.4,5.7Hz,3H),1.06–1.00(m,2H),0.80–0.55(m, 4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₁H₃₀N₄O₄[M+H]⁺＝403.2340；found 403.2340.

化合物11的路线：

化合物11的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.79-7.76(m,2H),7.27-7.23(m,1H), 5.45-5.42(m,1H),3.97(d,J＝9.6Hz,1H),3.66(d,J＝9.6Hz,1H),3.31(s,1H),3.19–3.04(m, 1H),2.50(dd,J＝12.7,8.4Hz,1H),2.39(dd,J＝14.6,9.6Hz,1H),2.21(dd,J＝14.7,5.1Hz,1H), 2.03(dd,J＝12.7,3.7Hz,1H),1.81(s,2H),1.69-1.66(m,2H),1.57-1.52(m,3H),1.37–1.30 (m,1H),1.16(s,1H),1.08–0.98(m,1H),0.83–0.64(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₂H₂₈N₄O₄S[M+H]⁺＝445.1904；found 445.1904.

实施例5化合物12至24的制备

化合物12至24的制备路线如下所示：

1、中间体L的制备方法：

步骤1:将含取代基的苯氰(1当量)溶于乙醇中,然后加入羟胺盐酸盐(1.5当量),DIPEA (1.6当量)。混合物加热回流4小时。冷却至室温，旋干反应液，石油醚打浆，过滤得到粗产物。

步骤2:将上步反应产物(1当量)和羧酸(1.2当量)溶于DMF，然后加入1-羟基苯并三唑(1.2当量)、DIPEA(2.5当量)，冰水浴下搅拌。0℃下反应15分钟后，加入EDCI(1.2 当量)，室温下反应过夜。待原料反应完，加入水淬灭反应，用乙酸乙酯稀释，萃取。收集的有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水洗涤，干燥浓缩后得产物粗产物。

步骤3：将步骤2得到的固体溶于DMF，加入三乙胺(1当量)，加热至100℃，反应 12小时。TLC监测，待原料反应完后，冷却至室温。加入水，乙酸乙酯，萃取。有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，干燥浓缩后再经柱层析纯化得到产物。

步骤4：将上步反应产物(1当量)溶于二氯甲烷。加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌3小时。待原料反应完后，旋干，得到粗产物。

2、中间体M的制备方法：

步骤1：称取氰基化合物(1当量)和盐酸羟胺(1.5当量)置于反应瓶，加入乙醇和DIPEA (1.6当量),80℃加热反应。5小时后，停止加热，待反应瓶冷却至室温后，旋干乙醇，重新溶于20mL二氯甲烷，并用饱和食盐水洗一次，干燥过滤浓缩后得到固体产物。

步骤2：

1)称取上步反应产物(1当量)、2,4-三氟苯甲酸(1.2当量)和HOBt(1.2当量)于反应瓶，加入DMF，冰水浴下搅拌。随后加入DIPEA(4当量)，0℃下反应15分钟后加入 EDCI(1.2当量)。自然升至室温，待原料反应完后，加水淬灭，再加入30ml乙酸乙酯萃取。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水各洗一次，再用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后得到粗产物。

2)将油状粗产物溶于DMF，加入三乙胺(1当量)，100℃加热搅拌。4小时后，原料基本反应完，冷却至室温后，加入水、乙酸乙酯，萃取。水相反萃一次，合并有机相，再用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥后，过滤旋干，经柱层析得到产物。

步骤5：称取上步反应产物(1当量)置于反应瓶，加入HBr/HCOOH溶液，室温下搅拌。待原料反应完，旋干反应液，得到目标产物。

然后，参照实施例1中化合物1的制备过程，不同之处在于将中间体A替换成为中间体 L或M，即可制备得到化合物12至24。

化合物12的路线：

化合物12的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ5.34(dd,J＝8.2,4.4Hz,1H),3.93(d, J＝9.7Hz,1H),3.63(d,J＝9.7Hz,1H),3.08(tt,J＝9.1,5.6Hz,1H),2.48–2.31(m,5H),2.21 (dd,J＝14.7,5.5Hz,1H),1.91(dd,J＝12.8,4.4Hz,1H),1.88–1.72(m,3H),1.71–1.50(m,5H), 1.33(ddd,J＝16.0,10.8,6.5Hz,1H),1.21–1.02(m,2H),0.82–0.75(m,1H),0.67(dq,J＝9.7, 5.6Hz,2H),0.57–0.50(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₁₉H₂₈N₄O₄[M+H]⁺＝377.2183；found 377.2188.

化合物13的路线：

化合物13的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.61(s,1H),8.18(dd,J＝8.7,4.4Hz, 1H),7.81(td,J＝8.5,2.6Hz,1H),5.48(dd,J＝8.0,4.5Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.71(d, J＝9.7Hz,1H),3.19–3.06(m,1H),2.51(dd,J＝12.8,8.3Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz, 1H),2.22(dd,J＝14.7,5.4Hz,1H),2.05(dd,J＝12.9,4.4Hz,1H),1.98–1.81(m,2H),1.79– 1.45(m,6H),1.42–1.24(m,1H),1.23–1.02(m,2H),0.87–0.51(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₃H₂₈FN₅O₄[M+H]⁺＝458.2198；found 458.2204.

化合物14的路线：

化合物14的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ9.26(s,1H),8.78(d,J＝5.9Hz,2H), 5.50(dd,J＝8.1,4.5Hz,1H),3.99(d,J＝9.7Hz,1H),3.73(d,J＝9.6Hz,1H),3.13(ddd,J＝14.5, 9.2,5.0Hz,1H),2.53(dd,J＝12.8,8.3Hz,1H),2.40(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.22(dd,J＝14.7, 5.3Hz,1H),2.07(dd,J＝12.9,4.4Hz,1H),1.98-1.85(m,2H),1.80–1.69(m,2H),1.67–1.51 (m,4H),1.35(ddd,J＝13.5,8.5,5.4Hz,1H),1.24–1.14(m,1H),1.08(dt,J＝12.2,8.1Hz,1H), 0.82(dd,J＝9.3,4.4Hz,1H),0.77–0.66(m,2H),0.59(dd,J＝9.7,4.2Hz,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₂H₂₈N₆O₄[M+Na]⁺＝463.2064；found 463.2057.

化合物15的路线：

化合物15的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.02(d,J＝7.0Hz,2H),7.56–7.46(m,3H),5.45(dd,J＝8.0,4.2Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.70(d,J＝9.7Hz,1H),3.19–3.07(m,1H),2.50(dd,J＝12.7,8.3Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.21(dd,J＝14.7,5.4 Hz,1H),2.03–1.98(m,2H),1.94–1.86(m,1H),1.79–1.70(m,2H),1.64(dd,J＝16.9,10.5Hz, 3H),1.53(dd,J＝9.3,4.8Hz,1H),1.37-1.28(m,1H),1.22-1.15(m,1H),1.09-1.04(m,1H), 0.83–0.78(m,1H),0.74–0.65(m,2H),0.58-0.55(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₄H₃₀N₄O₄[M+H]⁺＝439.2340；found 439.2349.

化合物16的路线：

化合物16的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.90(d,J＝7.9Hz,2H),7.30(d,J＝7.9Hz,2H),5.43(dd,J＝8.0,4.2Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.70(d,J＝9.6Hz,1H),3.18– 3.06(m,1H),2.52–2.35(m,5H),2.21(dd,J＝14.7,5.4Hz,1H),2.03–1.86(m,3H),1.80–1.70 (m,2H),1.67–1.59(m,3H),1.56–1.50(m,1H),1.38–1.28(m,1H),1.19(dt,J＝16.3,8.0Hz, 1H),1.06(dd,J＝12.1,8.0Hz,1H),0.80(dd,J＝9.4,4.0Hz,1H),0.74–0.64(m,2H),0.56(dd,J ＝9.6,3.9Hz,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₃₂N₄O₄[M+H]⁺＝453.2496；found 453.2496.

化合物17的路线：

化合物17的谱图数据：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.93(d,J＝8.5Hz,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,2H),5.44(dd,J＝8.2,4.4Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.69(d,J＝9.7Hz,1H),3.17– 3.08(m,1H),2.50(dd,J＝12.9,8.3Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.21(dd,J＝14.7,5.5 Hz,1H),2.00(dd,J＝12.9,4.4Hz,1H),1.90(tdd,J＝11.8,7.6,5.1Hz,2H),1.77–1.69(m,2H), 1.69–1.58(m,3H),1.52(ddd,J＝10.7,7.7,3.7Hz,1H),1.34(ddd,J＝13.8,9.0,5.1Hz,1H), 1.25–1.15(m,1H),1.06(dq,J＝12.4,8.1Hz,1H),0.81(ddd,J＝10.1,5.9,3.8Hz,1H),0.75– 0.65(m,2H),0.60–0.53(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₄H₂₉BrN₄O₄[M+H]⁺＝517.1445；found 517.1445.

化合物18的路线：

化合物18的谱图数据：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.33(d,J＝8.2Hz,2H),5.44(dd,J＝8.2,4.3Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.70(d,J＝9.7Hz,1H),3.16– 3.09(m,1H),2.70(q,J＝7.6Hz,2H),2.50(dd,J＝12.8,8.3Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz, 1H),2.21(dd,J＝14.7,5.5Hz,1H),2.02–1.86(m,3H),1.79–1.71(m,2H),1.64(dtt,J＝14.5, 9.6,4.9Hz,3H),1.53(td,J＝7.8,4.3Hz,1H),1.37–1.30(m,1H),1.25(t,J＝7.6Hz,3H),1.20 (ddd,J＝16.6,10.2,6.3Hz,1H),1.12–1.03(m,1H),0.81(ddd,J＝10.0,5.9,3.8Hz,1H),0.75– 0.65(m,2H),0.59–0.53(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₆H₃₄N₄O₄[M+H]⁺＝467.2653；found 467.2659.

化合物19的路线：

化合物19的谱图数据：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ8.22(d,J＝8.2Hz,2H),7.82(d,J＝8.3Hz,2H),5.47(dd,J＝8.2,4.4Hz,1H),3.99(d,J＝9.7Hz,1H),3.71(d,J＝9.7Hz,1H),3.18– 3.08(m,1H),2.52(dd,J＝12.9,8.3Hz,1H),2.40(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.22(dd,J＝14.7,5.5 Hz,1H),2.03(dd,J＝12.9,4.4Hz,1H),2.00–1.86(m,2H),1.79–1.70(m,2H),1.69–1.59(m, 3H),1.56–1.48(m,1H),1.39–1.32(m,1H),1.25–1.16(m,1H),1.07(dq,J＝12.4,8.1Hz,1H), 0.85–0.79(m,1H),0.76–0.66(m,2H),0.61–0.54(m,1H).

¹⁹F NMR(376MHz,MeOD)δ-64.48(s).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₂₉F₃N₄O₄[M+H]⁺＝507.2214；found 507.2223.

化合物20的路线：

化合物20的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.10(d,J＝8.1Hz,1H),7.93(d,J＝0.7Hz,1H),7.77(dd,J＝8.1,1.0Hz,1H),5.50(dd,J＝8.2,4.1Hz,1H),4.00(d,J＝9.7Hz,1H), 3.68(d,J＝9.7Hz,1H),3.16–3.07(m,1H),2.55(dd,J＝12.9,8.2Hz,1H),2.40(dd,J＝14.7,9.2 Hz,1H),2.22(dd,J＝14.8,5.5Hz,1H),2.02(dd,J＝12.9,4.1Hz,1H),1.97–1.82(m,2H),1.76 –1.67(m,2H),1.65–1.52(m,3H),1.48–1.29(m,2H),1.23–1.11(m,1H),1.04(dq,J＝12.4, 8.1Hz,1H),0.84–0.78(m,1H),0.71(dq,J＝9.6,5.5Hz,2H),0.62–0.55(m,1H).

¹⁹F NMR(376MHz,MeOD)δ-64.63(s).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₂₈ClF₃N₄O₄[M+H]⁺＝541.1824；found 541.1818.

化合物21的路线：

化合物21的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.23(t,J＝7.4Hz,1H),7.67(t,J＝10.1Hz,2H),5.49(dd,J＝8.2,4.3Hz,1H),4.00(d,J＝9.7Hz,1H),3.71(d,J＝9.7Hz,1H),3.18 –3.08(m,1H),2.53(dd,J＝12.9,8.3Hz,1H),2.40(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.22(dd,J＝14.8, 5.5Hz,1H),2.03(dd,J＝12.9,4.3Hz,1H),1.98–1.83(m,2H),1.73(ddd,J＝14.6,9.3,5.3Hz, 2H),1.66–1.57(m,3H),1.50(ddd,J＝10.7,7.6,3.6Hz,1H),1.35(ddd,J＝13.7,8.7,5.2Hz,1H), 1.25–1.16(m,1H),1.06(tt,J＝16.0,8.0Hz,1H),0.87–0.79(m,1H),0.72(dq,J＝9.7,5.3Hz, 2H),0.64–0.56(m,1H).

¹⁹F NMR(376MHz,MeOD)δ-64.60(s,3F),-107.19(s,1F).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₂₈F₄N₄O₄[M+H]⁺＝525.2119；found 525.2134.

化合物22的路线：

化合物22的谱图数据：¹H NMR(500MHz,MeOD)δ7.90(dd,J＝16.0,8.2Hz,1H),7.42(dd,J＝16.9,8.7Hz,1H),5.47(d,J＝3.5Hz,1H),3.99(d,J＝9.6Hz,1H),3.70(d,J＝9.6Hz, 1H),3.12(s,1H),2.56–2.48(m,1H),2.40(dd,J＝14.2,9.6Hz,1H),2.22(dd,J＝14.7,4.5Hz, 1H),2.02(d,J＝19.8Hz,2H),1.97–1.85(m,2H),1.74(dd,J＝17.5,9.0Hz,2H),1.63(dd,J＝ 17.8,8.3Hz,3H),1.51(d,J＝6.6Hz,1H),1.34(dd,J＝12.9,6.3Hz,1H),1.19(dd,J＝17.6,8.4 Hz,1H),1.11–1.03(m,1H),0.81(d,J＝7.7Hz,1H),0.71(dd,J＝14.7,5.8Hz,2H),0.58(d,J＝ 7.3Hz,1H).

¹HRMS(ESI):calculated for C₂₄H₂₇F₃N₄O₄[M+H]⁺＝493.2057；found 493.2072.

化合物23的路线：

化合物23的谱图数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(dd,J＝8.0,5.7Hz,1H),7.45(dd, J＝8.8,1.8Hz,1H),7.32–7.23(m,1H),5.46(d,J＝4.9Hz,1H),3.89(d,J＝9.4Hz,1H),3.47(d, J＝9.4Hz,1H),3.13–2.95(m,1H),2.50–2.38(m,2H),2.25(d,J＝11.7Hz,1H),1.90–1.74(m, 2H),1.73–1.56(m,3H),1.54–1.39(m,3H),1.37-1.23(m,3H),1.18(s,1H),1.03(dd,J＝11.3, 7.8Hz,1H),0.97–0.88(m,1H),0.67(dd,J＝11.6,6.5Hz,1H),0.58(d,J＝5.2Hz,2H),0.44(dd, J＝11.3,6.6Hz,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₂₈F₄N₄O₄[M+H]⁺＝525.2119；found 525.2121.

化合物24的路线：

化合物24的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.17(dd,J＝14.9,8.1Hz,1H),7.28- 7.18(m,2H),5.39(dd,J＝7.9,4.3Hz,1H),3.96(d,J＝9.6Hz,1H),3.68(d,J＝9.7Hz,1H),3.17 –3.07(m,1H),2.46-2.36(m,2H),2.20(dd,J＝14.7,5.5Hz,1H),2.00–1.78(m,3H),1.75- 1.57(m,6H),1.46(dd,J＝7.4,3.8Hz,1H),1.34-1.29(m,1H),1.24–0.98(m,2H),0.81–0.50 (m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₄H₂₈F₂N₄O₄[M+H]⁺＝475.2151；found 475.2159.

实施例6化合物25和26的制备

化合物25和26的制备路线如下所示：

具体制备过程如下：

步骤1：将醛(1当量)溶于无水甲醇，加入碳酸钾(2当量)和Ohira-Bestmann试剂(1.2 当量)，室温下搅拌2小时。加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取，分离有机相。有机相用饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后经柱层析得到产物。

步骤2：称取步骤1产物(1当量)置于反应瓶，溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌。TLC监测，待原料反应完后，旋干反应液，得到粗产物。

步骤3：将羧酸(1.02当量)置于反应瓶，加入DMF，冰水浴下搅拌。依次向反应瓶中加入DIPEA(5当量)、缩合剂HATU(1.02当量)。0℃下搅拌15分钟后，加入上步反应产物，室温下搅拌6小时。待原料反应完后，加入水淬灭反应，加入乙酸乙酯稀释反应液，萃取。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗一次，经干燥、浓缩后得到油状粗产物。粗品通过柱层析分离纯化得到浅黄色油状化合物。

步骤4：称取步骤3反应产物(1当量)于反应瓶，溶于4mL异丙醇。依次加人叠氮化合物(1.1当量)、五水硫酸铜(0.1当量)和抗坏血酸钠(0.2当量)以及水。氮气保护下，室温搅拌过夜。旋干反应液，经柱层析纯化得产物。

步骤5：将步骤5所得产物(1当量)置于反应瓶，溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌12小时。待反应结束后，旋干反应液，得到粗品。

步骤6：将所得油状产物溶于DMF，冰水浴下搅拌，依次加入N,N-二异丙基乙胺DIPEA (8当量)、缩合剂HATU(1.2当量)，0℃搅拌15分钟后，加入盐酸羟胺(4当量)，室温反应6小时。待反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，加入水溶液，萃取。有机相用10％柠檬酸溶液洗一次，再用饱和碳酸氢钠溶液洗一次。最后有机相经干燥、浓缩后得到油状粗品，经柱层析纯化得到目标产物。

化合物25的路线：

化合物25的谱图数据：¹H NMR(500MHz,Acetone)δ5.44(d,J＝6.8Hz,1H),4.20–3.92 (m,4H),3.76-3.58(m,1H),3.09-3.01(m,1H),2.49-2.48(m,1H),2.34-2.26(m,1H),2.10–2.00 (m,1H),1.95–1.77(m,3H),1.75–1.55(m,6H),1.44(dd,J＝17.6,11.4Hz,1H),1.29–1.09(m, 2H),0.76-0.50(m,4H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₃₁N₃O₄[M+H]⁺＝376.2343；found 376.2340.

化合物26的路线：

化合物26的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.38(s,1H),5.43–5.27(m,1H),4.87 –4.73(m,2H),3.97–3.76(m,1H),3.72–3.55(m,2H),3.51–3.34(m,2H),3.05(s,1H),2.99– 2.86(m,1H),2.71–2.58(m,1H),2.45–2.16(m,1H),2.08–1.95(m,1H),1.93–1.69(m,7H), 1.69–1.42(m,7H),1.31–0.97(m,2H),0.83–0.45(m,3H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₅H₄₀N₆O₃[M+H]⁺＝473.3235；found 473.3233.

实施例7化合物27和28的制备

化合物27和28的制备路线如下所示：

具体制备过程如下：

步骤1：将实施例22步骤3所得产物(1当量)溶于二氯甲烷。加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌3小时。待原料反应完后，旋干，得到油状粗产物。

步骤2：将羧酸(1.02当量)置于反应瓶，加入DMF，冰水浴下搅拌。依次向反应瓶中加入DIPEA(8当量)、缩合剂HATU(1.02当量)。0℃下搅拌15分钟后，加入上步反应产物，室温下搅拌6小时。待原料反应完后，加入水淬灭反应，加入乙酸乙酯稀释反应液，萃取。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗一次，经干燥、浓缩后得到油状粗产物。粗品通过柱层析分离纯化，得到无色油状产物。

步骤3：称取步骤2产物(1当量)置于反应瓶，加入醋酸钯(0.1当量)、磷酸钾(4 当量)、四氟硼酸三正丁基磷(0.2当量)以及正丁基硼酸(2当量)，加入甲苯和纯水，置换N₂三次。将反应瓶置于90℃加热搅拌。12小时后，TLC监测到原料基本反应完。待反应瓶冷却至室温后，用硅藻土过滤，旋干滤液，经柱层析得到产物。

步骤4：将上步反应产物(1当量)置于反应瓶中，加入二氯甲烷，加入三氟乙酸(10当量)，室温下搅拌12小时。待原料反应完，旋干反应液，得到粗产物。

步骤5：将所得油状产物溶于DMF，冰水浴下搅拌，依次加入N,N-二异丙基乙胺DIPEA (6当量)、缩合剂HATU(1.2当量)，0℃搅拌15分钟后，加入盐酸羟胺(4当量)，室温反应6小时。待反应结束后，反应液用乙酸乙酯稀释，加入水溶液，萃取。有机相用10％柠檬酸溶液洗一次，再用饱和碳酸氢钠溶液洗一次。最后有机相经干燥、浓缩后得到油状粗品，经制备得到产物。

化合物27的路线：

化合物27的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.88(d,J＝8.3Hz,2H),7.16(d,J＝8.3Hz,2H),5.43(dd,J＝8.2,4.4Hz,1H),3.97(d,J＝9.7Hz,1H),3.69(d,J＝9.7Hz,1H),3.11 (dt,J＝14.6,4.8Hz,1H),2.48(dd,J＝12.8,8.2Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H),2.21(dd, J＝14.7,5.5Hz,1H),2.03–1.85(m,4H),1.80–1.69(m,2H),1.68–1.58(m,3H),1.57–1.48(m, 1H),1.33(ddd,J＝13.8,9.0,5.1Hz,1H),1.25–1.14(m,1H),1.09–0.99(m,3H),0.84–0.76(m, 1H),0.77–0.63(m,4H),0.59–0.51(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₇H₃₄N₄O₄[M+Na]⁺＝501.2478；found 501.2502.

化合物28的路线：

化合物28的谱图数据：¹H NMR(400MHz,MeOD)δ7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.30(d,J＝8.2Hz,2H),5.44(dd,J＝8.2,4.3Hz,1H),3.98(d,J＝9.7Hz,1H),3.70(d,J＝9.7Hz,1H),3.18– 3.07(m,1H),2.70–2.62(m,2H),2.49(dd,J＝12.8,8.2Hz,1H),2.39(dd,J＝14.7,9.2Hz,1H), 2.21(dd,J＝14.7,5.5Hz,1H),2.04–1.86(m,3H),1.75(ddd,J＝13.5,9.7,4.8Hz,2H),1.62(dt, J＝13.0,7.5Hz,5H),1.56–1.49(m,1H),1.39–1.28(m,3H),1.21(ddd,J＝12.0,7.8,2.9Hz, 1H),1.07(dt,J＝12.3,8.2Hz,1H),0.94(t,J＝7.4Hz,3H),0.85–0.76(m,1H),0.75–0.64(m, 2H),0.61–0.51(m,1H).

HRMS(ESI):calculated for C₂₈H₃₈N₄O₄[M+H]⁺＝495.2971；found 495.2946.

化合物的结果如表1所示。

表1化合物结构

实施例8化合物抑菌活性测试

测试化合物的最小抑菌试验MIC，具体测试过程如下：

(1)配制好固体培养基和液体培养基，高压灭菌121℃，20min；

(2)增菌：按标准方法进行菌种复苏、增菌、培养，增菌后的对数生长期菌液用无菌水或生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准约1-2×10⁸CFU/mL，用培养基稀释1000倍使用，即菌液工作浓度为10⁵CFU/mL；

(3)配药：受试物与抗生素使用0.22μm滤膜过滤除菌，用相应溶剂配制药物母液1280μg/mL备用；使用培养基配制不同浓度的药物(64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125μg/mL)，体积为100μL；

(4)加药：96孔板中，每一行第1个孔为阴性对照(加200uL培养基)，第2个孔到第11个孔加入相应浓度的培养基配制的药物，第12个孔为阳性对照(加入100uL培养基)；每种药物做三个平行孔；

(5)加菌：第2个孔到第12个孔每孔加入100uL浓度为105CFU/mL菌液，第12个孔为阳性对照(加菌不加药)；则最终药物浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL；

(6)放入37℃培养箱中培养16h-24h；

(7)读数：在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC；或者在600nm处测OD值，与阴性对照比较，以溶液澄明无菌生长为有抗菌作用，其中以药液稀释度最大管的药液浓度为最小抑菌浓度(抑菌率>80％)；

(8)MBC：从各MIC浓度或高于2-6倍MIC浓度的孔中使用接种环分别蘸取一环，接种于固体培养基中，在37℃培养箱中倒置培养24h，无菌落出现的相应孔中的最低药物浓度，即为该药物的最小杀菌浓度(MBC)。

测试菌种为：大肠杆菌E.coli ATCC25922、金黄色葡萄球菌MRSA ATC43300和多重耐药菌MRSA S1。

测试结果如表2所示。

表2化合物对三种菌株的最小抑菌浓度

从表2中可知，本发明所述大部分化合物对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和多重耐药菌均表现出很好的抑制作用，其中尤其是化合物6、12、13、14、15、17、18、19、20、21、 22、27和28，对3中菌均表现出优异的抑制作用，尤其是对金黄色葡萄球菌具有很好的抑菌作用，可制备成为抑菌药物进行应用。

实施例9测试化合物对对人源PDF酶活性的作用

具体测试过程如下：

1、HsPDF蛋白的表达及纯化

含有HsPDF目的基因的质粒由华东师范大学提供。质粒转化到BL21细菌中，在含有200ug/uL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养至OD值达到0.6-0.8，加入0.4mM的IPTG 和100μM的CoCl₂诱导表达4h后收菌离心。取沉淀，在BufferA(20mM Hepes，300mM NaCl， 20mMimidazole)中超声破碎30min。取上清于12000g，4℃离心30min后去沉淀，取上清液加到Ni柱上，用BufferB(20mM Hepes，300mM NaCl，500mM imidazole)梯度冲洗Ni柱，收集蛋白洗脱液后跑SDS-PAGE胶确认蛋白纯度。蛋白于50％甘油，-80℃长期保存。

2、化合物酶活测试

将纯化好的HsPDF蛋白在缓冲液(20mM Hepes，50mM NaCl，0.005％Tween20)中稀释到终浓度为0.08uM，将100uL的稀释液加到96孔板中，然后在每个孔加入2uL不同浓度的化合物DMSO溶液(此处以HsPDF已知抑制剂Actinonin做阳性对照，不含化合物的纯DMSO 做阴性对照)，室温反应20min后，加入100uL浓度为1mM的底物肽f-MAHA，继续反应60min。与此同时，在另一个384孔板中加入9uL的荧光胺DMSO溶液(1mg/mL)，待96孔板中的反应完成后，取51uL反应液加到9uL的荧光胺溶液中反应5min，在连续多功能酶标仪中测试荧光值，计算每个化合物对应浓度的抑制率，用GraphPad Prism5算出化合物对HsPDF的IC₅₀。测得结果如表3所示。

表3化合物对HsPDF的IC₅₀值

化合物编号	HsPDF IC<sub>50</sub>(nM)	化合物编号	HsPDF IC<sub>50</sub>(nM)
				4	3.285	16	10.91
5	3.39	17	6.74
				6	9.151	18	11.44
7	21.32	19	8.12
				12	26.46	20	8.74
13	4.39	21	6.54
				14	20.32	23	4.33
15	3.35	Actinonin	27.22

从表3中可知，本发明所述化合物中大部分的化合物对于HsPDF具有很好的抑制作用，其抑制作用明显优于阳性对照Actinonin药物，尤其是化合物4、5、6、13、15、17、19、20、21和23，其IC₅₀值均低于10nM。

实施例10测试化合物对肿瘤细胞的抑制活性

测试采用的肿瘤细胞为：人结肠癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人骨肉瘤细胞、人急性早幼粒白血病细胞。

采用CCK-8法测定化合物1至28对于结直肠癌细胞、肺癌细胞、骨肉瘤细胞、急性早幼粒白血病细胞四种肿瘤细胞的增殖抑制效果。首先测定了26个化合物抗结直肠癌细胞增殖的活性，然后优选18个抗结直肠癌细胞增殖活性好的化合物，考察了其对结直肠癌细胞、肺癌细胞、骨肉瘤细胞、急性早幼粒白血病细胞四种肿瘤细胞的抑制活性。

具体测试过程如下：

(1)将HCT-116结直肠癌细胞株、A549肺癌细胞株、SJSA-1骨肉瘤细胞株、HL-60急性早幼粒白血病细胞株制成单细胞悬液，100uL接种于96孔培养板中，单细胞悬液的浓度为5000细胞/孔，CO₂培养箱(37℃，5％CO₂，95％空气)过夜培养；

(2)化合物1至28分别用DMSO溶解，配制成40mM的母液，然后依次稀释到浓度为10mM、3.3mM、1.1mM、0.33mM、0.11mM、0.033mM，各浓度分别取0.3uL加入到上述每孔细胞中，对照组加入0.3uL的DMSO使终浓度为1％，CO₂培养箱中培养48小时；

其中，HCT-116结直肠癌细胞采用1640培养基(10％含新生牛血清、1％双抗)，A549肺癌细胞采用1640培养基(10％含新生牛血清、1％双抗)，SJSA-1骨肉瘤细胞采用培DMEM培养基(10％含新生牛血清、1％双抗)，HL-60急性早幼粒白血病细胞采用IMDM培养基(10％含新生牛血清、1％双抗)；

(3)培养48h后每孔细胞加入10uL的CCK-8试剂，37℃孵育2小时后，使用Biotek 多功能酶标仪测450nm处吸光度A，计算对肿瘤细胞生长的抑制率；抑制率的计算方法为 1-(A药物处理组-A空白对照)/(A无药物处理组-A空白对照)，A为吸光度。

测得结果如表4和表5所示。

表4化合物浓度为10μM对HCT116的抑制率

从表4中可知，本发明所述化合物在10μM时，对HCT116均表现出一定程度的抑制作用，其中尤其是化合物1、2、8、15、16、17、19、20、21、22、23、24，对HCT116的抑制率均高于70％，其中化合物17、19、20和21的抑制作用最佳，为100％或接近100％，对于HCT116表现出优异的抑制作用，可抑制HCT116细胞，表明本发明所述化合物可制备成为抗HCT116的药物进行应用。

表5化合物对多种癌细胞系的抑制作用

从表5可知，本发明所述大部分化合物对多种肿瘤细胞均表现出一定程度的抑制作用，其中尤其是化合物15、17、18、19、20和23，对于4种肿瘤细胞均表现出明显的抑制作用，其IC₅₀值均低于10μM，对4种肿瘤细胞表现出优异的抑制作用，可抑制4种肿瘤细胞，表明本发明所述化合物可制备成为抗4种肿瘤细胞的药物进行应用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一类杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的结构选自如下结构中的任一一种：

2.权利要求1所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂在制备成为肽脱甲酰基酶抑制剂药物中的应用。

3.权利要求1所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂在制备成为抑菌剂药物中的应用。

4.权利要求1所述杂环类肽脱甲酰基酶抑制剂在制备成为抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗人结肠癌、人非小细胞肺癌、人骨肉瘤或人急性早幼粒白血病药物中的一种或多种。