CN109833457A - 虎杖及姜黄及其活性物在治疗间质性肺病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及虎杖及姜黄组方，及其在制备用于治疗间质性肺疾病的药物中的应用；本发明还涉及虎杖苷和姜黄素的组合物，及其在制备用于治疗间质性肺疾病的药物中的应用。

Description

虎杖及姜黄及其活性物在治疗间质性肺病中的应用

技术领域

本发明涉及虎杖及姜黄组方在治疗间质性肺疾病中的应用，本发明还涉及虎杖苷和姜黄素的组合物在治疗间质性肺疾病中的应用。

背景技术

间质性肺疾病(ILD)是以弥漫性肺实质、肺泡炎症和间质纤维化为病理基本病变，以活动性呼吸困难、X线胸片弥漫性浸润阴影、限制性通气障碍、弥散(DLCO)功能降低和低氧血症为临床表现的不同种类疾病群构成的临床-病理实体的总称。ILD的主要表现为累及膜性和呼吸性细支气管的炎症性改变；棕褐色色素沉着的巨噬细胞具有特征性；病因大多不明，启动ILD的致病因子通常是毒素和(或)抗原，也与病毒感染有关；细支气管可因黏液积聚而扩张，管壁轻度增厚，与慢性感染或变态反应及慢性刺激有关；有较明显阻塞性肺气肿者可能与吸烟，中毒或大气污染反应有关。已知的抗原吸入如无机粉尘与石棉肺、尘肺(肺尘埃沉着病)相关，有机粉尘与外源性过敏性肺泡炎相关，而特发性肺纤维化(IPF)和结节病等的特异性抗原尚不清楚。

ILD的典型临床表现包括：渐进性劳力性气促、干咳、双下肺吸气末捻发音或湿啰音，杵状指，胸片示双肺弥漫性网格状影。最终可导致严重的双肺纤维化(蜂窝肺)、引起呼吸衰竭和肺心病。通常没有肺外表现，但可有一些伴随症状，如食欲减退、体重减轻、消瘦、无力等。气促是最常见的首诊症状，多为隐匿性，在较剧烈活动时开始，渐进性加重，常伴浅快呼吸。很多患者伴有明显的易疲劳感。多数ILD患者有咳嗽症状，多以干咳为主。个别病例有少量白痰或白泡沫痰。胸痛较少见，个别结节病患者诉胸骨后隐痛，亦可见于ILD合并胸膜病变的患者。喘鸣较少见，主要见于外源性过敏性肺泡炎或嗜酸细胞性肺炎患者。咯血也较少见，主要见于弥漫性肺泡出血综合征，肺血管病变及肺部恶性病变。

间质性肺病种类繁多，大多数疾病如果早期发现并正确诊断，并给予合理有效的治疗可以减轻症状，阻止或减慢肺纤维化形成，缓解并控制病情发展。甚至很大一部分如果早期正确诊断并给以合理有效的治疗是可能被治愈。而发展到晚期形成两肺广泛的纤维化(蜂窝肺)时，肺移植是目前唯一的治疗手段。

现有技术中有关于虎杖苷对体外培养的人肺A549细胞中TGF-β1诱导EMT的抑制作用参见“中国中西医结合杂志，2016年4月第36卷第4期”，其中仅仅涉及对体外培养人肺A549细胞纤维化生成相关因子进行检测。

发明内容

本发明涉及用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物组方，所述药物组方包含虎杖及姜黄；本发明还涉及用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含虎杖苷及姜黄素；本发明还涉及包含虎杖及姜黄的药物组方在制备用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物中的应用；本发明还涉及包含虎杖苷及姜黄素的药物组合物在制备用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物中的应用。

优选地，所述虎杖及姜黄的给药剂量在1g/kg/天到20g/kg/天的范围内，优选在3g/kg/天到14g/kg/天的范围内。

优选地，所述虎杖苷及姜黄素的给药剂量在10mg/kg/天到300mg/kg/天的范围内，优选在50mg/kg/天到200mg/kg/天的范围内。

优选地，本发明的药物由虎杖及姜黄组成。

优选地，本发明的药物由虎杖苷及姜黄素组成。

优选地，上述虎杖及姜黄以重量计的配比为1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1。

优选地，上述虎杖苷及姜黄素以重量计的配比为1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1。

优选地，本发明的药物制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸。

优选地，本发明的药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。

尤其是，本发明的药物能够改善肺间质病变的炎症及纤维化程度、改善肺功能及相关生化指标、抑制介导纤维化发生的相关因子。

本申请采用国际公认的小鼠肺间质病变模型，用虎杖及姜黄组方以及虎杖苷和姜黄素的组合物进行治疗，显示出可以改善肺间质病变的炎症及纤维化程度、改善肺功能及相关生化指标、抑制介导纤维化发生的相关因子。虎杖及姜黄组方的低剂量组和高剂量组均显示出优于阳性药物组的疗效；虎杖苷和姜黄素组合物的低剂量组和中剂量组均显示出优于阳性药物组的疗效。

上述模型动物肺组织的病理变化包括水肿、渗出、弥漫性肺间质及肺泡炎症细胞浸润、淋巴细胞增生，肺上皮细胞等炎症细胞的增生；大、小血管周围有异常纤维细胞增殖、增宽；弥漫性肺纤维化病变；肺间质出血、瘀血，有部分肺泡失去正常结构，这些病理损伤的多样性和复杂性真实模拟了间质性肺疾病的病例变化特点，保证了本申请中实验结果的科学性和真实性，有明显的优势及创新性。

附图说明

图1：显示了4周后，正常对照组小鼠的肺组织切片照片；

图2：显示了4周后，模型对照组小鼠的肺组织切片照片；

图3：显示了4周后，阳性对照药组小鼠的肺组织切片照片；

图4：显示了4周后，成分组合物高剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图5：显示了4周后，成分组合物中剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图6：显示了4周后，成分组合物低剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图7：显示了4周后，组方高剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图8：显示了4周后，组方中剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图9：显示了4周后，组方低剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图10：显示了8周后，正常对照组小鼠的肺组织切片照片；

图11：显示了8周后，模型对照组小鼠的肺组织切片照片；

图12：显示了8周后，阳性对照药组小鼠的肺组织切片照片；

图13：显示了8周后，成分组合物高剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图14：显示了8周后，成分组合物中剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图15：显示了8周后，成分组合物低剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图16：显示了8周后，组方高剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图17：显示了8周后，组方中剂量组小鼠的肺组织切片照片；

图18：显示了8周后，组方低剂量组小鼠的肺组织切片照片。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。

实施例：

实验材料和方法

1.试验动物：

SPF级雄性C57/BL6小鼠150只，4周龄，体重20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0006)。

2.受试药物：

组方由虎杖和姜黄组成，由北京中医药大学东方医院提供；虎杖苷与姜黄素单体(批号：H-012)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；醋酸泼尼松片5mg/片(批号：1709109)，购自天津力生制药股份有限公司；注射用盐酸博莱霉素，购自日本化药株式会社。

3.药物剂量：

醋酸泼尼松片，人每日用量为20～60mg/60kg/d，试验时按60mg/60kg/d计。试验时换算成小鼠用量为为10mg/kg/d。

虎杖和姜黄组合物(虎杖和姜黄以重量计的配比为1∶1)：根据国家药典标准剂量，试验中小鼠采用剂量为：高剂量组13.34g/kg/d；中剂量组6.67g/kg/d；低剂量组3.3g/kg/d。

虎杖苷和姜黄素组合物(虎杖苷和姜黄素以重量计的配比为1∶1)：根据生药材含量折算成成分，试验中小鼠采用剂量为：高剂量组200mg/kg/d；中剂量组100mg/kg/d；低剂量组50mg/kg/d。

4.试验试剂：

丙二醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号Lot#K1723021)，异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司(批号217180101)。

5.试验方法：

健康小鼠自由饮水进食，适应性喂养1周后随机分为造模组135只和正常组15只。造模组小鼠禁食12h后，给予异氟烷联合丙二醇(3∶2)吸入麻醉后气管内给药造模。用1000μl移液枪，吸1ml麻药滴入自制麻醉装置中，将小鼠放入其中1min内麻醉(麻醉标准：呈深而慢的呼吸状态)。将小鼠上牙齿迅速悬吊在悬吊装置上，身体呈竖直状态，用小镊子拉出舌，用200μl移液枪向气管内快速滴入50μl博来霉素，旋转动物，使药液在肺内均匀分布；待小鼠自然苏醒，放回笼中。正常对照组同上方法气管内注入生理盐水50μL。按随机数表法分为正常对照组(15只)、模型对照组(20只)、阳性对照药组(20只)(醋酸泼尼松片组10mg/kg/d)，组方高、中、低剂量组(高剂量组13.34g/kg/d；中剂量组6.67g/kg/d；低剂量组3.3g/kg/d)(各15只)，成分组合物高、中、低剂量组(高剂量组200mg/kg/d；中剂量组100mg/kg/d；低剂量组50mg/kg/d)(各15只)。造模7天后给药，连续8周。分别在给药4周、8周，各组解剖6只动物，检测下列指标：

各组小鼠，摘眼球取血，静置离心取血清用于ELISA及生化检测；取右侧肺，液氮冻存，用于RT-PCR、Westem blot检测；左侧肺脏4％多聚甲醛固定，用于病理检测。

实施例1：给药4周后的结果

肉眼观察的结果：

正常对照组(生理盐水50μL)，所送检6只小鼠肺部组织未见有明显颜色改变，结构正常；

模型对照组(生理盐水50μL)，所送检6只小鼠大部分肺部组织表面有不同程度的灰色病变，较弥漫，表面未见有渗出；

阳性对照药组：所送检6只小鼠肺部表面有局限性轻度灰色病变；

虎杖苷和姜黄素组合物组(成分组合物组)：高、中、低三个不同剂量组(高剂量组200mg/kg/d；中剂量组100mg/kg/d；低剂量组50mg/kg/d)的小鼠肺表面有不同程度的局限性轻度灰色病变，与模型对照组相比，病变有不同程度改善或明显减轻；

虎杖和姜黄组方组(组方组)：高、中、低三个不同剂量组(高剂量组13.34g/kg/d；中剂量组6.67g/kg/d；低剂量组3.3g/kg/d)小鼠肺表面有不同程度局限性灰色病变，与模型对照组相比，肺部病变有不同程度的减轻。

肉眼观察分级标准：

“-”：小鼠肺组织表面未见有明显病变，结构正常。

“+”：小鼠肺表面有轻度的局限性灰色病变。

“++”：小鼠肺表面大片状局限性灰色病变，肺表面未见有渗血。

“+++”：小鼠肺表面有大面积弥漫性灰色病变。

表1：肉眼下小鼠肺组织各组之间肺部病变观察比较：

表2：肉眼下小鼠肺组织各组之间肺部病变观察统计：

从上表1和表2可以看出，成分组合物中剂量组和成分组合物低剂量组要显著好于阳性药组，没有出现小鼠肺表面大片状局限性灰色病变；组方高剂量组和组方低剂量组肺结构正常的小鼠数目要多于其他组，而且组方低剂量组没有出现小鼠肺表面大片状局限性灰色病变；与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著。

显微镜下观察结果：

正常对照组：6只小鼠肺部组织间质未见有炎症，未见有水肿，肺间隔未见有纤维化，结构正常；

模型对照组：小鼠肺部组织有轻度水肿，并有蛋白渗出，被染成粉色。有弥漫性肺间质及肺泡炎症细胞浸润，以单核细胞、中性分叶核、多核巨细胞，淋巴细胞增生，肺上皮细胞等炎症细胞增生。大、小血管周围有异常纤维细胞增殖、增宽，大量肺泡炎症、肺纤维化特征大量粗细不等，肺纤维病变较弥漫，肺间质有出血、瘀血，有部分肺泡失去正常结构；

阳性对照药组：6只小鼠肺部组织间质炎症增生，及小鼠肺泡粗细不等的纤维化等病变，与模型对照组相比有不同程度的改善或减轻；

成分组合物组：高、中、低三个不同剂量组小鼠肺部组织间质炎症增生、出血、水肿及肺泡粗细不等的纤维化，与模型对照组相比，病变有不同程度明显的改善；

组方组：高、中、低三个不同剂量组小鼠肺部组织间质炎症增生，肺泡纤维化，与模型对照组相比，肺部病变有不同程度改善。

镜下观察分级标准：

“-”：小鼠肺部组织间质未见有炎症，肺组织未见有异常改变，结构正常；

“+”：小鼠肺部组织间质有轻度的局限性炎症，病变占肺部组织20％左右；

“++”：小鼠肺部组织间质有轻度肺泡炎症及病变，占肺部组织20～50％左右；

“+++”：小鼠肺部组织炎症、出血、纤维化等病变较弥漫，大于肺部组织50％以上。

表3：镜下小鼠肺组织各组之间肺部炎症病变观察比较：

表4：镜下小鼠肺组织各组之间肺部炎症病变观察统计：

从上表3和表4可以看出，从肺部炎症病变的角度，成分组合物中剂量组和成分组合物低剂量组要显著好于阳性药组，出现小鼠肺部组织间质有轻度肺泡炎症及病变，占肺部组织20～50％左右的数目要低于阳性药组；组方中剂量组和组方低剂量组要显著好于阳性药组，出现小鼠肺部组织间质有轻度肺泡炎症及病变，占肺部组织20～50％左右的数目要低于阳性药组；与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著。

表5：镜下小鼠肺组织各组之间肺间质纤维化炎症病变观察比较：

表6：镜下小鼠肺组织各组之间肺间质纤维化炎症病变观察统计：

从上表5和表6可以看出，从肺间质纤维化炎症病变的角度，成分组合物高剂量组，成分组合物中剂量组和成分组合物低剂量组都要显著好于阳性药组，出现表示为“++”的肺间质纤维化炎症病变的数目都远低于阳性药组；组方高剂量组，组方中剂量组和组方低剂量也都显著好于阳性药组，出现表示为“++”的肺间质纤维化炎症病变的数目都远低于阳性药组；与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著。

此外，参见图1-图9，HE染色可以看出，给药4周后，正常对照组，肺部正常(图1)；模型对照组小鼠肺组织间质大量增殖大小不等炎症细胞，失去正常肺泡结构(图2)；阳性药组小鼠肺组织肺泡间质炎症及纤维化有一定改善或减轻(图3)；成分组合物高剂量组小鼠肺组织肺泡间质纤维化及炎症有减轻或改善(图4)；成分组合物中剂量组小鼠肺组织间质炎症、水肿，肺泡纤维化有减轻(图5)；成分组合物低剂量组小鼠肺组织间质炎症增生、肺泡纤维化有明显减轻(图6)；组方高剂量组小鼠肺组织炎症有减轻，肺泡纤维化有改善(图7)；组方中剂量组小鼠肺组织炎症减轻，肺泡纤维化有改善(图8)；组方低剂量组小鼠肺组织炎症及肺泡纤维化有改善。可以看出，成分组合物低剂量组显示出比阳性药组更好的疗效，小鼠的肺组织间质炎症增生、肺泡纤维化有明显减(图9)。

实施例2：给药8周后的结果

肉眼观察的结果：

正常对照组(生理盐水50μL)：所送检6只小鼠肺部组织表面未见有充血、瘀血，组织未见有增大，未见水肿，未见有灰色样变，结构正常；

模型对照组(生理盐水50μL)：所送检6只小鼠肺部组织有不同程度的瘀血、肿大，表面上端有大面积灰色变，被面未见有明显的病变；

阳性对照药组：6只小鼠肺部组织瘀血、灰色变及肿胀有不同程度减轻；

虎杖苷和姜黄素组合物组(成分组合物组)：高、中、低三个不同剂量组(高剂量组200mg/kg/d；中剂量组100mg/kg/d；低剂量组50mg/kg/d)每组6只，共18只小鼠肺组织表面瘀血、肺肿胀及灰色变等与模型对照组相比，病变有不同程度改善或减轻；

虎杖和姜黄组方组(组方组)：高、中、低三个不同剂量组(高剂量组13.34g/kg/d；中剂量组6.67g/kg/d；低剂量组3.3g/kg/d)共15只小鼠，肺组织瘀血、灰色变、肺组织肿胀等病变，与模型对照组相比，肺部病变有不同程度的减轻。

肉眼观察分级标准：

“-”：小鼠肺组织未见有充血、瘀血，肺表面被面未见有灰色斑块，结构正常；

“±”：小鼠肺组织有轻度充血，未见有明显瘀血，肺表面被面未见有灰色变，肺组织未见有肿胀；

“+”：小鼠肺组织有充血，有局限性小片状瘀血，肺表面未见有灰色斑块，肺组织未见有明显水肿；

“++”：小鼠肺组织有明显瘀血，肺组织有肿胀，细胞个体较大，肺表面上端有大片状灰色变，被面未见有明显病变。

表7：肉眼下小鼠肺组织各组之间肺部病变观察比较：

表8：肉眼下小鼠肺组织各组之间肺部病变观察统计：

从上表7和表8可以看出，成分组合物低剂量组要显著好于阳性药组，肺组织有轻度充血的的小鼠数量低于阳性对照药组，与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著。

镜下观察分级标准：

“-”：小鼠肺部组织间质未见有炎症，未见有肿胀，肺组织未见有异常变化，结构正常；细支气管未见有明显病变；

“+”：小鼠肺间质有局限性炎症，病变组织占肺部细支气管肺部组织20％左右；

“++”：小鼠肺间质有轻度炎症，有轻度纤维素渗出；细支气管病变较30％左右；

“+++”：小鼠肺间质炎症出血、细支气管周围炎症较重，纤维化等病变占肺部组织20％-50％，炎症较重；

“++++”：小鼠肺间质细支气管炎症较弥漫、纤维素渗出，蜂窝样改变、淋巴细胞形成，纤维化较弥漫，约50％以上。

镜下观察：

正常对照组：6只小鼠肺部组织间质未见有炎症，肺组织未见有水肿，肺间隔未见有增厚，未见有滤泡形成，肺泡管未见有囊性扩张，未见有肺纤维化，细支气管周围未见炎症，结构正常；

模型对照组：6只小鼠肺部组织有不同程度水肿，肺泡内有粉色纤维素渗出，形成透明膜，间质有大量组织细胞增生，细胞较肥大，有较多巨噬细胞增生，大量炎症细胞以淋巴细胞为主，少量分叶核、嗜酸细胞、单核等细胞渗出。并有淋巴滤泡形成，蜂窝样肺形成，肺泡壁明显增厚，肺纤维化形成。细支气管末梢有囊性变，周围有炎细胞增生，有个别支气管周围有平滑肌增厚，病变较重、较弥漫；

阳性对照药组：6只小鼠肺组织、肺泡炎性渗出、肺水肿纤维化及细支气管病变与模型对照组相比，有不同程度的减轻；

成分组合物组：高、中、低三个不同剂量组18只小鼠肺部组织间质炎症、滤泡增生、肺纤维化及细支气管等病变，与模型对照组相比，有不同程度明显的改善；

组方组：高、中、低三个不同剂量组15只小鼠肺组织间质炎症渗出、水肿、淋巴滤泡形成，肺泡纤维增生及细支气管病变等病变，与模型对照组相比，肺部病变有不同程度的改善。

表9：镜下小鼠肺组织各组之间肺部炎症病变观察比较：

表10：镜下小鼠肺组织各组之间肺部炎症病变观察统计：

从上表7和表8可以看出，成分组合物低剂量组要显著好于阳性药组，没有出现小鼠肺间质炎症出血、细支气管周围炎症较重，纤维化等病变占肺部组织20％-50％，炎症较重的小鼠；并且，与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著。

此外，参见图10-18，HE染色可以看出，给药8周后，正常对照组，小鼠肺内细支气管周围未见有炎症(图10)；模型对照组小鼠肺间隔纤维增厚，纤维素析出，形成透明膜(图11)；阳性对照药组小鼠肺组织细支气管周围有轻度细胞增生(图12)；成分组合物高剂量组小鼠肺组织肺泡纤维素渗出有减轻，间质炎症减少(图13)；成分组合物中剂量组小鼠肺细支气管周围炎症减轻(图14)；成分组合物低剂量组小鼠肺蜂窝样改变、间质炎症有减轻(图15)；组方高剂量组小鼠肺组织细支气管周围炎症减轻(图16)；组方中剂量组小鼠肺间质炎症纤维素渗出、间质炎症有减轻(图17)；小鼠肺细支气管周围炎症、气道囊性变有改善(图17)。可以看出，成分组合物低剂量组显示出比阳性药组更好的疗效，小鼠的肺蜂窝样改变、间质炎症有减轻。而且，与模型对照组相比，成分组合物组和组方组效果更为显著，小鼠肺细支气管周围炎症、肺间质炎症纤维素深处，间质炎症，小鼠肺蜂窝样改变，气道囊性变等有减轻或改善。

结论：

本申请采用国际公认的小鼠肺间质病变模型，用虎杖及姜黄组方以及虎杖苷和姜黄素的组合物进行治疗，显示出可以改善肺间质病变的炎症及纤维化程度。虎杖及姜黄组方的低剂量组和高剂量组均显示出优于阳性药物组的疗效；虎杖苷和姜黄素组合物的低剂量组和中剂量组均显示出优于阳性药物组的疗效。

Claims (11)

1.用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物组方，所述药物组方包含虎杖及姜黄。

2.根据权利要求1的药物组方，所述虎杖及姜黄的给药剂量在1g/kg/天到20g/kg/天的范围内，优选在3g/kg/天到14g/kg/天的范围内。

3.用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物组合物，所述药物组合物包含虎杖苷及姜黄素。

4.根据权利要求3的药物组合物，所述虎杖苷及姜黄素的给药剂量在10mg/kg/天到300mg/kg/天的范围内，优选在50mg/kg/天到200mg/kg/天的范围内。

5.权利要求1或2任一项的组方在制备用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物中的应用。

6.权利要求3或4任一项的药物组合物在制备用于治疗肺间质性炎症及肺纤维化的药物中的应用。

7.根据权利要求5或6的应用，其特征在于，所述药物制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸。

8.根据权利要求5或6的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。

9.权利要求5或6的应用，其特征在于，所述药物能够改善肺间质病变的炎症及纤维化程度、改善肺功能及相关生化指标、抑制介导纤维化发生的相关因子。

10.权利要求1-2、5、7-9任一项中虎杖及姜黄以重量计的配比为1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1。

11.权利要求3-4、6、7-9任一项中虎杖苷及姜黄素以重量计的配比为1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1。