CN109833316A - 化合物xenocyloinA-F及其衍生物在制备抑制iNOS活性药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了化合物xenocyloinA‑F及其衍生物在制备抑制iNOS活性药物中的应用。所述化合物xenocyloinA‑F及其衍生物是通过抑制iNOS活性而产生抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病的作用，可用于制备抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种xenocyloin A-F及其衍生物的抑制iNOS活性在抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病等药物方面的应用。
背景技术
xenocyloins系列衍生物最早于20世纪80年代从Xenorhabdus spp.的发酵产物中分离发现的一类吲哚生物碱类化合物，报道有抗菌活性，未见有抗炎活性报道。近年从伯氏致病杆菌SN52、Xenorhabdus bovienii PacYellow发酵产物中也分离得到。xenocyloin有独特的分子结构和生物活性，能够选择性抑制NO的合成酶的活性而抑制NO的生成。一氧化氮(NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。
发明内容
本发明的目的在于提供化合物xenocyloinA-F及其衍生物在制备抑制iNOS活性药物中的应用，化合物xenocyloinA-F及其衍生物通过抑制iNOS活性而产生抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病的作用。
本发明将购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)的鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。DMEM补充有L-谷氨酰胺(29.2mg/ml)，链霉素(10000μg/ml)，青霉素G(10000单位/ml)和10％热灭活的FBS。将RAW264.7细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中生长24小时。将所有测试化合物以10mM溶解于DMSO中，并且工作浓度为20μM(测定中DMSO浓度小于0.1％)。用测试化合物或0.5μMDEX(阳性对照)预处理细胞1小时，然后用LPS(100ng/ml)再刺激18小时。观察通过DMEM培养基温育的细胞作为正常对照。在没有任何干预的情况下由LPS刺激的细胞作为空白对照。
在通过LPS刺激细胞18小时后，通过使用RIPA裂解缓冲液(Cell Signalingtechnology，Boston，MA，USA)提取细胞总蛋白。缓冲液含有1×蛋白酶抑制剂混合物(RocheApplied Science，Germany)。我们使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)来测定蛋白质浓度。通过8％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离每泳道30微克蛋白质，然后转移至硝酸纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences，Buckinghamshire，UK)。将膜在5％脱脂乳中封闭，然后在4℃下用对β-肌动蛋白特异的小鼠抗体和一抗(iNOS和COX-2)孵育过夜。之后，随后将膜与山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(Santa Cruz，CA，USA)在室温下孵育1小时。使用ChemiDocTM XRS+和Image LabTM软件(武汉百乐珍生物技术有限公司，中国)定量蛋白质表达水平。
上述结果表明化合物xenocyloinA-F及其衍生物可用于制备抑制iNOS活性的药物，可用于制备抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病药物。所述化合物xenocyloinA-F及其衍生物是通过抑制iNOS活性而产生抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病的作用。优选地，所述抗炎药物包括治疗骨关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、化脓性骨髓炎的药物。
所述化合物xenocyloinA-F结构式如式(Ⅰ)所示：
所述xenocyloin A-F衍生物包括xenocyloin A-F衍生物及其异构体、非对映体、对映体，或者xenocyloin A-F衍生物的水解物、水合物、金属螯合物，或者xenocyloin A-F衍生物的医药用盐；所述xenocyloin A-F衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，R1＝H、酰基、烷基、烃基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基；R2＝H、烃基、羟基、烷基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基。R3＝烷基、酰基、羟基、烃基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基。
优选地，所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃；所述杂烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被O、S或N取代；所述卤代烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被F、Cl或Br取代。
优选地，R1中所述酰基为乙酰基、丙酰基或丁酰基；R2中所述烃基为甲烃基、乙烃基或丙烃基；R3中所述烷基为甲烷基或乙烷基，所述酰基为对氯苯甲酰基或酰胺基。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明表明xenocyloin A-F具有较好的抗iNOS活性，有望制成毒性小，活性强的抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病药物。
本发明获得的xenocyloin A-F衍生物经抗iNOS活性测试具有较强的抗炎活性，有望制成毒性小，活性强的抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病药物。
附图说明
图1为实施例1的结果图；
图2为实施例2的反应式。
具体实施方式
实施例1化合物xenocyloin A-F的抗iNOS活性
一氧化氮(NO)具有广泛而重要的生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),产生NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。
如图1结果所述，本发明通过Western blot analysis发现xenocyloin A-F能够抑制iNOS蛋白表达。包括以下步骤：将购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)的鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系维持在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。DMEM补充有L-谷氨酰胺(29.2mg/ml)，链霉素(10000μg/ml)，青霉素G(10000单位/ml)和10％热灭活的FBS。将RAW264.7细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中生长24小时。将所有测试化合物以10mM溶解于DMSO中，并且工作浓度为20μM(测定中DMSO浓度小于0.1％)。用测试化合物或0.5μM DEX(阳性对照)预处理细胞1小时，然后用LPS(100ng/ml)再刺激18小时。观察通过DMEM培养基温育的细胞作为正常对照。在没有任何干预的情况下由LPS刺激的细胞作为空白对照。
在通过LPS刺激细胞18小时后，通过使用RIPA裂解缓冲液(Cell Signalingtechnology，Boston，MA，USA)提取细胞总蛋白。缓冲液含有蛋白酶抑制剂混合物(RocheApplied Science，Germany)。我们使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)来测定蛋白质浓度。通过8％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离每泳道30μg蛋白质，然后转移至硝酸纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences，Buckinghamshire，UK)。将膜在5％脱脂乳中封闭，然后在4℃下用对β-肌动蛋白特异的小鼠抗体和抗体(iNOS和COX-2)孵育过夜。随后将膜与羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG 2种抗体(Santa Cruz，CA，USA)在室温下孵育1小时。使用ChemiDoc TM XRS+和Image LabTM软件(武汉百乐珍生物技术有限公司，中国)定量蛋白质表达水平。结果如图1。
实施例2一种xenocyloin B衍生物的制备方法(反应式见图2)
在带有加热、搅拌、回流冷凝管等装置的25ml二颈瓶中分别加入xenocyloin D(20mg)、对氯苯甲酰氯(30mg)、DMAP(20mg)、吡啶4ml，先室温反应1h后，再转移到油浴50℃条件下保温反应，TLC跟踪反应过程，8h后停止反应。减压蒸干吡啶后，加入30ml水后用乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并萃取液，用10％盐酸洗3次、饱和食盐水洗3次、无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩，柱色谱纯化得化合物，往纯化化合物中加入10ml 20％氢氧化钾水溶液水浴60℃加热3h后乙酸乙酯萃取(70ml×3)，合并萃取液，用10％盐酸洗3次、饱和食盐水洗3次、无水Na2SO4干燥，过滤，滤液浓缩，柱色谱纯化得化合物(xenocyloin B衍生物)。
所述的xenocyloin B衍生物结构式如式(III)
上述制备方法获得的xenocyloin B衍生物为白色粉末，收率为80％。
本发明获得的xenocyloin B衍生物经抗炎活性测试，结果显示对iNOS有很强的抑制活性，有望制成抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.化合物xenocyloinA-F在制备抑制iNOS活性药物中的应用。
2.化合物xenocyloinA-F在制备抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病药物中的应用，其特征在于，所述化合物xenocyloinA-F通过抑制iNOS活性而产生抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病的作用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物包括治疗骨关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、化脓性骨髓炎的药物。
4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述化合物xenocyloinA-F结构式如式(Ⅰ)所示：
xenocyloin A R1＝H R2＝CH3
xenocyloin B R1＝H R2＝CH2CH3
xenocyloin C R1＝COCH3 R2＝CH3
xenocyloin D R1＝COCH3 R2＝CH2CH3
xenocyloin E R1＝COCH2CH3 R2＝CH2CH3
xenocyloin F R1＝COCH2CH3 R2＝CH2CH3
式(Ⅰ)。
5.一种xenocyloin A-F衍生物，其特征在于，所述xenocyloin A-F衍生物包括xenocyloin A-F衍生物及其异构体、非对映体、对映体，或者xenocyloin A-F衍生物的水解物、水合物、金属螯合物，或者xenocyloin A-F衍生物的医药用盐；所述xenocyloin A-F衍生物的结构式如式(Ⅱ)所示：
式(Ⅱ)
其中，R1＝H、酰基、烷基、烃基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基；R2＝H、烃基、羟基、烷基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基。R3＝烷基、酰基、羟基、烃基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基。
6.如权利要求4所述的xenocyloin A-F衍生物，其特征在于，所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃；所述杂烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被O、S或N取代；所述卤代烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被F、Cl或Br取代。
7.如权利要求5所述的xenocyloin A-F衍生物，其特征在于，R1中所述酰基为乙酰基、丙酰基或丁酰基；R2中所述烃基为甲烃基、乙烃基或丙烃基；R3中所述烷基为甲烷基或乙烷基，所述酰基为对氯苯甲酰基或酰胺基。
8.如权利要求5至7任一项所述的xenocyloin A-F衍生物在制备抑制iNOS活性药物中的应用。
9.如权利要求5至7任一项所述的xenocyloin A-F衍生物在制备抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病药物中的应用，其特征在于，所述化合物xenocyloinA-F通过抑制iNOS活性而产生抗炎、抗肿瘤、抗心血管系统疾病的作用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗炎药物包括治疗骨关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、化脓性骨髓炎的药物。
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