CN109804078A - 使用固体对象的核酸提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用固体对象的核酸提取方法。相比传统核酸提取方法，通过在对象中形成核酸样品和亚氨酸酯化合物(imidoester compound)之间的复合物能够以更简单且成本更低的方式分离大量的和高纯度的核酸。特别是，与传统硅基材相比，用于提取核酸的薄膜设备具有改善的亲水性能，因此可更有效地提取核酸。

Description

使用固体对象的核酸提取方法
技术领域
本发明涉及使用固体对象提取核酸的方法，更具体而言，涉及通过简单方法从核酸来源(包括各种真核细胞、细菌细胞、病毒细胞或体液)中提取核酸的方法。
背景技术
核酸是鉴别疾病状态的重要分析工具，并且DNA生物标志物(如单核苷酸多态性(SNP))、突变或DNA甲基化帮助研究人员发现癌症的原因，在疾病早期阶段诊断和观察疾病状况，以及为监测和预后的巨大机会提供了重要线索。
因为与其它组分(如蛋白质)相比，核酸(如DNA)的生理浓度非常低(例如，每微升全血数十纳克的DNA对比数十微克的蛋白质)，从临床样本中有效提取DNA并预浓缩对于后续程序(例如扩增和检测)非常重要。在甲基化DNA的情况下，这个问题更重要。
DNA甲基化在正常真核细胞中的基因表达调控和染色质组织中起着至关重要的作用。DNA甲基化通过在胞嘧啶环的5-碳上共价添加甲基并产生5-甲基胞嘧啶而发生。这些甲基突出到DNA的主沟中并有效抑制转录。
在哺乳动物DNA中，在约4％的基因组DNA中发现5-甲基胞嘧啶，主要在胞嘧啶-鸟苷二核苷酸(CpG)中。这种CpG位点以低于人类总基因组中的预期频率而发生，但更常见于称为CpG岛的小长度DNA中。
这些岛通常存在于基因的启动子区域(在此处转录起始)中或附近。与基因组DNA(其大部分在CpG位点处甲基化)不同，正常的体细胞启动子和种系组织中的CpG岛保持未甲基化，导致基因表达。
DNA甲基化由高度相关的一组DNA甲基转移酶(DNMT)介导，DNMT将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移至CpG二核苷酸中的胞嘧啶。由DNMT建立的甲基胞嘧啶充当MeCP2蛋白的甲基-CpG结合结构域(MBD)，即MBD的结合位点。
MBD翻译甲基化DNA染色质环境，该甲基化DNA染色质环境对转录具有压抑性，并通过与组蛋白去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶和ATP依赖性染色质重塑酶的相互作用得以压缩。特别地，MBD是MeCP2蛋白的甲基CpG结合结构域，其结合至任意序列中对称甲基化的CpG并参与介导甲基化依赖性转录抑制。尽管有强有力的证据表明MeCP2在体内仅与甲基化的DNA片段结合，MeCP2在体外的DNA甲基化非依赖性结合活性也得到一致的记录，该活性可以适当地用于一般的体外DNA分析。
最近，高纯度纯化核酸的使用在诸如生物技术、诊断医学、药物医学和代谢医学的各种领域中一直在增加，因此一直在努力更快速地并且更纯地从各种生物样品中分离核酸。
然而，到目前为止在分离核酸的方法中与载体相关的技术已经发展得很好，所述载体从细胞裂解溶液中包含的各种物质(例如基因组DNA、质粒DNA、信使RNA、蛋白质、细胞碎片颗粒)中仅特异性地吸附核酸，并且几乎所有的研究都集中在吸附核酸的材料的研究和开发上。
因此，为了更快速且纯地分离核酸，更需要开发能够从细胞碎片颗粒、蛋白质变性聚集体和各种其它细胞降解物质中仅快速分离所需核酸的技术。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种提取核酸的方法及其设备，与使用所有需要大型设备(离心机和磁体等)的用于核酸提取的商品化试剂盒(包括传统Qiagen)提取核酸的方法相比，该方法能够简单且低成本地从各种核酸来源中提取大量且高纯度的核酸。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供了一种提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象中进行改性(步骤1)；通过将核酸样品和由以下化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成核酸和化合物的复合物(步骤2)；以及，通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取核酸(步骤3)。
另外，本发明提供了用于提取核酸的薄膜设备，所述薄膜设备包含：上层薄膜，所述上层薄膜具有分别穿过其的入口孔和出口孔；下层薄膜，所述下层薄膜与所述上层薄膜分开设置；微通道室，在所述微通道室中以内部图案的形式形成微通道，在所述微通道中入口端和出口端分别对应于所述上层薄膜的入口孔和出口孔并与其连通，并且注入路径在邻近所述入口端处形成，所述注入路径与所述微通道的入口连通，所述微通道室设置在所述上层薄膜和所述下层薄膜之间；以及，密封装置，所述密封装置用于密封所述上层薄膜和所述下层薄膜的每一侧，以密封所述微通道室。
另外，本发明提供了用于提高核酸提取效率的组合物，所述组合物包含由下述化学式1表示的化合物作为活性成分：
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
有益效果
根据本发明的提取核酸的方法可容易且快速地从各种核酸来源(包括真核细胞、细菌、病毒细胞或体液)提取核酸，并且使用用于核酸提取的薄膜设备时，相比传统硅基材而言，可通过改善亲水性更有效地提取核酸。
附图说明
图1为用于核酸提取的HINT(用于使用薄膜进行核酸提取的同型双官能亚氨酸酯类(HI)，homobifunctional imidoesters(HIs)for nucleic acids extraction usingthin films)系统的原理的示意图。
图2为示出了薄膜设备结构的分解视图。
图3为示出了根据二甲基辛二酰亚胺酯(DMS，dimethyl suberimidate)浓度的DNA提取效率的图表。
图4为示出了使用乳腺癌细胞的根据本发明的DTS分析、传统Qiagen试剂盒以及使用二甲基己二酰亚胺酯(DMA，dimethyl adipimidate)的分析的DNA提取效率的结果的图表，所述DMA为与DTS分析中使用的DMS类似的化合物。
图5为示出了根据本发明的DTS分析和根据使用DMA(与DTS分析中使用的DMS类似)的分析所提取的DNA的PCR扩增效率的图表。
图6为具体示出了微流体室的视图。
图7示出了用于RNA提取和DNA提取的HINT系统的基本特征。(A)投入的DNA(1μg人基因组DNA)与HI[二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)或二甲基庚二酰亚胺酯(DMP，dimethylpimelimidate)]的回收量。(B-C)使用不同浓度的DMS(100mg/mL、50mg/mL、20mg/mL和10mg/mL)从细胞(HCT116，结肠直肠癌细胞系)中提取的DNA的量(B)和纯度(C)。(D)用由系统提取的两种浓度(1×103和1×106)RNA进行的RNA的18S基因扩增。(E)根据DMS浓度(50mg/mL-250mg/mL)，用由系统提取的DNA进行的肌动蛋白基因扩增。L：DNA大小标记物；Q：用Qiagen试剂盒提取的RNA；N：阴性对照。
图8示出了HINT系统用于癌细胞系RNA提取的应用。(A-C)对于(A)AGS(胃癌细胞系)细胞、(B)HCT116(结肠直肠癌细胞系)细胞和(C)MCF7(乳腺癌细胞系)细胞，HINT系统的能力。(D)由提取的RNA中PCR扩增18S基因。(E)根据单步逆转录RT-PCR中HCT116细胞的浓度对循环数(CT)进行确认的结果。
图9示出了HINT系统用于癌细胞系DNA提取的应用。(A-B)对于(A)AGS(胃癌细胞系)和(B)HCT116(结肠直肠癌细胞系)，HINT系统的DNA提取的能力。(C)根据HCT116细胞的浓度，对通过应用DMS由HINT系统提取的DNA的RT-PCR循环数进行确认的结果。(D)采用不同大肠杆菌(E.coli)浓度由HINT系统提取的DNA的RT-PCR分析。
图10示出了在临床样品中HINT系统的验证。(A)从伴有血小板减少症综合征的严重发热(Severe fever with thrombocytopenia syndrome:SFTS)患者的血浆中提取病毒RNA。(B)从恙虫病(scrub typhus，ST)患者的血浆中提取细菌DNA。
图11示出了当将DMA、DMP或DMS应用于HINT系统时对DNA扩增效率进行比较的结果。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明的发明人研发了一种能从核酸样品中分离和提取核酸的提取方法；并发现通过形成核酸样品与由下列化学式1表示的化合物的复合物，该方法相比传统核酸提取方法可低成本且更简单地分离大量且高纯度的核酸，并且在不使用大型设备的情况下可在现场立即进行诊断，从而完成了本发明。
本发明涉及提取核酸的方法，所述方法包括：
通过将胺基引入对象中进行改性(步骤1)；
通过将核酸样品和由下述化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成核酸和化合物的复合物(步骤2)；以及
通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取所述核酸(步骤3)，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
优选地，在由所述化学式1表示的化合物中，n为5至7的整数。
所述对象可为薄膜设备、磁珠或纳米颗粒中的任一种，但不限于此。
所述核酸可包括DNA或RNA中的任一种，但不限于此。
所述核酸可包括甲基化DNA，但不限于此。
所述改性可通过在所述对象中引入硅烷化合物来进行，但不限于此。
所述硅烷化合物可为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，但不限于此。
本发明还可包括在步骤1之前通过等离子体处理对对象进行洗涤，但不限于此。
本发明可进一步包括在步骤2和步骤3之间对其中形成有复合物的对象进行洗涤，但不限于此。
所述核酸样品可为真核细胞、细菌细胞、病毒细胞、全血或尿液来源的样品，但不限于此。
本发明可进一步包括在步骤2中在经改性的对象上囊括蛋白酶和洗脱缓冲剂，但不限于此。
另外，本发明提供了用于提取核酸的薄膜设备，所述薄膜设备包含：上层薄膜，所述上层薄膜具有分别穿过其的入口孔和出口孔；下层薄膜，所述下层薄膜与所述上层薄膜分开设置；微通道室，在所述微通道室中以内部图案的形式形成微通道，在所述微通道中入口端和出口端分别对应于所述上层薄膜的入口孔和出口孔并与其连通，并且注入路径在邻近所述入口端处形成，所述注入路径与所述微通道的所述入口连通，所述微通道室设置在所述上层薄膜和所述下层薄膜之间；以及，密封装置，所述密封装置用于密封所述上层薄膜和所述下层薄膜的每一侧，以密封所述微通道室。
本发明还可包含第一管适配器，所述第一管适配器与所述上层薄膜的所述入口孔和所述微通道的所述入口端连通；以及第二管适配器，所述第二管适配器与所述上层薄膜的所述出口孔和所述微通道的所述出口端连通。
由下述化学式1表示的化合物可通过所述上层薄膜的所述入口孔注入所述微通道的所述入口端，并且核酸样品可通过所述微通道室的所述注入路径注入，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
优选地，在由所述化学式1表示的化合物中，n为5至7的整数。
所述微通道可被图案化成多次折叠。
所述微通道可包含多个扩展部分(具有扩展的截面)和多个缩小部分(具有比所述扩展部分小的截面)，并且所述扩展部分和所述缩小部分可交替设置。
在下文中，将参考本发明的附图详细描述本发明。
根据本发明的核酸分析为在薄膜设备中使用DMS对核酸进行分析的DTS(二甲基辛二酰亚胺酯/薄膜样品)分析，其包括样品洗脱/培养、洗涤和洗脱三个步骤，无需离心。例如，通过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为硅烷化合物对薄膜设备进行改性，并通过此类改性使疏水性薄膜设备转变为亲水性。
将核酸样品和洗脱缓冲剂以及DMS溶液注入到经改性的薄膜设备上。通过核酸的氨基与DMS的双官能胺基的相互作用，使用所述核酸和所述DMS之间的交联机制可形成所述核酸和所述DMS之间的复合物，从而可从所述样品中提取DNA。
另外，本发明提供了用于提高核酸提取效率的组合物，该组合物包含由下述化学式1表示的化合物作为活性成分，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
优选地，在所述化学式1中，n为5至7的整数。
所述组合物可进一步包含蛋白酶和洗脱缓冲剂，所述核酸可为DNA或RNA，但不限于此。
此外，本发明提供了用于提高核酸提取效率的试剂盒，所述试剂盒包含该组合物。
同时，由于本发明中使用的由化学式1表示的化合物包括双官能亚氨酸酯类，在本申请文件中也被称为同型双官能亚氨酸酯类(HI)，HI与核酸形成快速且强烈的键合从而形成复合物，并被捕获在用胺反应性基团改性的对象的表面上，由此能够高效提取核酸。
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
优选地，在所述化学式1中，n为5至7的整数。
本发明中使用的HI为二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)和二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)，对比实验使用二甲基己二酰亚胺酯(DMA，其与上述化合物具有类似的化学结构)进行。DMP(化学式2)、DMS(化学式3)和DMA(化学式4)的化学结构如下：
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
实施例
在下文中，将参考以下实施例对本发明进行详细描述。然而，应注意的是，以下实施例是用于说明本发明，而不旨在限制本发明的范围。提供本发明的实施例以向本领域技术人员更完全地描述本发明。
<实施例1>薄膜设备的制造和预处理
1.薄膜生产
使用激光切割设备(Universal Laser Systems，Scottsdale，USA)容易且快速地制造本发明的薄膜设备(参见图2)。首先，该薄膜设备由以下构成：上层薄膜和下层薄膜，以及插入在所述上层薄膜和所述下层薄膜之间的微流体室。该微流体室包含通过室中的流动路径互相连接的多个槽型微孔，用于从核酸来源提取DNA。
为了制造微流体室，使用激光切割设备在300μm厚的双面带(夹在100μm厚的双面带之间的100μm厚的聚酯膜)上切割微流体室图案以产生微流体室。使用激光切割机将薄膜(上层部分和下层部分)切割成与微流体室相同的尺寸。
在上层薄膜中制造作为通孔的入口和出口。使用永久性粘合剂将激光切割的薄膜(上层和下层)分别连接在激光切割的微流体室的上表面和下表面上。微流体室的高度为约300μm，总容积为300μL(300μL容积，8.4cm×3.7cm)。
用于注入核酸来源的管适配器通过以下方式来制备：将3mm厚的浇铸丙烯酸片材(cast acrylic sheet，MARGA CIPTA，印度尼西亚)连接到双面带的一侧，并用激光切割设备切割和穿孔。将制备的管适配器分别连接到微流体室的入口和出口。此后，将预切割的tygon管(AAC02548；Cole-Parmer，Vernon Hills，USA)置于适配器的孔中并用环氧树脂密封。
由此制造的薄膜设备具有能够处理各种容量(100μL、300μL和500μL)的核酸样品的优点。
2.薄膜设备的预处理
为了使用薄膜设备分析DNA，用氧等离子体处理薄膜设备内部10分钟，并在65℃下将经等离子体处理的薄膜设备浸泡在含有2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的水性溶液中10-60分钟，然后用去离子水彻底洗涤。在洗涤之后，为了固化薄膜设备，在氮气流下快速干燥经洗涤的薄膜设备，以用胺改性该薄膜设备。
使用Drop Shape Analyzer(DSA100，KRUSS，德国)进行的胺改性薄膜设备的水接触角测量表明，薄膜设备的亲水性根据温度和孵育时间而显著变化。用APTES在65℃下对薄膜设备进行硅烷化10分钟后，薄膜表面的亲水性增加(约30-40℃)。
<实施例2>DTS(二甲基辛二酰亚胺酯/薄膜样品)分析
在本发明中，将其中将二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)应用于如上所述制造的薄膜设备的核酸分析方法指定为DTS，并在以下实验中进行DTS分析。
即，制备优化的分析溶液，以使用先前用胺改性的薄膜设备(300μL量，8.4cm×3.7cm)提取DNA。通过将洗脱缓冲剂(含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA，1％SDS和10％Triton X-100)混合在DMS(50mg/mL)中来制备优化的分析溶液，并且作为核酸分析样品，将100μL来源于细胞、细菌、血液或尿液的每种样品与200μL的分析溶液混合。
将混合核酸分析样品和分析溶液的混合溶液引入用胺改性的薄膜设备的上层基材入口，在将混合溶液转移到微流体室的同时使DMS的两个胺基与DNA偶联，并且在薄膜设备中改性的胺基和DNA组合从而形成复合物并将DNA分离。此时，将薄膜设备放置在包含控制器(Alpha Omega Instruments)的热电冷却器(thermoelectric cooler，TEC)中或放置在培养箱中保持恒温(56℃)20分钟(以上两者之一)，以便从核酸分析样品中充分提取DNA。
为了除去DMS-DNA复合物中的异物，用PBS缓冲剂洗涤后，使用洗脱缓冲剂(10mM碳酸氢钠，pH 10.6)提取DNA。在测量提取的DNA的量和纯度后，使用Enspire MultimodePlate Reader(PerkinElmer)在260nm(DNA)和280nm(蛋白质)处测定样品的光密度比。为了比较传统DNA提取方法和本发明的DTS分析，根据已知方法使用QIAmp DNA mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)。
如图3所示，根据DMS浓度确定DNA结合效率，并确定当DMS浓度为50mg/mL-100mg/mL时DNA结合效率最高。
<实施例3>使用DTS分析从真核细胞中提取DNA
在5％CO2气氛、37℃湿润培养箱中，在补充10％胎牛血清(FCS)的高葡萄糖Dulbecco改良eagle培养基(DMEM，DMEM Life Technology)的塑料培养板中，培养六种真核细胞((MCF-7(乳腺)、NCI-H1975(肺)、CaCo-2(大肠)、T24(膀胱)、U937(淋巴细胞)和Jurkat(外周血))后，以与实施例2相同的方式从真核细胞中提取DNA，并用蛋白酶K(蛋白酶)处理以提取基因组DNA。并且为了比较，使用QIAmp DNA mini试剂盒从真核细胞中提取DNA。
实施终点PCR和实时PCR以确定DNA的量和纯度。将一些基因(HRAS、肌动蛋白和RARβ)的正向引物和反向引物合成为约24个碱基对的正常长度。终点PCR以如下方式进行：初始变性步骤，在95℃下15分钟；在95℃下45秒，在59℃下45秒(RARβ)，在72℃下45秒，45个循环；以及，最后的延伸步骤，在72℃下10分钟。在25μL的总体积中对5μL-10μL的DNA进行扩增，其中含有1×PCR缓冲剂(Qiagen)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸、25pmol的每种引物和1单位的Taq DNA聚合酶。对于实时PCR分析，如LightCycler 2.0(Roche Diagnostics)中所述来如下修改以下步骤。在20μL的总体积中对5μL-10μL的DNA进行扩增，其中含有4μL LightCycler FastStart DNA Master混合物、25pmol的每种引物、2μL 1×PCR缓冲剂(QUEAGEN)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸和蒸馏水。首先在95℃预处理10分钟后，进行50个循环的如下方案：在95℃下10秒，在58℃下30秒(对于HRAS和肌动蛋白基因)以及在72℃下10秒；然后在40℃冷却30秒。具有SYBR绿色信号的扩增产物在LightCycler 2.0(Roche Diagnostics)中进行。
为了研究来自提取的DNA的RARβ的表观遗传变异，在单个反应管中用MspI溶液或HpaII溶液(150μL)在37℃下消化DNA 20分钟。在消化步骤后，将单个反应管在80℃下放置10分钟以灭活限制酶。在灭活程序之后，将消化的DNA用作模板，用于使用传统PCR在定量分析中获得的RARβ基因的表观遗传分析。
另一方面，作为使用乳腺癌细胞，根据传统Qiagen试剂盒、根据本发明的DTS分析以及采用DMA(其为与DTS分析中使用的DMS类似的化合物)的分析对DNA提取效率进行比较和分析的结果，如图4所示，在采用DMS的分析中，可从乳腺癌细胞中以与DNA结合的形式提取DNA，而在采用DMA(二甲基己二酰亚胺酯)的分析中，不能从乳腺癌细胞中提取DNA。
如图5所示，与采用DMA的分析相比，采用DMS提取的DNA的PCR扩增效率提高了25％。
<实施例4>使用DTS分析从细菌细胞中提取DNA
用使用DTS分析提取的DNA进行基于PCR的DNA扩增，以确定细菌细胞中的DTS分析性能。使用大肠杆菌(Escherichia coli)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)和沙门氏菌菌株(Salmonella Strains)((鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、新港沙门氏菌(Salmonella Newport)和圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saintpaul))的所有商业引物。
为了优化反应，将洗脱缓冲剂(含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA，1％SDS，10％Triton X-100和20mg/mL溶菌酶)与DMS(50mg/mL)混合。实施PCR以验证本发明的DTS方法的有效性。将大肠杆菌XL1蓝色菌株接种到50μg/mL四环素和Luria-Bertani(LB)培养基中，在37℃下在震荡条件下培养一天，将103-107个菌落形成单位(CFU)的样品用于测试。从为了DTS分析和Qiagen试剂盒分析而培养的大肠杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌和沙门氏菌菌株(鼠伤寒沙门氏菌、新港沙门氏菌和圣保罗沙门氏菌)中提取细菌DNA。
关于细菌基因的遗传分析，按照以下方案对由DTS分析和Qiagen试剂盒分析提取的2μL DNA进行扩增，使用25μl的总体积(其中含有1×PCR缓冲剂(Qiagen，Hilden，德国)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸、25pmol的每种引物和1单位Taq DNA聚合酶)：在95℃下15分钟；95℃下30秒，60℃下30秒(脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌和沙门氏菌菌株)，72℃下30秒，45个循环；以及，在72℃下7分钟，最后的延伸步骤。通过凝胶电泳对PCR扩增产物进行可视化，其中，将PCR产物在含有溴化乙锭(EtBr)(Sigma-Aldrich)的2％琼脂糖凝胶上分离。使用Gel Doc System(Bio-Rad)使凝胶可视化。用UV分光光度计(Perkin-Elmer)进行DNA浓度和纯度的测量。
<实施例5>使用DTS分析从人体体液中提取DNA
为了验证DTS对人体体液的分析能力，将200μL体液(全血和尿液)引入薄膜设备中以提取DNA。首先，将洗脱缓冲剂与含有蛋白酶K和DMS的体液样品分别引入预先制备的薄膜设备中，然后转移到微通道室中以形成在体液样品中的DNA和DMA的复合物，并以与实施例2相同的方式提取DNA。此时，使用注射泵(KD Scientific，MA)将洗脱缓冲剂和体液样品以1.5mL/hr的流速引入两个不同的入口10分钟以用于提取和纯化DNA，并将盒在56℃下孵育20分钟。将用于通过注射泵流入PBS缓冲剂的入口的流速增加至4mL/hr，进行10分钟。最后，用100μL洗脱缓冲剂洗脱所提取的DNA。同时，为了比较，使用QIAmp DNA mini试剂盒(Hilden，德国)，将200μL全血或尿液用于基因组DNA提取。根据DNA浓度及其纯度，通过UV分光光度计(Perkin-Elmer)测定所有提取的DNA。
<实施例6>同型双官能亚氨酸酯类用于使用薄膜微流体平台的核酸提取的应用(HINT策略)
本发明人通过DTS(二甲基辛二酰亚胺酯/薄膜样品)分析从包括真核细胞或原核细胞在内的各种样品中提取和分析DNA，该分析是在前述实施例的薄膜设备中使用DMS的核酸分析。
本发明人还发现了HINT[用于使用薄膜进行核酸提取的同型双官能亚氨酸酯类(HI)]系统，该系统可使用基于薄膜的微流体平台提取RNA和DNA二者(图6)。作为同型双官能亚氨酸酯类(HI)，使用二甲基辛二酰亚胺酯(DMS)和二甲基庚二酰亚胺酯(DMP)，其由亚甲基基团和双官能亚氨酸酯基团组成(图6A)。在基于薄膜的微流体平台中，在单个通道上进行样品裂解、洗涤和洗脱。为了使用HINT系统从样品中提取RNA和DNA，将样品混合物、裂解缓冲剂和HI(DMS或DMP)移取到系统中，将表面预先用活性胺基活化并用于捕获核酸和HI复合物(图6B)。此后，对于RNA提取，反应在室温下进行10-20分钟；而对于DNA提取，反应在56℃下进行20分钟。反应后，可通过洗涤和洗脱提取核酸(RNA或DNA)。
同时，为了确定HINT系统可用于提取核酸(RNA和DNA)，在几种癌细胞系和细菌细胞系中证实了该系统的基本特征。在图7A中，对在有HI(DMS和DMP)的情况下和没有HI(DMS和DMP)的情况下所注射的DNA(1μg人基因组DNA)的回收进行测量。在DMS(黑色)和DMP(灰色)实验组中回收至少95％的DNA，在无HI的实验组中回收<50％的DNA(图7A)。为了优化用于人基因组DNA和RNA提取的系统方案，使用癌细胞系(1×106个乳腺癌细胞系(MCF7)或结肠直肠癌细胞系(HCT116)的细胞)。作为用于提取高质量和高容量核酸的优化方法，通过改变DMS浓度(100mg/mL、50mg/mL、20mg/mL和10mg/mL)对从癌细胞中提取的DNA的量(图7B)和纯度(图7C)进行测量。与DNA提取不同，RNA通常更难提取，因为它易于降解。为了在两种浓度的癌细胞(1×103和1×106)中提取RNA，将DMS或DMP应用于HINT系统。对于PCR比较实验，用由系统提取的两种浓度的RNA进行18S基因扩增，并实施单步逆转录终点PCR和单步逆转录RT-PCR。18S基因在106(CT：18.42±0.46，在DMS中；CT：17.86±0.32，在DMP中)和103(CT：32.15±0.09，在DMS中；CT：31.60±0.2，在DMP中)的细胞浓度中均强烈扩增(图7D)。对于使用HINT系统的DNA提取，将两种浓度的癌细胞(1×103和1×106)与各种浓度的DMS(50-250mg/mL)组合使用。用了比较的PCR，用由系统提取的两种浓度的DNA实施肌动蛋白基因扩增，并实施终点PCR和RT-PCR(图7E)。在1×106个细胞(CT：22.11±0.31；图7E)和1×103细胞(CT：31.73±0.01)中扩增到肌动蛋白基因，并在所有DMS条件下扩增到肌动蛋白。
为了进一步验证RNA提取分析中的HINT系统，从三种癌细胞系(包括AGS(胃癌细胞系)、HCT116(结肠直肠癌细胞系)和MCF7(乳腺癌细胞系))中提取RNA并进行分析，通过连续稀释使用1×101至1×105个细胞。确认了通过HINT系统提取的RNA的量取决于细胞的数量(图8A至图8C)。作为从提取的RNA中PCR扩增18S基因的结果，确认了从三种癌细胞系中提取的所有RNA均被强烈扩增(图8D)。图8E是在单步逆转录RT-PCR中根据HCT116细胞的浓度对循环数(CT)进行确认的结果。CT和细胞浓度之间显示出高线性(R2＝0.9907)。
为了在DNA提取分析中进一步验证HINT系统，从MCF7细胞、AGS细胞和HCT116细胞中提取DNA以用于PCR分析。使用相同浓度的细胞(1×106)，对HINT系统与Qiagen试剂盒进行比较。使用AGS细胞和HCT116细胞与DMS或DMP由HINT系统提取的DNA与由Qiagen试剂盒提取的DNA的扩增效率相当(图9A和图9B)。此外，在RT-PCR中，发现使用DMS或DMP由HINT系统提取的DNA取决于细胞的数量。使用DMS的实验结果显示在图9C中。另一方面，为了确认本系统对各种样品的适用性，从大肠杆菌中提取细菌DNA，并且细胞浓度范围为1×103至1×108CFU。在从连续稀释的样品中提取的DNA中大肠杆菌基因得到强烈扩增。由HINT系统提取的DNA具有与由Qiagen试剂盒提取的DNA相同水平的扩增效率(图9D)。
此外，在从螨介导的疾病样品(例如伴有血小板减少症综合症的严重发热(SFTS)和恙虫病(ST))提取病毒或细菌核酸(DNA和RNA)中，确认是否可应用HINT系统。使用Qiagen试剂盒和HINT系统(使用DMS)，从SFTS患者的血浆中提取病毒RNA。HINT系统的RT-PCR扩增效率与Qiagen试剂盒没有显著差异(图10A)。作为使用Qiagen试剂盒和HINT系统(使用DMS和DMP)从ST患者血浆中提取和分析细菌DNA的结果，发现HINT系统的RT-PCR扩增效率与Qiagen试剂盒的RT-PCR扩增效率相当(图10B)。
另一方面，进行使用DMA的比较实验，DMA是与本发明中使用的DMS和DMP类似的化合物。使用HCT116癌细胞系，分别加入DMA、DMS和DMP，通过HINT系统提取DNA，并对提取的DNA的扩增效率进行比较。如图11所示，在图11(A)中确认了与DMA相比，DMS和DMP的扩增效率快速进行2个循环，并且当确认了2个循环的效率差异时，由于理论上每个循环扩增产物增加2倍，当比较表达水平时，发现Ct值的差异为2的幂，并且确认使用DMP和DMS的效率约4倍高于DMA的效率(图11B)。
虽然已经结合目前被认为是实用的示例性实施方式描述了本发明，但应理解，本发明不限于所公开的实施方式，而是相反地，旨在涵盖在所附权利要求的精神和范围内包括的各种修改和等同布置。

Claims (21)

1.一种提取核酸的方法，所述方法包括：
步骤1：通过将胺基引入对象中进行改性；
步骤2：通过将核酸样品和由下述化学式1表示的化合物注入到经改性的对象上，形成所述核酸和所述化合物的复合物；以及
步骤3：通过用洗脱缓冲剂对其上形成有所述复合物的所述对象进行处理，来提取所述核酸，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述化学式1中，n为5至7的整数。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象为薄膜设备、磁珠和纳米颗粒中的任一种。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为DNA或RNA。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸为甲基化DNA。
6.如权利要求1所述的方法，其中，通过在所述对象中引入硅烷化合物进行所述改性。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述硅烷化合物为3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述步骤1之前通过等离子体处理对所述对象进行洗涤。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸样品为真核细胞、细菌细胞、病毒细胞、全血或尿液来源的样品。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括在所述步骤2中在所述经改性的对象上囊括蛋白酶和洗脱缓冲剂。
11.一种用于提取核酸的薄膜设备，所述薄膜设备包含：
上层薄膜，所述上层薄膜具有分别穿过其的入口孔和出口孔；
下层薄膜，所述下层薄膜与所述上层薄膜分开设置；
微通道室，在所述微通道室中以内部图案的方式形成微通道，所述微通道中的入口端和出口端分别对应于所述上层薄膜的入口孔和出口孔并与其连通，并且注入路径在邻近所述入口端处形成，所述注入路径与所述微通道的所述入口连通，所述微通道室设置在所述上层薄膜和所述下层薄膜之间；以及
密封装置，所述密封装置用于密封所述上层薄膜和所述下层薄膜的每一侧，以密封所述微通道室。
12.如权利要求11所述的薄膜设备，所述薄膜设备进一步包含：
第一管适配器，所述第一管适配器与所述上层薄膜的所述入口孔和所述微通道的所述入口端连通；和
第二管适配器，所述第二管适配器与所述上层薄膜的所述出口孔和所述微通道的所述出口端连通。
13.如权利要求11所述的薄膜设备，其中，将由下述化学式1所示的化合物通过所述上层薄膜的所述入口孔注入所述微通道的所述入口端，以及
将核酸样品通过所述微通道室的所述注入路径注入，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
14.如权利要求13所述的薄膜设备，其中，在所述化学式1中，n为5至7的整数。
15.如权利要求11-14中任一项所述的薄膜设备，其中，所述微通道被图案化成多次折叠。
16.如权利要求15所述的薄膜设备，其中，所述微通道包括多个扩展部分和多个缩小部分，所述扩展部分具有扩展的截面，所述缩小部分具有比所述扩展部分小的截面；并且，所述扩展部分和所述缩小部分交替设置。
17.一种用于提高核酸提取效率的组合物，所述组合物包含由下述化学式1所示的化合物作为活性成分，
[化学式1]
其中，n为5至10的整数。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，在所述化学式1中，n为5至7的整数。
19.如权利要求17所述的组合物，其中，所述组合物进一步包含蛋白酶和洗脱缓冲剂。
20.如权利要求17所述的组合物，其中，所述核酸为DNA或RNA。
21.一种用于提高核酸提取效率的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求17-20中任一项所述的组合物。
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