CN109738497B - 一种人乳腺癌细胞mcf-7特异性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人乳腺癌细胞MCF‑7特异性检测方法。在电极表面进行PdAu纳米粒子功能化，在其上修饰对巯基苯硼酸能够识别MCF‑7细胞；制备苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针，其中硼酸基能够特异性捕获细胞，形成一种类夹心结构，能够对MCF‑7细胞特异性识别，在共反应剂三丙胺存在下，产生电化学发光信号，PdAu纳米粒子的存在能够促进电化学发光发生，增加检测方法的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于细胞检测技术领域，具体而言，涉及一种基于电化学发光法特异性识别检测人乳腺癌MCF-7细胞的方法。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，其发病率和死亡率非常高。医学技术的不断发展，人们早已知道癌症是基因的改变引起的，针对性的诊断和治疗技术已得到显著的发展，但全球人类所受它困扰的现状，依然是大家有目共睹的。依据世界卫生组织（WHO）的长期研究得出，癌症的可愈治疗与其临床分期息息相关，癌症在初期的可愈治率超过80%。许多研究给出，恶性肿瘤治疗的最有效方法就是对它及早发现、确诊和针对性治疗。在女性当中，乳腺癌是一种发病率最高的癌症疾病，且近年来发病率成上升趋势。发展一种可靠的、灵敏的检测人乳腺癌细胞的方法对于实现乳腺癌的早期诊断、筛查、治疗及预后意义重大。在当前的乳腺癌医学诊断方法中，影像技术是一种最为常见的有效方法。但是影像技术也有其明显的不足，难以分辨病理特征相同和相近的肿瘤细胞，难以灵敏的检测到癌症早期肿瘤细胞水平较低时的肿瘤细胞等。而提高检测的特异性及灵敏度对于癌症的早期诊断治疗作用重大。
肿瘤细胞标记物的检测对科研工作者而言仍然是一个棘手挑战，所以，寻求肿瘤细胞标志物高灵敏性的检测手段一直是研究者们所追寻的。对于人类不同的肿瘤细胞标记物，可开发运用多种针对性的检测方法，这样不仅优化了检测方法的选择性，更能够提高检测的灵敏性和特异性。目前，在针对肿瘤细胞标记物的检测方法主要有电化学发光分析法、电化学分析法、酶标法、放射标记分析法和荧光法等，尤其是电化学发光法因具有高灵敏度和低背景的特殊性能优点，与多种酶-纳米材料探针结合后表现出强大的性能优势。提高电化学发光方法的特异性对于提高检测的灵敏度和可靠性十分重要。人乳腺癌细胞MCF-7是乳腺癌的标志细胞，其表面有不同于正常细胞的蛋白或者糖基，可以借助于抗体或者核酸适配体对其进行靶向性识别，但是这些生物物质存在价格昂贵、容易失活等问题，由于MCF-7细胞表面唾液酸过表达，在生理pH状态下，利用唾液酸可以与苯硼酸发生特异性反应形成稳定的复合物，为人乳腺癌细胞MCF-7的分析提供了可能性。
发明内容
本发明的目的是基于电化学发光，结合纳米材料及苯硼酸对人乳腺癌细胞MCF-7的特异性识别，建立一种人乳腺癌细胞MCF-7特异性检测方法。
所述的一种人乳腺癌细胞MCF-7特异性检测方法过程如下：
（1） 将制备好的10 ~ 50 μL PdAu纳米粒子旋涂工作电极表面；
（2） 在步骤（1）处理过的工作电极上滴加10 ~ 30 μL 10 mmol/L对巯基苯硼酸，静止5小时，工作电极修饰对巯基苯硼酸；
（3） 制备苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针；
（4） 在步骤（2）处理过的工作电极上滴加10 μL 浓度范围为5.0×102 ~ 2.0×107cells/mL 人乳腺癌细胞MCF-7细胞溶液，在37℃下孵育1~ 2小时；
（5） 在步骤（4）处理过的工作电极上滴加10 ~ 30 μL 50 mg/L步骤（3）制得的苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针，在37 ℃下孵育1~ 2小时；
（6） 将步骤（5）制得的工作电极置于含有0.1 mol/L 三丙胺和0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极，在电压范围为0 ~ −1.2 V，扫描速率为100 mV/s的条件下进行信号检测。
本发明所述步骤（1）中PdAu纳米粒子制备方法：0.4 mL 10 mmol/L四氯钯酸纳溶液，0.1 mL 10 mmol/L的氯金酸溶液，18 mg 氯化十六烷基吡啶，5 mL超纯水加入至烧瓶中，搅拌均匀后，加入新制备的0.3 mL 0.1 mol/L的抗坏血酸溶液，摇匀，密封，室温下放置3小时，所得产物离心分离，超纯水洗涤2次，最后，超声分散在2.0 mL超纯水中。
本发明所述步骤（3）中纳米复合物探针苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅制备方法：1.77 mL 曲拉通X-100、7.5 mL环己烷、1.8mL 正己醇，0.34 mL 40 mmol/L的三联吡啶钌溶液混合，搅拌30分钟，加入0.1 mL正硅酸乙酯，加入1 mL 1mol/L的氨水，溶液放置暗处搅拌12 小时，获得三联吡啶钌@二氧化硅复合物，利用丙酮进行离心分离，随后用乙醇和超纯水洗涤，获得沉淀分散在5.0 mL乙醇中；2.0 mL 0.5mg/L的三联吡啶钌@二氧化硅乙醇溶液中加入0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌4小时，产物进行离心分离、乙醇洗涤，得到端基为氨基的三联吡啶钌@二氧化硅复合物，然后将其加入5.0 mL 5%的戊二醛中，37℃下搅拌反应2小时，离心分离，超纯水洗涤3次，所得产物分散在超纯水中，加入0.1 mL 0.2 mol/L的对氨基苯硼酸，37℃下搅拌反应2小时，离心、洗涤，得到苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅复合物。
本发明的有益效果：
（1）该方法用苯硼酸类物质作为细胞识别体，提高了方法的特异性且降低了检测成本。
（2）该方法避免使用抗体、适配体等生物分子作为识别体，修饰电极及信号探针更易储存。
（3）该方法使用了PdAu纳米粒子作为共反应促进剂催化反应进行，提高了检测的灵敏度。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种人乳腺癌细胞MCF-7特异性检测方法过程如下：
（1） 将制备好的PdAu纳米粒子旋涂工作电极表面；0.4 mL 10 mmol/L四氯钯酸纳溶液，0.1 mL 10 mmol/L的氯金酸溶液，18 mg 氯化十六烷基吡啶，5 mL超纯水加入至烧瓶中，搅拌均匀后，加入新制备的0.3 mL 0.1 mol/L的抗坏血酸溶液，摇匀，密封，室温下放置3小时，所得产物离心分离，超纯水洗涤2次，最后，超声分散在2.0 mL超纯水中，取30 μLPdAu纳米粒子溶液旋涂于导电玻璃电极表面。
（2） 在步骤（1）处理过的导电玻璃工作电极上滴加20 μL 10 mmol/L对巯基苯硼酸，静止5小时，工作电极修饰对巯基苯硼酸。
（3） 制备苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针： 1.77 mL 曲拉通X-100、7.5 mL环己烷、1.8mL 正己醇，0.34 mL 40 mmol/L的三联吡啶钌溶液混合，搅拌30分钟，加入0.1 mL正硅酸乙酯，加入1 mL 1mol/L的氨水，溶液放置暗处搅拌12 小时，获得三联吡啶钌@二氧化硅复合物，利用丙酮进行离心分离，随后用乙醇和超纯水洗涤，获得沉淀分散在5.0 mL乙醇中；2.0 mL 0.5mg/L的三联吡啶钌@二氧化硅乙醇溶液中加入0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌4小时，产物进行离心分离、乙醇洗涤，得到端基为氨基的三联吡啶钌@二氧化硅复合物，然后将其加入5.0 mL 5%的戊二醛中，37℃下搅拌反应2小时，离心分离，超纯水洗涤3次，所得产物分散在超纯水中，加入0.1 mL 0.2 mol/L的对氨基苯硼酸，37℃下搅拌反应2小时，离心、洗涤，得到苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅复合物。
（4） 在步骤（2）处理过的工作电极上滴加10 μL浓度范围为 5.0×102 ~ 2.0×107cells/mL 人乳腺癌细胞MCF-7细胞溶液，在37℃下孵育1小时。
（5） 在步骤（4）处理过的工作电极上滴加10 μL 50 mg/L步骤（3）制得的苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针，在37℃下孵育1小时。
（6） 将步骤（5）制得的工作电极置于含有0.1 mol/L 三丙胺的0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极，在电压范围为0 ~ −1.2 V，扫描速率为100 mV/s的条件下进行信号检测。
Claims (2)
1.一种人乳腺癌细胞MCF-7特异性检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1） 将制备好的10 ~ 50 μL PdAu纳米粒子旋涂工作电极表面；
（2） 在步骤（1）处理过的工作电极上滴加10 ~ 30 μL 10 mmol/L对巯基苯硼酸，静止5小时，工作电极修饰对巯基苯硼酸；
（3） 制备苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针：1.77 mL 曲拉通X-100、7.5mL环己烷、1.8mL 正己醇，0.34 mL 40 mmol/L的三联吡啶钌溶液混合，搅拌30分钟，加入0.1 mL正硅酸乙酯，加入1 mL 1mol/L的氨水，溶液放置暗处搅拌12 小时，获得三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物，利用丙酮进行离心分离，随后用乙醇和超纯水洗涤，获得沉淀分散在5.0 mL乙醇中；2.0 mL 0.5mg/L的三联吡啶钌@二氧化硅乙醇溶液中加入0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，搅拌4小时，产物进行离心分离、乙醇洗涤，得到端基为氨基的三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物，然后将其加入5.0 mL 5%的戊二醛中，37℃下搅拌反应2小时，离心分离，超纯水洗涤3次，所得产物分散在超纯水中，加入0.1 mL 0.2 mol/L的对氨基苯硼酸，37℃下搅拌反应2小时，离心、洗涤，得到苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针；
（4） 在步骤（2）处理过的工作电极上滴加10 μL 浓度范围为5.0×102 ~ 2.0×107cells/mL 人乳腺癌细胞MCF-7细胞溶液，在37℃下孵育1~ 2小时；
（5） 在步骤（4）处理过的工作电极上滴加10 ~ 30 μL 50 mg/L步骤（3）制得的苯硼酸/三联吡啶钌@二氧化硅纳米复合物探针，在37 ℃下孵育1~ 2小时；
（6） 将步骤（5）制得的工作电极置于含有0.1 mol/L 三丙胺和0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极，在电压范围为0 ~ −1.2 V，扫描速率为100 mV/s的条件下进行信号检测。
2.根据权利要求1所述的一种人乳腺癌细胞MCF-7特异性检测方法，其特征在于：步骤（1）中PdAu纳米粒子制备方法：0.4 mL 10 mmol/L四氯钯酸钠溶液，0.1 mL 10 mmol/L的氯金酸溶液，18 mg 氯化十六烷基吡啶，5 mL超纯水加入至烧瓶中，搅拌均匀后，加入新制备的0.3 mL 0.1 mol/L的抗坏血酸溶液，摇匀，密封，室温下放置3小时，所得产物离心分离，超纯水洗涤2次，最后，超声分散在2.0 mL超纯水中。
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