CN107037013B - 一种灵敏检测癌细胞的光电化学细胞传感器的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵敏检测癌细胞的光电化学细胞传感器的制备及应用研究。通过原位生长法在氧化铟锡导电玻璃上生长三维多枝状的氧化锌纳米棒，利用其负载大量的低毒性石墨烯量子点和一端标记有硒化银量子点的发夹DNA探针，负载的量子点可以与氧化锌形成良好的双重敏化结构，实现最初的信号放大。结合癌细胞的特异性识别诱导发夹DNA构象改变产生的抑制敏化作用及细胞自身的空间位阻效应，实现进一步的信号放大，进而实现对癌细胞的灵敏检测。本发明构建的细胞传感器具有优良的分析性能，其在临床癌症的诊断和治疗方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术、癌细胞分析检测技术及光电化学信号检测技术领域，更具体地说是一种用于灵敏检测癌细胞的光电化学细胞传感器的制备及应用。
背景技术
癌症一直是威胁人类生存的一大健康杀手，其中癌细胞的灵敏检测对癌症的诊断和治疗中具有重要的意义。通常情况下，癌细胞在血清中的含量是非常低的，因此寻求高灵敏的癌细胞检测方法引起了广泛的关注。
光电化学分析方法是近年来新兴发展的检测技术，其激发光源和检测信号是完全不同的两种形式，这样可以有效地降低背景信号的干扰，从而极大地提高分析检测的灵敏度。传统的光电化学分析方法常用的窄带隙光电活性材料一般是镉族的量子点，由于重金属镉的毒性将限制其在癌细胞检测中的应用。
另外，在光电化学分析中，广泛使用的信号放大技术有生物催化沉淀、原位产生电子供体/受体、链杂交技术。尽管这些分析方法能够实现信号放大，他们通常具有操作的复杂性，且费时、费力、成本高。因此发展简易、高效的信号放大方法就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是通过原位生长法在氧化铟锡导电玻璃上生长三维多枝状的氧化锌纳米棒，其具有大的比表面积、良好的导电性和生物相容性，其中氧化铟锡简写为ITO，多枝状的氧化锌纳米棒简写为MBZnO-NRs。利用其负载大量的低毒性石墨烯量子点和5′端标记有硒化银量子点的发夹DNA探针，结合目标癌细胞特异性识别发夹DNA的环部诱导发夹DNA构象改变使硒化银量子点远离电极表面，产生的抑制敏化作用以及细胞自身的空间位阻效应实现信号放大，进而实现对癌细胞的灵敏检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：
（1）首先清洗ITO导电玻璃，将其依次在乙醇、丙酮、二次水中各超声洗涤15 min，在清洗后的ITO导电玻璃表面旋涂种子溶液，所述的种子溶液为浓度为30-50 mM醋酸锌溶液，然在120-160 ℃干燥8-12 min，重复操作该“旋涂-干燥”过程5-8次后，将ITO导电玻璃插入含有10-15 mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为20-25 mM且摩尔比为1:1，在80-100 ℃加热5-8 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在150 ℃干燥30 min；
（2）在步骤（1）中获得的ITO导电玻璃表面继续重复操作步骤（1）中“旋涂-干燥”过程4-7次，然后将获得ITO导电玻璃插入含有8-12 mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为25-30 mM且摩尔比为1:1，在70-90 ℃加热3-5 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在90 ℃干燥30min，最后获得MBZnO-NRs/ITO电极；
（3）合成石墨烯量子点：称取0.1-0.5 g型号为XC-72的炭粉溶于50 mL浓度为5-10M的硝酸溶液中，并在120-150 ℃加热回流20-25 h，待自然冷却到室温后，将获得的悬浮液在转速为8000 r/min 下离心30 min，收集黄色的上层清液并在80-120 ℃下加热，直至获得红棕色的固体，将获得的固体溶于二次水后置于透析袋中透析3天，透析后将获得溶液离心，最后获得的上层清液即为石墨烯量子点溶液；
（4）合成硒化银量子点：首先制备硒氢化钠溶液，称取0.02-0.05 g硒粉和0.02-0.05 g硼氢化钠溶于50 mL除氧的二次水中，在氮气的保护下，40-70 ℃油浴加热30-60min，整个加热过程均在磁力搅拌下进行，获得橙红色的溶液；将0.006-0.01 mmol硝酸银和0.02-0.05 mmol谷胱甘肽溶于20 mL除氧的二次水中，并在氮气的保护下磁力搅拌30 min，然后用浓度为2 M的氢氧化钠和浓度为2 M的醋酸溶液调节pH至9.5，最后加入0.6-0.8 mL上述制备的硒氢化钠溶液，在60-90 ℃下油浴加热1-3 h，获得棕色的硒化银量子点；
（5）光电化学细胞传感器的构建：将步骤（2）中获得MBZnO-NRs/ITO电极插入到含有2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液中，在室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤后，在电极表面滴涂20μL由步骤（3）中获得的石墨烯量子点和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合液，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简写为EDC，N-羟基琥珀酰亚胺简写为NHS，在室温下孵化 2 h后，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的试剂，然后将10 μL 5.0 μM的发夹DNA探针滴涂到电极表面，并在4 ℃下孵化12 h，所用发夹DNA探针3′端带有氨基，5′端带有羧基，其环部是与癌细胞特异性识别的适配体，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的发夹DNA探针后，滴涂20μL 1 mM 6-羟基-1-己硫醇用于封堵非特异性结合位点，并在室温下孵化1 h，利用pH 7.4 PBS洗涤后，继续滴涂20μL含有10 mM EDC和20 mMNHS的混合液并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将20μL步骤（4）中合成的硒化银量子点滴涂到电极表面，在室温下孵化2 h并用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的试剂，最后滴加10μL不同浓度的癌细胞，在37 ℃下孵化90 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的癌细胞，从而完成光电化学细胞传感器的构建；
（6）信号检测：利用电流-时间曲线法，在由步骤（5）中获得的MBZnO-NRs/ITO电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行信号检测，电压为0.0V, 激发光波长范围为200-2500 nm，激发光源开关每隔10 s切换一次，所用的电解质溶液为5 mL含有0.01 M过氧化氢的pH 7.4 PBS溶液，电解质溶液在使用前要通氮气除氧15 min，由于癌细胞的特异性识别诱导的抑制敏化作用及细胞的空间位阻效应，随着细胞的浓度增加，光电流信号逐渐降低，则通过光电流信号与癌细胞浓度之间的关系，实现对癌细胞的定量检测。
本发明的有益效果：
（1）通过原位生长法制备MBZnO-NRs/ITO电极，其具有良好的导电性、生物相容性和大的比表面积，可以负载大量的量子点和信号分子，实现分析信号的放大，提高检测的灵敏度。
（2）利用简单的水热法合成的低毒性石墨烯量子点和硒化银量子点具有良好的生物相容性，避免了镉族量子点的重金属污染，其可以与MBZnO-NRs形成良好的双重敏化结构，极大地放大光电流信号，进一步提高检测的灵敏度。
（3）本发明采用目标癌细胞的特异性识别诱导发夹DNA构象改变产生的抑制敏化作用以及细胞自身的空间位阻效应实现信号放大，该信号放大方式简易、高效、实用，对于提高分析检测的灵敏度具有重大的意义。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1: 灵敏的光电化学细胞传感器用于MCF-7细胞的检测
（1）首先清洗ITO导电玻璃，将其依次在乙醇、丙酮、二次水中各超声洗涤15 min，在清洗后的ITO导电玻璃表面旋涂种子溶液，所述的种子溶液为浓度为40 mM醋酸锌溶液，然在150 ℃干燥10 min，重复操作该“旋涂-干燥”过程6次后，将ITO导电玻璃插入含有10mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为25 mM且摩尔比为1:1，在90 ℃加热6 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在150 ℃干燥30 min；
（2）在步骤（1）中获得的ITO导电玻璃表面继续重复操作步骤（1）中“旋涂-干燥”过程6次，然后将获得ITO导电玻璃插入含有10 mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为25 mM且摩尔比为1:1，在90 ℃加热3 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在90 ℃干燥30 min，最后获得MBZnO-NRs/ITO电极；
（3）合成石墨烯量子点：称取0.25 g 型号为XC-72的炭粉溶于50 mL 浓度为6 M的硝酸溶液中，并在130 ℃加热回流24 h，待自然冷却到室温后，将获得的悬浮液在转速为8000 r/min 下离心30 min，收集黄色的上层清液并在100 ℃下加热，直至获得红棕色的固体，将获得的固体溶于二次水后置于透析袋中透析3天，透析后将获得溶液离心，最后获得的上层清液即为石墨烯量子点溶液；
（4）合成硒化银量子点：首先制备硒氢化钠溶液，称取0.034 g 硒粉和0.036 g 硼氢化钠溶于50 mL除氧的二次水中，在氮气的保护下，60 ℃油浴加热50 min，整个加热过程均在磁力搅拌下进行，获得橙红色的溶液；将0.009 mmol 硝酸银 和0.036 mmol 谷胱甘肽溶于20 mL 除氧的二次水中，并在氮气的保护下磁力搅拌30 min，然后用浓度为2 M的氢氧化钠 和浓度为2 M的醋酸溶液 调节pH至9.5，最后加入0.73 mL上述制备的硒氢化钠溶液，在85 ℃下油浴加热2 h，获得棕色的硒化银量子点；
（5）光电化学细胞传感器的构建：将步骤（2）中获得MBZnO-NRs/ITO电极插入到含有2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液中，在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，在电极表面滴涂20μL 由步骤（3）中获得的石墨烯量子点和浓度为10 mM 的EDC及浓度为20 mM 的NHS组成的混合液，在室温下孵化 2 h后，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的试剂，然后将10μL 5.0 μM的发夹DNA探针滴涂到电极表面，并在4 ℃下孵化12 h，所用发夹DNA探针3′端带有氨基，5′端带有羧基，其环部是与MCF-7细胞特异性识别的适配体，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的发夹DNA探针后，滴涂20μL 1 mM 6-羟基-1-己硫醇用于封堵非特异性结合位点，并在室温下孵化1 h，利用pH 7.4 PBS洗涤后，继续滴涂20μL含有10 mM EDC和20 mM NHS的混合液并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将20μL步骤（4）中合成的硒化银量子点滴涂到电极表面，在室温下孵化2 h并用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的试剂，最后滴加10 μL不同浓度的MCF-7细胞，在37 ℃下孵化90 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的MCF-7细胞，从而完成光电化学细胞传感器的构建；
（6）信号检测：利用电流-时间曲线法，在由步骤（5）中获得的MBZnO-NRs/ITO电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行信号检测，电压为0.0V，激发光波长范围为200-2500 nm，激发光源开关每隔10 s切换一次，所用的电解质溶液为5 mL含有0.01M过氧化氢的pH 7.4 PBS溶液，电解质溶液在使用前要通氮气除氧15 min，随着MCF-7细胞的浓度增加，光电流信号逐渐降低，则通过光电流信号与MCF-7细胞浓度之间的关系，实现对MCF-7细胞的定量检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种灵敏检测癌细胞的光电化学细胞传感器的制备及应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccagggcagt tgatcctttg gataccctgg ttt 33
Claims (1)
1.一种灵敏检测癌细胞的光电化学细胞传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）首先清洗氧化铟锡导电玻璃，将其依次在乙醇、丙酮、二次水中各超声洗涤15 min，其中氧化铟锡简写为ITO，在清洗后的ITO导电玻璃表面旋涂种子溶液，所述的种子溶液为浓度为30-50 mM醋酸锌溶液，然在120-160 ℃干燥8-12 min，重复操作该“旋涂-干燥”过程5-8次后，将ITO导电玻璃插入含有10-15 mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长溶液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为20-25 mM且摩尔比为1:1，在80-100 ℃加热5-8 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在150 ℃干燥30 min；
（2）在步骤（1）中获得的ITO导电玻璃表面继续重复操作步骤（1）中“旋涂-干燥”过程4-7次，然后将获得ITO导电玻璃插入含有8-12 mL生长溶液的25 mL高压釜中，并使其导电面向下，所述的生长溶液为六次甲基四胺和硝酸锌的混合液，其浓度均为25-30 mM且摩尔比为1:1，在70-90 ℃加热3-5 h，待自然冷却到室温后，用二次水洗涤并在90 ℃干燥30 min，获得多枝状的氧化锌纳米棒修饰的ITO电极，简写为MBZnO-NRs/ITO电极；
（3）合成石墨烯量子点：称取0.1-0.5 g型号为XC-72的炭粉溶于50 mL浓度为5-10 M的硝酸溶液中，并在120-150 ℃加热回流20-25 h，待自然冷却到室温后，将获得的悬浮液在转速为8000 r/min 下离心30 min，收集黄色的上层清液并在80-120 ℃下加热，直至获得红棕色的固体，将获得的固体溶于二次水后置于透析袋中透析3天，透析后将获得溶液离心，最后获得的上层清液即为石墨烯量子点溶液；
（4）合成硒化银量子点：首先制备硒氢化钠溶液，称取0.02-0.05 g硒粉和0.02-0.05 g硼氢化钠溶于50 mL除氧的二次水中，在氮气的保护下，40-70 ℃油浴加热30-60 min，整个加热过程均在磁力搅拌下进行，获得橙红色的溶液；将0.006-0.01 mmol硝酸银和0.02-0.05 mmol谷胱甘肽溶于20 mL除氧的二次水中，并在氮气的保护下磁力搅拌30 min，然后用浓度为2 M的氢氧化钠和浓度为2 M的醋酸溶液调节pH至9.5，最后加入0.6-0.8 mL上述制备的硒氢化钠溶液，在60-90 ℃下油浴加热1-3 h，获得棕色的硒化银量子点；
（5）光电化学细胞传感器的构建：将步骤（2）中获得MBZnO-NRs/ITO电极插入到含有2%3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液中，在室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤后，在电极表面滴涂20 μL由步骤（3）中获得的石墨烯量子点和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺组成的混合液，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简写为EDC，N-羟基琥珀酰亚胺简写为NHS，在室温下孵化 2 h后，用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的试剂，然后将10 μL 5.0 μM的发夹DNA探针滴涂到电极表面，并在4 ℃下孵化12 h，所用发夹DNA探针3′端带有氨基，5′端带有羧基，其环部是与癌细胞特异性识别的适配体，用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的发夹DNA探针后，滴涂20 μL 1 mM 6-羟基-1-己硫醇用于封堵非特异性结合位点，并在室温下孵化1 h，利用pH 7.4 PBS洗涤后，继续滴涂20 μL含有10 mM EDC和20 mMNHS的混合液并在室温下孵化1 h，用pH 7.4 PBS洗涤后，将20 μL步骤（4）中合成的硒化银量子点滴涂到电极表面，在室温下孵化2 h并用pH 7.4 PBS洗涤除去多余的试剂，最后滴加10 μL不同浓度的癌细胞，在37 ℃下孵化90 min，随后用pH 7.4 PBS洗涤除去未反应的癌细胞，从而完成光电化学细胞传感器的构建；
（6）信号检测：利用电流-时间曲线法，在由步骤（5）中获得的MBZnO-NRs/ITO电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极组成的三电极体系中进行信号检测，电压为0.0V，激发光波长范围为200-2500 nm，激发光源开关每隔10 s切换一次，所用的电解质溶液为5 mL含有0.01 M过氧化氢的pH 7.4 PBS溶液，电解质溶液在使用前要通氮气除氧15 min，由于癌细胞的特异性识别诱导的抑制敏化作用及细胞的空间位阻效应，随着细胞的浓度增加，光电流信号逐渐降低，则通过光电流信号与癌细胞浓度之间的关系，实现对癌细胞的定量检测。
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