CN109730989A - α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用及抗脑瘫药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑‑倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用，及抗脑瘫药物组合物，所述抗脑瘫药物组合物的有效成分为α‑倒捻子素衍生物。本发明提供的α‑‑倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用可以恢复脑因缺氧缺血合并感染引起的学习记忆能力降低，提高步态平衡能力，减轻神经元细胞器的损伤。

Description

α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用及抗脑瘫药物组 合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用及抗脑瘫药物组合物。

背景技术

脑瘫(cerebral palsy,CP)最早的描述是1862年由整形外科医生William Little提出。最近，国际脑瘫定义执行委员会提出如下定义：脑瘫是描述一组在发育中的胎儿或婴儿的大脑由于发生了非进行性脑损伤性所致的障碍，发生运动和姿势的永久性障碍，引起活动受限。脑瘫的运动障碍往往伴随着感觉，知觉，认知，交流和行为及癫痫和继发性肌肉骨骼问题的干扰。

治疗主要以康复训练结合药物为主，但尚无理想治疗药物，因此急需找到一种新的防治药物。如公开号为CN101069669A的中国专利文献公开了一套理疗器械系列，具体为一种脑瘫儿童康复理疗器械系列，由剪刀步康复器、下肢交替运动康复器、多功能积木式脑瘫康复器及两用脑瘫理疗手推车组成。公开号为CN103637864A的中国专利文献公开了一种脑瘫综合康复训练辅具，它包括底架、下肢外骨骼装置、悬吊装置；底架包括带锁定的万向脚轮、下底架、上底架和外骨骼装置倾斜调整机构；下肢外骨骼装置固装在底架上，能实现患者髋关节前屈/后伸、外展/内收、旋内/旋外、膝关节屈/伸、足背曲/蹠屈、足内翻/外翻、足旋内/旋外等康复训练；悬吊装置固装在底架上，对患者起到悬吊减重和矫正上身姿势的作用。

α-倒捻子素是由山竹外果皮中分离得到的一种活性成分，其活性成分见式I。报道称α-倒捻子素在人巨噬细胞和脂肪脂肪细胞中能够抑制脂多糖LPS所诱导的炎症。在某种程度上，α-倒捻子素还降低了肿瘤坏死因子 TNF-α和白介素IL-6基因的表达，但是确切机制还尚不清楚。

α-倒捻子素的结构式如下：

其中，α-倒捻子素化学名称1,3,6-三羟基-7-甲氧基-2,8-(3-甲基-2-丁烯基)9H-氧杂蒽-9-酮。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物中的应用和抗脑瘫药物组合物，可以恢复脑因缺氧缺血合并感染引起的学习记忆能力降低，提高步态平衡能力，减轻神经元细胞器的损伤药物组合物，。

本发明提供如下技术方案：

一种α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用，所述α-倒捻子素衍生物的结构式为：

所述脑瘫为痉挛型四肢瘫、痉挛型双瘫、痉挛型偏瘫、不随意运动型脑瘫、共济失调型脑瘫或混合型脑瘫。

本发明还提供一种抗脑瘫药物组合物，所述抗脑瘫药物组合物的有效成分为α-倒捻子素衍生物。

所述药物组合物包括α-倒捻子素衍生物、药学上可接受的赋形剂。

所述赋形剂选自

所述药物组合物为口服给药或注射给药的剂型。

所述口服给药的剂型选自水剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明的机制是在于：一方面，α-倒捻子素衍生物保留了α-倒捻子素的活性成分；另一方面，LC3有两种功能状态，在自噬形成时，LC3Ⅰ被水解去掉一段多肽，转变为LC3Ⅱ，而本发明提供的α-倒捻子素衍生物具有上调神经元细胞中LC3Ⅱ的表达，增大LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比率，抑制受损伤细胞自噬的过程，修复发展中的脑因缺氧缺血合并感染引起的神经元细胞的损伤，促进神经保护的作用。

本发明提供的α-倒捻子素衍生物可以恢复脑因缺氧缺血合并感染引起的学习记忆能力降低，提高步态平衡能力，减轻神经元细胞器的损伤，因此可以用于治疗脑瘫，在制备脑瘫药物中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为α-倒捻子素衍生物对脑瘫大鼠Morris水迷宫定位航行测试的影响；

图2为α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠Morris水迷空间探索测试的影响；

图3为α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠足失误实验中右前肢失误步数的影响；

图4为α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠足失误实验中右后肢失误步数的影响；

图5为透射电镜观察假手术组中神经元细胞的亚显微结构图；

图6为透射电镜观察模型组中神经元细胞的亚显微结构图；

图7为透射电镜观察α-倒捻子素衍生物给药组神经元细胞的亚显微结构图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但并不因此将本发明限制在所述的实施范围之内。

在本发明中，α-倒捻子素衍生物通过以下方法制备：

制备路线如下：称取三光气(100mg,0.33mmol)于50ml单口瓶中，加入新蒸干燥无水的二氯甲烷，搅拌溶解，25mL恒压滴液漏斗内缓慢加入1.0摩尔当量N-甲基苯胺衍生物或N-乙基苯胺，三乙胺(200μL,0.27 mmol)，10mL无水二氯甲烷稀释，于冰盐浴下缓慢滴加，滴毕撤去冰盐浴，常温搅拌反应8h。

取α-倒捻子素(50mg,0.12mmol)溶解于8mL二氯甲烷中，并加入催化量DMAP搅拌溶解，将混合液转移至恒压漏斗内，于冰盐浴条件下缓慢滴加，滴加完毕，撤去冰盐浴，常温搅拌反应，TLC检测反应进程。反应完全后，减压除去溶剂，并用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥、过滤，减压浓缩得黄色胶状物。用柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)纯化，减压蒸馏除去洗脱剂，得到黄色固体，为如式(Ⅱ)所示的α-倒捻子素衍生物，产率在85％-95％之间。重结晶得到目标纯度99.7％。

式(Ⅱ)(C₃₂H₃₁NO₇),ESI-MS m/z:542.2([M+H]+)；1HNMR(500M Hz,CDCl3):δ13.55(1H,s,5-OH),7.46-7.40(5H,m,Ar-H),7.26(1H, s,H-10),6.74(1H,d,J＝10.1HZ,H-4),6.26(1H,s,H-12),5.59(1H,d, J＝10.1HZ,H-3),4.12(1H,s,H-13),4.11(1H,s,H-13),3.45(3H,S,8- OCH3),3.39(3H,s,N-CH3),1.83(3H,s,17-CH3),1.68(3H,s,16-C H3),1.48(6H,s,18,19-CH3).13C-NMR(125MHZ,CDCl3):δ182.2,160. 3,158.0,156.4,153.8,152.4,149.5,146.7,142.5,138.5,131.9,130.9,12 9.6,129.3,128.9,127.2,127.2,123.1,116.3,115.6,110.4,104.0,94.2, 78.1,61.6,38.6,28.4,26.3,25.8,19.2。

以下实施中，control组是假手术组，也可以理解为空白对照；HIL为模型组。脑瘫模型指新生6日龄乳鼠(类似于人类围产期脑发育阶段)左颈总动脉单侧结扎合并缺氧，以模拟临床新生儿缺氧缺血性脑损伤，并联合感染LPS，以模拟人类孕中感染，待伤口愈合，可认为是脑瘫。

实施例中的实验数据分析采用graphpad软件计算得到，并自动生成所有附图。

实施例1

α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠Morris水迷宫测试的影响

1.动物设组：SD大鼠(6日龄，12-18g，每组15只)，随机分组。分组如表1.1所示。

表1.1实施例1所需动物及设组情况

2.给药及剂量：将纯度99％以上α-倒捻子素衍生物溶于注射用油酸乙酯，动物经腹腔注射给药，剂量为：5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg；阳性药神经节苷脂GM1剂量：20mg/kg，作为阳性对照；模型组与假手术组均腹腔注射给予等量溶剂(油酸乙酯)。每日9:00给药，造模后连续给药二十日。

3.手术过程：动物麻醉后，颈部备皮，切开颈部皮肤，暴露左侧颈总动脉，分别于颈内动脉远心端和颈总动脉近心端各打一死结并从中间剪断，永久阻断血流，缝合。放回母笼休息1h，缺氧180min(6％O₂+94％N₂，37℃), 结束后迅速腹腔注射LPS 1mg/kg。

水迷宫由一个直径150cm，高50cm，水温20℃的池子，摄像头及分析系统组成。水池水深30cm，圆形水面被通过圆心的两条假想垂线划分为4 个象限。在其中一个象限的水域中间离水面1.5cm处放一个直径10cm的逃离平台。平台为透明材质做成，以避免实验大鼠直接观察到平台。随机将大鼠从池子的1,2,3,4四个象限放入水中，大鼠会尽力逃避水环境，当发现平台后栖身于平台上，用自动追踪系统记录大鼠发现平台的潜伏时间，超过120s则记为120s，计算每天的平均潜伏期，前5天作记忆航行实验。第六天做空间探索试验，撤掉平台，追踪60s内，大鼠游过平台的次数。

实验结果显示，模型组大鼠逃避潜伏期在测试3至5天均显著长于假手术组(P＜0.05)，给药组20mg/kg组在第3、4、5天显著减少逃避潜伏期(P＜ 0.05)，5天内小鼠游泳速度无明显变化。空间探索实验中，模型组大鼠穿越平台区域次数显著少于假手术组(P＜0.05)，给药组20mg/kg组穿越平台区域次数显著增加(P＜0.05)。α-倒捻子素衍生物给药提高了脑瘫模型大鼠的空间记忆能力。

实施例2

α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠足失误行为测试的影响。

动物分组、给药剂量同实施例1。足失误试验是由直径0.4cm，单个网格面积3cm*3cm的不锈钢网完成。网面抬起地面约1m，为减少偶然误差，将每只大鼠放置网格适应2min，大鼠会尽可能把脚步踩在钢条上，平衡能力差的大鼠则会踩空，5min内记录大鼠在网格爬行50步中右前肢足失误次数，另一个5min内50步中右后肢足失误次数。

实验结果显示，右前肢测试中，模型组大鼠右前肢失误次数相比假手术组显著增加(P＜0.001)，20mg/kg给药组可以显著减少其足失误次数(P＜0.01)；右后肢测试中，模型组大鼠右前肢失误次数显著增加(P＜0.001)， 20mg/kg给药组可以显著改善其足失误次数(P＜0.05)。α-倒捻子素衍生物给药可以改善脑瘫模型大鼠的步态障碍。

实施例3

观察α-倒捻子素衍生物给药对脑瘫大鼠神经元细胞亚显微结构的影响。

大鼠水合氯醛麻醉后，4％的多聚甲醛(0.1M磷酸盐缓冲液，PH＝7.4) 灌流后分离脑组织，确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，组织体积一般不超过1mm×1mm×1mm，迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。细胞离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块，弃去培养液加入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PBS(PH7.4)漂洗3次，每次15min。1％的锇酸0.1M磷酸缓冲液PBS(PH7.4)室温(20℃)固定2h。0.1M 磷酸缓冲液PBS9(PH7.4)漂洗3次，每次15min。组织依次入 50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精上行脱水，每次15min。丙酮︰ 812包埋剂＝1︰1混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜。60℃聚合48h。切片机切片60-80nm超薄切片。铀铅双染色(2％醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

实验结果显示，假手术组中神经元结构正常，细胞质均匀分布，糖原 (①箭头)密集，可见线粒体(②箭头)正常，嵴明显，粗面内质网(③箭头)正常，糖原附着丰富，如图5所示，④箭头为细胞核。HIL模型组神经元空化，糖原缺失，线粒体肿胀、嵴碎裂甚至消失、空泡化，粗面内质网肿胀、糖原脱落，轴突神经病变溶解，如图6所示。给药组对比模型组细胞器丰富，视野内可见高尔基体(⑤箭头)形态，线粒体增多，嵴出现，粗面内质网形态有较大改善，附着糖原增多，可见明显恢复，如图7所示。α-倒捻子素衍生物给药可以显著改善脑瘫模型大鼠造成的线粒体、粗面内质网等细胞器的损伤。

综上所述，本发明采用缺氧缺血联合LPS感染造成脑部损伤模拟脑瘫，以此来考察药物对痉挛性脑摊的治疗作用。本发明通过Morris水迷宫实验和足失误实验评价药物对脑瘫模型大鼠的空间学习记忆能力和运动平衡能力的作用，并通过透射电镜观察神经元细胞亚显微结构形态变化，探究α-倒捻子素衍生物对脑瘫的治疗作用。实验结果显示给予不同剂量的该α- 倒捻子素衍生物，高剂量能明显逆转脑瘫大鼠寻找平台潜伏期的延长，步态中的足失误步数，并且能逆转神经元细胞器的损伤。以上结果表明该α- 倒捻子素衍生物可以用于脑瘫疾病的治疗。

以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用，所述α-倒捻子素衍生物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的α-倒捻子素衍生物在制备抗脑瘫药物的应用，其特征在于，所述脑瘫为痉挛型四肢瘫、痉挛型双瘫、痉挛型偏瘫、不随意运动型脑瘫、共济失调型脑瘫或混合型脑瘫。

3.一种抗脑瘫药物组合物，其特征在于，所述抗脑瘫药物组合物的有效成分为权利要求1-2任一所述的α-倒捻子素衍生物。

4.根据权利要求3所述的抗脑瘫药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括α-倒捻子素衍生物、药学上可接受的赋形剂。

5.根据权利要求3所述的抗脑瘫药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服给药或注射给药的剂型。

6.根据权利要求5所述的抗脑瘫药物组合物，其特征在于，所述口服给药的剂型选自水剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。