CN109715789A - 内部封定脂囊泡 - Google Patents
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Abstract
一种生成内部封定脂囊泡的方法，包含：提供前驱脂囊泡，其具备包覆于脂质膜内的水性内壁，其中前驱脂囊泡的脂质膜对交联剂不具通透性；使脂质膜短暂地具备通透性，以生成具通透性的囊泡；使具通透性的囊泡与不具活性但可活化的交联剂接触，不具活性但可活化的交联剂藉此进入具通透性的囊泡中；使具通透性的囊泡回复成不具通透性的囊泡；清除任何囊泡外的交联剂；及活化不具活性但可活化的交联剂，使不具通透性的囊泡中产生交联反应，以生成内部封定的脂囊泡。
Description
相关申请的交叉引用
本申请案主张于2016年8月1日申请的美国临时申请案第62/369,440号的优先权，该临时申请案的全部内容以引用方式并入本文中。
背景技术
细胞膜由双层脂质(lipid bilayer)、蛋白质及聚糖组成，以上物质共同构成一细致界面，负责掌控细胞标志及物质运输、信号传导、细胞黏附等功能。双层脂质具备高度流动性，可使细胞膜内各种基团侧向流动。此细致界面为许多生物学研究及生医领域技术应用的核心，而目前亦出现许多于一稳固基质上重构此细致界面的实务应用技术。细胞本质上较为脆弱，易受各种影响表面生化反应的生物机制(如细胞凋亡及囊泡出芽)左右。
目前维持细胞膜构造的技术包括于平面或球状基质上重构纯化细胞膜，以及使用甲醛(formaldehyde)与戊二醛(glutarasldehyde)等化学交联剂将细胞完整封定。然而，就重构复杂且具流动性的细胞膜界面而言，这些技术仍有不足之处，例如在合成基质上重构纯化细胞膜时，会面临细胞膜杂质、细胞膜破损、细胞膜覆盖基质不完全等问题，而使用化学封定技术时，则会造成膜蛋白原始状态改变、蛋白流动性降低，并在生医技术应用过程中制造毒性。有鉴于生成稳定且具流动性的细胞膜界面存在诸多困难，许多以膜界面上分子间交互作用为核心的生物学研究及生医技术应用因此进展有限。
发明内容
根据本申请案所请发明的一态样，提供一种生成内部封定脂囊泡的方法。该方法包括提供前驱脂囊泡，其具备包覆于脂质膜内的水性内壁，其中前驱脂囊泡的脂质膜对交联剂不具通透性；使脂质膜短暂地具备通透性，以生成具通透性的囊泡；使具通透性的囊泡与不具活性但可活化的交联剂接触，不具活性但可活化的交联剂藉此进入具通透性的囊泡中；使具通透性的囊泡回复成不具通透性的囊泡；清除任何囊泡外交联剂；及活化不具活性但可活化的交联剂，使不具通透性的囊泡中产生交联反应，以生成内部封定的脂囊泡。
在某些实施例中，前驱脂囊泡为细胞或病毒。例如细胞可为哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞，如人类细胞、非人类细胞、细菌细胞、真菌细胞、不朽化细胞、基因改造细胞、人造细胞、免疫细胞、上皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、纤维母细胞、软骨细胞、肌肉细胞、血球细胞、骨细胞、分泌细胞、干细胞、耳毛细胞、脑细胞、神经细胞、肺细胞或癌细胞。
在某些实施例中，不具活性但可活化的交联剂为光反应交联剂、热反应交联剂或化学反应交联剂。举例而言，化学反应交联剂可为具任意分子量的环氧化物(epoxine)、聚氨酯(urethane)、聚醚(polyether)、聚酯纤维(polyester)，或含疏水侧基的聚丙烯酰胺(polyacrylamide)衍生物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物(triblock copolymer)、甲基丙烯酸羟基乙酯-甲基丙烯酸甲酯(hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate,HEMA-MMA)、聚丙烯腈-聚氯乙烯(polyacrylonitrile-polyvinyl chloride,PAN-PVC)、聚异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropyl acrylamide),polyNIPAM)、聚乙烯基己内酰胺(poly(N-vinylcaprolactam))、纤维素(cellulose)衍生物、环氧乙烷-丙烯(ethylene oxide-propylene)或Matrigel胶。具通透性囊泡可与含有1至70wt％(如2、4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70wt％)交联剂的溶液接触。在某些实施例中，光起始剂与光交联剂合并使用。例如交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethyleneglycol diacrylate,PEGDA)即可与光起始剂2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone,I-2959)合并使用。
使前驱脂囊泡具备通透性的步骤是藉由对前驱脂囊泡施加冻融法(freezing andthawing)、渗透压冲击法(osmotic shock)、超声波穿孔法(sonoporation)、电穿孔法(electroporation)、激光、基于界面活性剂的穿孔法或剪切。在某些实施例中，此步骤于交联剂、光起始剂(非必要)存在时进行。
根据本申请案所请发明另一态样，揭露一种通过本文中提出的方法生成的内部封定脂囊泡。内部封定脂囊泡的脂质膜在一或多个特性上与前驱脂囊泡的脂质膜实质相同，例如对界面活性剂的敏感性、膜流动性、膜蛋白流动性、膜通透性、膜成分、表面电荷及生物功能。制备内部封定脂囊泡时，可使用任意前驱脂囊泡，并搭配如本文中所述的不同浓度光反应交联剂、热反应交联剂或化学反应交联剂。
在某些实施例中，前驱脂囊泡为细胞。细胞可具有内源、外源或经基因改造的细胞表面蛋白或聚糖。举例而言，细胞可为抗原呈现细胞(如一癌细胞或树突细胞)、经培养的饲养细胞(如一小鼠胚胎纤维母细胞(mouse embryonic fibroblast)、JK1饲养细胞或SNL76/7饲养细胞)、具有能与药物或候选药物结合的细胞表面受体的细胞、具有能与病原体结合的细胞表面受体的细胞(如红血球细胞、免疫细胞或血小板)。
根据本申请案所请发明另一态样，提出一种调节免疫反应的方法，包括提供自抗原呈现细胞(如癌细胞或树突细胞)制备的内部封定脂囊泡，制备过程使用本申请案提出的方法，以及使内部封定脂囊泡与抗原反应细胞接触。
另，本申请案所请发明揭露一种培养目标细胞的方法。该方法包含提供自经培养的饲养细胞(如小鼠胚胎纤维母细胞、JK1饲养细胞或SNL 76/7饲养细胞)制备的单层的内部封定脂囊泡，制备过程使用本申请案提出的方法，以及共同培养单层与目标细胞。
又根据本申请案所请发明一态样，提供一种分析药物或候选药物的方法，包括提供自具有能与药物或候选药物结合的细胞表面受体的前驱细胞制备的内部封定脂囊泡，制备过程使用本申请案提出的方法、使内部封定脂囊泡与药物或候选药物接触，以及分析经接触后的内部封定脂囊泡。
根据本申请案所请发明另一态样，提出一种结合病原体的方法。该方法包括提供自具有能与病原体结合的细胞表面受体的细胞制备的内部封定脂囊泡，制备过程使用本申请案提出的方法，以及使内部封定脂囊泡与含有或疑似含有病原体的样本接触。方法可进一步包括结合侦测步骤。
一或多个实施例的具体细节，可参照所附附图及以下详细说明。本申请案实施例的其他特征、目的及优点在参照以下说明、所附附图及请求项后，将会变得明显。
附图说明
图1为比较8％十二烷基硫酸钠(SDS)存在下、细胞密度近似的正常细胞与内部凝胶化细胞的一组显微影像图。比较两者后发现，正常细胞于界面活性剂存在时会分解，而内部凝胶化细胞在脂质膜溶解后呈现出水凝胶状骨架。
图2为一组穿透式电子显微镜影像图，分别为正常细胞(上排)、内部凝胶化细胞(中排)、于8％SDS溶液中浸泡过的内部凝胶化细胞(下排)。箭头标示处为脂质膜。
图3为一组图表，显示经不同浓度交联剂内部封定的HeLa细胞，接受光致褪色(photobleaching)后荧光恢复的状态。这些内部凝胶化细胞的膜流动性接近正常细胞，如其经光致褪色后荧光恢复的讯号所示(上图)，以及经光致褪色后荧光恢复的半生期所示(下图)。
图4为一图表，显示分别使用4、10、20、40wt％PEGDA封定的内部凝胶化细胞，于原子力显微镜测定下的可调变杨氏模量(tunable Young’s moduli)。
图5为一组显微影像图，显示置于4℃水中30天的经内部封定的HeLa细胞。这些封定细胞于第0天(左)、第10天(中)、第30天(右)时，其细胞结构与形态并未呈现明显变化。
图6为一组图表，显示在内部封定树突细胞(DCs)表面上所呈现的CD80(上图)及第一型主要组织相容性复合物(MHC)/SIINFEKL复合物(下图)。
图7为一组图表，显示源于骨髓并凝胶化、活化的树突细胞(BMDCs，上图)及JAWSII细胞(下图)，于试管内(in vitro)实验中刺激T细胞增生的情形。
图8为一组图表，显示源于骨髓并内部凝胶化、活化的树突细胞于活体内(invivo)实验中刺激T细胞增生的情形。
图9为一组影像，显示不同条件下的黏附HeLa细胞(上排)与内部封定HeLa细胞(下排)。相较之下，两样本在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中皆呈现类似生长密度(confluency)及形态。置于水中时，这些内部封定细胞较不易因渗透压而膨胀。在水中静置72小时后，这些内部封定细胞较能滞留于培养皿上。
图10为一组影像，显示经内部凝胶化的鸡红血球细胞均匀分散在溶液中(左图)，而流感病毒PR8存在时则出现血球凝集现象(右图)。
图11为一组穿透式电子显微镜影像，显示流感病毒不存在(上排)及存在(下排)时，经内部凝胶化的鸡红血球细胞所呈现的状态。
具体实施方式
经研究意外发现，于皆不破坏具流动性外膜表面及相关表面成分的情况下，可封定脂囊泡(如细胞)。而经内部封定的脂囊泡则保留原始外层结构，且不易受环境压力影响。脂囊泡经内部封定后，其膜脂质及膜蛋白仍保持流动性。
由该方法生成的内部封定脂囊泡，具有包覆于脂质膜内的封定或凝胶化内部结构，该脂质膜与其前驱未封定脂囊泡的脂质膜实质相同。前驱脂囊泡所具备的特性皆可保留，例如对界面活性剂的敏感性、膜流动性、膜蛋白流动性、膜通透性、膜成分、表面电荷及生物功能等。
内部封定脂囊泡保有具流动性的膜表面时，即可与化合物、生物分子、病原体、细胞等实体进行仿生交互作用。本文中所提出的内部封定方法可广泛作为保存细胞的手段以利进行生医分析工作，适用细胞包括难以于活体外(ex vivo)或试管内保存的罕见细胞。举例而言，可内部封定包含生物细胞的独立临床样本，以利进行后续分析工作，譬如寻找具疗效潜力的特定配体。内部封定脂囊泡亦可作为生物膜研究领域的泛用工具，可提供稳固、多样化模型，针对受体-配体结合、细胞黏附等界面间作用力进行研究。内部封定脂囊泡可用于开发复杂装置，如经类细胞生物官能化的生物感应器，亦可附着于药物或药物传输系统上，以提升药物疗效。
内部封定脂囊泡的其他应用方式包括但不限于免疫调节、药物筛选、组织工程、细胞凝集测定系统及用以去除病原性实体的过滤系统。
视应用方式而定，内部封定脂囊泡可用于悬浮液中、培养皿上的单层细胞中，或附着于固态基质(如平板、聚合物或粒子)或其他结构上。
生成内部封定脂囊泡的方法
本文中所提出的生成内部封定脂囊泡的方法，包含使前驱脂囊泡的脂质膜短暂地具备通透性，以使不具活性但可活化的交联剂进入脂囊泡。交联剂进入具通透性的脂囊泡后，囊泡可回复成不具通透性的囊泡，并将交联剂封入囊泡内部。若囊泡外仍有交联剂残留，则可通过清洗囊泡等方式清除。交联剂封入囊泡后即活化，并对脂囊泡进行内部封定，而不损坏膜结构。使囊泡具备通透性的步骤可于交联剂存在时进行。
内部封定脂囊泡可由任何由脂质膜组成的前驱脂囊泡制备。举例而言，脂囊泡可为细胞或病毒。细胞可为原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞)。细胞亦可为基因改造细胞或人造细胞。在某些实施例中，细胞可为人类细胞、非人类细胞、真菌细胞、免疫细胞、上皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、纤维母细胞、软骨细胞、肌肉细胞、血球细胞、骨细胞、分泌细胞、干细胞、耳毛细胞、脑细胞、神经细胞、肺细胞或癌细胞。前驱细胞亦可经过基因改造，以大量表达内源性膜蛋白、表达外源性且经基因变异或经融合的膜蛋白，或去除内源性膜蛋白。
为于前驱脂囊泡上短暂地制造膜穿孔或使其具通透性，可采用本发明所属技术领域的习知技术，包括但不限于冻融法、渗透压冲击法、超声波穿孔法、电穿孔法、激光致膜穿孔法(laser-induced membrane poration)、剪切致膜穿孔法(shear-induced membraneporation)，及其他机械性手段的技术。举例而言，当脂质膜邻近区域出现空洞时，即表示超声波穿孔法产生效果。通过会刺穿脂质膜的声波微流(acoustic microstreaming)、气泡震荡(bubble oscillations)、震波(shock waves)及微喷射形成(microjet formation)等方法，可在微泡与膜产生交互作用时短暂地制造穿孔。本领域技术人员能够判断如何应用相关技术，以于膜上短暂地制造穿孔且不使膜永久受损。一般而言，停止实施短暂穿孔技术后，穿孔即会自动关闭。
能通过经通透化处理的脂质膜，以及可于脂囊泡内部活化以生成封定内壁的任何交联剂，皆适用本文中所提供的方法。在某些实施例中，交联剂为可活化、可交联以形成胶体的单体或聚合物。热反应性水凝胶交联、pH-敏感型水凝胶交联、化学反应性水凝胶交联及溶胶-凝胶二氧化硅(sol-gel silica)水凝胶交联，皆属可活化的交联技术范例。
在某些实施例中，使用光聚合反应或光交联反应。光聚合反应为使聚合物进行交联反应，聚合物触光时会改变材料性质进而固化或硬化，光通常为紫外光或可见光的电磁波波段。无论是否存在一光起始剂，该反应皆可进行。光起始剂种类包括但不限于阳离子性光起始剂(如鎓盐、有机金属及吡啶阳离子盐)与自由基光起始剂(如二苯甲酮、山酮、醌、安息香醚、苯乙酮、苯肟及酰膦)。光反应性交联剂种类包括但不限于具任意分子量的环氧化物、聚氨酯、聚醚及聚酯纤维。光反应性交联剂通常用于丙烯酸酯，以进行交联反应。举例而言，分子量为700的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)可与2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I-2959)合并使用作为光起始剂。
热反应性聚合物通常包含疏水基，或于临界温度下易连锁凝集的基团。热反应性聚合物可于特定温度(如不引起反应的温度)下，置入经通透化的脂囊泡，并在温度改变为临界温度之后进行交联反应。适用本文中提出的内部封定方法的热敏感聚合物种类，包括但不限于含疏水侧基的聚丙烯酰胺衍生物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物、甲基丙烯酸羟基乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、聚丙烯腈-聚氯乙烯(PAN-PVC)、聚异丙基丙烯酰胺(polyNIPAM)、聚乙烯基己内酰胺、纤维素衍生物、环氧乙烷-丙烯及Matrigel胶。
举例而言，可将前驱脂囊泡悬浮于含光反应交联剂、光起始剂(如20wt％PEGDA与1wt％I-2959)的溶液中，并置于-20℃下冷冻。经冷冻后，会产生能在该脂囊泡膜上制造穿孔的冰晶，使交联剂与光起始剂能够进入脂囊泡。在解冻且膜上穿孔自动关闭后，即于等渗透压溶液中清洗脂囊泡，以稀释囊泡外PEGDA及I-2959成分。接着将清洗过的脂囊泡放至紫外光下照射，PEGDA单体即于脂囊泡中存在I-2959时产生交联反应。
另，该方法除可适用悬浮液体中的脂囊泡，亦可直接适用培养皿上单层的脂囊泡(如细胞)。举例而言，细胞可置于组织培养皿上培养，并可附着于组织培养皿上。接着，培养物可经通透化处理，譬如于交联剂及起始剂(非必要)存在时实施冻融法。细胞膜上短暂开启的孔洞重新关闭后，再洗去囊泡外任何交联剂或起始剂，并使位于胞内的交联剂活化，以于单层细胞内产生内部封定的细胞。
内部封定脂囊泡的机械性质(如弹性或劲度)，可藉由在脂囊泡中注入不同浓度交联剂进行调整，以控制交联反应程度。举例而言，可采用高浓度交联剂，以生成较强韧的内部封定脂囊泡。本领域技术人员可根据脂囊泡、交联剂种类与欲获得的机械性质，决定适当的交联剂浓度。
可用于免疫调节的内部封定脂囊泡
对于能于治疗疾病过程中促进或破坏细胞免疫力的免疫调节材料，历来颇受关注。举例而言，制备人造抗原呈现细胞的目的，为于活体中使肿瘤专一性T细胞增殖，而耐受性诱导粒子则用于治疗自体免疫疾病及提高同种异体移植成功率。商业上习惯通过合成材料模拟抗原呈现细胞，以促使免疫细胞增殖，而同样技术在研究与临床实务上亦存在诸多应用。然而，合成材料的免疫调节效果仍不及细胞系统，尤其对于制备合成系统，使之能如实呈现抗原呈现细胞活体上的流动性表面蛋白，即激发免疫作用的主要因子，依然相当困难。另一方面，细胞系统本身即存在一些限制，譬如存活力低、表型易改变，以及可能成为病毒性传染病的传染源。
本文中提出的内部封定方法可破坏抗原呈现细胞的增殖能力，但不破坏其抗原呈现能力，使其成为具流动性表面蛋白的一新颖平台以刺激T细胞。这些内部封定细胞仍保有增强免疫的能力，同时不具致癌风险。因此，为激发免疫反应，可将经内部封定的抗原呈现细胞施予一受试对象。举例而言，癌细胞可经内部封定，并用以使肿瘤专一性T细胞于活体内或活体外增殖。本文中提出的内部封定方法适用于任何癌细胞，包括但不限于黑色素瘤细胞、白血病细胞、肝癌细胞、胰脏癌细胞、前列腺癌细胞、乳癌细胞及卵巢癌细胞。研究结果显示，经T细胞共同刺激因子(如CD80)转染的癌细胞，能促发T细胞的强力抗癌反应。因此，在某些实施例中，即将内部封定的癌细胞可接受基因改造，以表达一或多个免疫调节分子，包括但不限于CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、CD40、CD3、CD28及CD58蛋白质。本文中提出的方法亦可适用于内部封定树突细胞等其他抗原呈现细胞，只要将目标抗原脉冲注入前述细胞，即可呈现抗原。
可用于组织工程的内部封定脂囊泡
细胞与组织培养系统的市场日益扩大。能精细模仿细胞天然环境栖位(niche)的仿生系统，可提升组织培养的增殖力与存活力。举例而言，维持干细胞经常需要特定养分，譬如纤维母细胞、细胞介质及胞外间质成分。进行干细胞培养时，往往需要在培养基质上铺一层饲养细胞，以提供维持干细胞多能性所需的微环境。此饲养细胞层通常以小鼠胚胎纤维母细胞(MEFs)、JK1饲养细胞或SNL 76/7饲养细胞制备而成。然而，使用活体饲养细胞耗费的工程较大，也会导致细胞污染。历来已研发出数种取代干细胞培养所需活体饲养细胞的方法，而这些合成系统则包括以蛋白质覆盖的培养皿及经化学封定的饲养细胞层，以利保留维持干细胞所需的生物分子信号。
相较于蛋白质覆盖的基质与以其他化学封定技术制备的饲养细胞，由本文中提出方法所生成的内部封定细胞具备较多优点。若仅使这些细胞进行细胞质交联，即可维持其原本形态、膜流动性及膜蛋白动态。包括小鼠胚胎纤维母细胞(MEFs)在内的饲养细胞，在经制备并内部封定后，可继续用于干细胞继代培养。经内部封定的单层小鼠胚胎纤维母细胞仍保有原本形态及流动性膜蛋白，以提供维持干细胞所需的刺激物。由于这些内部封定细胞并非活体，因此可被稳定保存及运送。制备弹性不同、经封定的饲养细胞时，亦可以满足特定组织培养需求为目标，手段包括调整交联反应程度。可满足组织培养需要的内部封定细胞单层，其种类包括但不限于小鼠胚胎纤维母细胞、JK1饲养细胞、SNL 76/7饲养细胞与人源纤维母细胞。内部封定的饲养细胞可用于培养及维持不同种类的细胞，如免疫细胞、癌细胞、初代细胞株与不同来源的干细胞。
可用于药物与分子筛选的内部封定脂囊泡
有鉴于膜通透性与蛋白质结合反应会影响药物吸收与分布，可先在试管内针对分子与细胞膜间交互作用进行检验，即可于手续较为繁复的活体内检测前先进行初期筛选工作。于化合物存在下，可搭配使用微脂体(liposomes)与由粒子支持的脂质膜，以分析两者和细胞之间的交互作用。然而，即使采用前述方法，仍无法再现真实细胞表面的复杂构造。另一方面，活体细胞也无法承受化学性压力，因此无法直接用于检测分子运输动态变化。
本文中提出的内部封定方法，可作为理想的药物与分子筛选方案。经内部封定的细胞仍保留其天然磷脂质双层膜与表面蛋白，亦可承受化学性压力，因此可与不同化合物(如候选药物)混合并接受分析，以掌握膜结合反应及/或化合物运输动态变化情形。分析药物通透性与吸收效果时，可针对任何细胞种类进行内部封定。可经内部封定并用于分子筛选的细胞种类，包括但不限于肠道上皮细胞(如分析口服吸收情形)、脑细胞(如分析脑与血浆间物质的分布情形)、癌细胞(如分析癌细胞标靶疗法效果)、免疫细胞与红血球细胞。该内部封定技术可用于筛选小分子化合物、碳水化合物、聚合物、肽、蛋白质与核酸等分子。
可用于侦测与隔绝病原体的内部封定脂囊泡
毒素、病毒、细菌、寄生虫与真菌等病原体结构通常对细胞膜具高度亲合性，可藉此攻击特定细胞或组织，以入侵宿主、剥夺养分及逃脱免疫。有鉴于前述病原体结构性质，可改造装置，使其具有和病原体进行交互作用的类细胞外层结构，进而用来侦测或分离病原体。经本文中提出方法制备的内部封定脂囊泡，具备可模拟天然生物膜之一脂质膜，并可与黏附细胞的病原体进行仿生交互作用。举例而言，该内部封定脂囊泡可侦测或与样本中的病原体结合，亦可用于分离或过滤(如清除)样本中的病原体。
具有病原体亲合性膜的任何前驱脂囊泡(如细胞)，皆可用以制备内部封定囊泡，以侦测或与该病原体结合。可经内部封定、用以侦测特定病原体的细胞种类包括但不限于红血球细胞(与流感病毒、大肠杆菌及疟疾寄生虫结合)、免疫细胞(与人类免疫缺乏病毒结合)与血小板(与金黄色葡萄球菌及循环肿瘤细胞结合)。前驱细胞可经基因改造，以针对病原体表达细胞表面受体。这些内部封定细胞可置于悬浮液中或固定于固态基质上，以侦测、分离及/或过滤病原体。视待侦测病原体而定，本领域技术人员可选择适当前驱细胞作为制备内部封定细胞之用，以与病原体结合并侦测结合反应。
举例而言，可制备并利用内部封定红血球，以结合并侦测流感病毒。红血球的细胞膜上具有唾液酸受体，可与病毒表面上表达的血球凝集素糖蛋白结合。该结合反应会导致可观察到的红血球凝集现象，该现象是病毒存在的指标。在商业上，源于不同动物的红血球可作为病毒定量工具，然而天然红血球较为脆弱，因此库存效期有限。另一方面，经本文中提出方法制备的内部封定红血球则会保留其原始形态、功能与细胞膜成分，以利与病毒进行交互作用，同时较天然红血球不易受环境压力与崩解作用影响。
应理解的是，以下实例仅作为示例说明之用，而非以任何方式限制本案所揭露的其余内容。无须进一步阐述，咸相信本领域技术人员可基于本文中的叙述，将本案揭露的技术利用至最广程度。
实例1：内部封定的HeLa细胞
制备内部封定细胞时，使用置于悬浮液中的HeLa细胞、交联剂单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)与光起始剂2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I-2959)。
使用冻融法，将PEGDA与I-2959由膜上暂时穿孔注入HeLa细胞内部。这些细胞悬浮于含20wt％PEGDA与1wt％I-2959的溶液中，并冰冻于-20℃下。细胞膜经冰冻后会出现穿孔，使交联剂与光起始剂能进入细胞中。在解冻及膜上穿孔自动关闭后，即于等渗透压溶液中清洗这些细胞，以稀释胞外PEGDA及I-2959成分。接着将这些清洗过的细胞置于紫外光下照射，该PEGDA单体即于I-2959存在时产生交联反应。当胞外存在大量经稀释的PEGDA与I-2959，则仅细胞内壁会产生交联反应。实施封定技术后，经交联的水凝胶形同合成细胞骨架，可支撑该具动态结构的脂质双层膜。
为呈现经紫外光催化形成的水凝胶而内部封定成功的目标细胞，首先将内部封定细胞置于8％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，以判断经水凝胶交联而形成的细胞内间质状态，并取未经内部封定的正常细胞为对照组。将正常细胞置于8％SDS溶液中后，界面活性剂会使脂质膜上成分溶解，导致这些细胞快速溶解，通过光学显微镜可观察到最后仅存细胞残骸，如图1左方影像所示。另一方面，经内部封定的细胞则呈现球状骨架，其大小近似原始细胞基质，如图1右方影像所示。实验结果显示，细胞表面膜内部成功产生水凝胶交联反应。由于水凝胶不会被界面活性剂溶解，在可溶解脂质膜成分的SDS存在的情形下，依然可观察到细胞大小的骨架。
为判断实施所述内部封定技术后膜界面是否可维持，以穿透式电子显微镜(TEM)观察经内部封定的细胞表面状况。在TEM下，正常细胞(图2上排)与内部封定细胞(图2中排)表面未呈现任何明显差异。在此二样本中，脂质双层膜皆清晰可辨识(图2中箭头标示处)，表示在实施内部封定技术后，细胞膜界面仍然存在。使用8％SDS溶解细胞膜后，这些内部封定细胞的脂质膜即消失，仅留下细胞内部的水凝胶骨架，如图2下排所示。实验结果显示，该内部封定技术并未破坏外层膜界面，并能保留可被界面活性剂分解的完整无损的双层膜。
以亲脂性染剂1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青过氯酸盐(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)将这些内部封定细胞的细胞膜染色，以使表面脂质膜显像。使用共轭焦显微镜观察结果时，可发现所述亲脂性染剂标示出这些内部凝胶化细胞外壁，换言之，表面膜仍完整无损且仍具亲脂性(结果未显示)。
这些内部封定细胞的膜流动性，可通过光致褪色后荧光回复技术(fluorescencerecovery after photo-bleaching,FRAP)确认。该技术使用高能量激光，对经荧光标记的细胞膜片段进行轰击，以将该区域的荧光物质光致褪色。在关闭激光后，即可于该区域观察到荧光回复现象。本研究使用不同浓度的PEGDA制备内部封定HeLa细胞，如4wt％、10wt％、20wt％与40wt％。实验结果显示，尽管各样本的水凝胶形成状况不同，即交联反应程度互有差异，整体荧光回复情形仍大致类似，此光致褪色后的荧光回复现象如图3上方所示。相较于这些内部封定细胞，使用三聚甲醛(paraformaldehyde)及戊二醛的经传统封定技术制备的细胞的膜流动性则明显降低，如图3上方所示。由其荧光回复半生期，即经光致褪色后的区域回复50％最终荧光量所需的时间判断，该内部封定技术相较于使用三聚甲醛或戊二醛的传统化学封定技术，对荧光回复几乎不造成影响，如图3下方所示。实验结果证实，这些细胞膜经内部封定后仍具备流动性。
除检测这些内部封定细胞的脂质膜流动性，也进一步使用全反射显微镜(totalinternal reflection microscopy,TIRF)检测穿膜蛋白流动性。首先将被绿色荧光蛋白标记的CD80蛋白(CD80-GFP)转染至HeLa细胞内，以在荧光显微镜下使穿膜蛋白显像。转染步骤完成后，表达CD80-GFP的HeLa细胞或以2.5％戊二醛封定，或以20wt％PEGDA及I-2959内部封定。接着使用全反射显微镜，比较经处理后的细胞与未经处理且表达CD80-GFP的HeLa细胞。在显微镜下，普通且未经处理的细胞会显现动态绿色荧光亮点，这些亮点随时间改变位置，显示穿膜蛋白可在脂质膜内自由移动(结果未显示)。这些内部封定细胞表达出的荧光亮点，其表达模式也与前者类似(结果未显示)，此结果显示尽管细胞内产生封定现象，细胞膜外层仍保持脂质流动性与蛋白流动性。相反的，使用传统交联剂戊二醛封定的细胞则会显现静态绿色亮点，这些亮点不随时间改变位置(结果未显示)。此研究突显了该内部封定方法的独特性质，可使细胞膜与其关联成分维持动态性质。
可将不同浓度的交联剂注入细胞内部，以进行内部封定反应，使可通过交联反应程度控制这些内部封定细胞的机械性质。本实验藉由原子力显微镜，显示这些内部封定细胞的杨氏模量随着PEGDA的wt％浓度变高而增加。在原子力显微镜下，这些内部封定细胞仍维持其类细胞形态(结果未显示)。另一方面，当内部封定时，随着PEGDA单体浓度由4wt％增加至40wt％，杨氏模量则由平均33.79变化至101.8kPa，如图4所示。
这些内部封定细胞具备一项关键特性，即这些细胞较普通且未实施封定技术的细胞坚固且更不易崩解，因为细胞内壁经水凝胶骨架充填，使细胞结构得以保持完整。将这些内部封定细胞置于水中并存放于4℃下30天，在库存期间，这些内部封定细胞皆明显维持其类细胞结构与形态，如图5所示。至于未经封定处理的细胞，则会在不良的细胞培养条件下进行细胞凋亡并迅速崩解。相反的，实验结果显示，这些内部封定细胞可承受严酷培养条件。因此，这些内部封定细胞可提供一可靠且多元的平台，以利实施涉及细胞膜界面的生医应用技术。
实例2：内部封定的免疫细胞
实验显示，经基因改造并刺激而于细胞表面上表达CD80及MHC-I分子的B16黑色素瘤细胞，可被内部封定。根据流式细胞仪分析结果，这些内部封定B16细胞的表面仍保留前述免疫调节分子(结果未显示)
另外，本实验探讨表达于经活化树突细胞上的淋巴细胞活化讯号1与2，是否可在树突细胞内部封定后仍正确表达。实验使用JAWSII小鼠树突细胞株作为模式细胞，并通过OT-I肽脉冲处理及使用脂多糖(LPS)刺激以完成活化步骤。本实验利用流式细胞仪测定后，发现活化树突细胞内的CD80表达程度相当高(约80.6％)，而未活化树突细胞内的CD80表达程度则偏低(约53.6％)。值得探究的是，内部封定树突细胞中仍持续表达CD80(活化细胞中约为59.1％，未活化细胞约为32.8％，如图6上方图表所示)，显示该封定方法并未使讯号2表达受限。另，将卵白蛋白(OVA)脉冲注入细胞内后，于经封定与未经封定细胞内的MHC-ISIINFEKL复合物(讯号1)表达程度分别为99.1％与92.2％，如图6下方图表所示。在未脉冲注入OVA的正常树突细胞与经封定的树突细胞上，皆测得可忽略的讯号。实验结果显示，该内部封定方法并未减弱活化抗原表达细胞上的膜结合淋巴细胞活化讯号。
为确认内部封定树突细胞是否可保留活体细胞的生物功能，本实验将经内部封定的树突细胞置于试管中，进行T细胞增殖测定。首先将CD8T细胞自OT-I小鼠分离，并以羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)标记。接着将这些细胞与经内部封定、源于骨髓的树突细胞(BMDCs)或正常源于骨髓的树突细胞一同培养。将所有细胞共同培养72小时并收成，接着以经异藻蓝素(allophycocyanin)标记的抗鼠CD3抗体染色，再使用流式细胞仪分析所有样本。经OT-I脉冲处理的正常与封定BMDC皆使OT-I T细胞数量增加，如图7上方图表所示。此结果显示该封定程序可保留BMDC功能。实施试管内增殖测定时，使用小鼠树突细胞株JAWSII，并将以CFSE标记的T细胞与正常或内部凝胶化JAWSII细胞共同培养。值得探究的是，该试管内测定结果显示经脉冲注入OVA的内部封定及未封定JAWSII树突细胞，皆会引起抗原专一性CD8OT-I T细胞增殖，如图7下方图表所示。相较于经脉冲注入OVA并封定的树突细胞，经脉冲注入OVA的正常树突细胞引起的T细胞增殖程度较高(分别为64.1％与84.4％)，如图7下方图表所示。这一差异可能与第三淋巴细胞活化讯号(细胞介质)有关，此讯号容易释放自活体细胞，但不存在于经封定细胞中。
另外，为确认内部封定树突细胞是否可于活体实作时保留自身生物功能，本实验将经内部封定的树突细胞置于活体中，进行T细胞增殖测定。首先将CD8T细胞自基因转殖OT-I小鼠分离并以CFSE标记，再将这些细胞静脉注射入小鼠体内。注射后24小时，将经OT-I脉冲处理的活体树突细胞(已活化)、未经OT-I脉冲处理的活体树突细胞(未活化)、经内部封定的活化树突细胞或经内部封定的未活化树突细胞通过静脉分别施打于四组不同的小鼠上。再经过三天后，这些小鼠全数牺牲，此时取出其脾脏细胞进行分析。流式细胞仪分析结果显示，经活化的活体树突细胞与经内部封定的活化树突细胞皆具备使抗原专一性CD8+T细胞增殖的能力，表示该内部封定方法可保留细胞表面抗原的生物功能，如图8所示。至于未活化的树突细胞，无论活体或经封定组别皆不具备使CD8T细胞增殖的能力，因此可进一步确认由经封定的活化树突细胞触发的T细胞增殖现象，是抗原表达后的结果，如图8所示。
实例3：内部封定的经培养饲养细胞
将内部封定技术实施于黏附HeLa细胞的单层上。首先将生长密度约70％的HeLa细胞培养于组织培养皿上，以使细胞黏附于培养皿上。培养步骤完成后，使用冻融膜穿孔法搭配20％PEGDA与1％I-2959，将其中一组培养样本内部封定。紫外光活化交联反应后，将该内部封定(凝胶化)的细胞单层置于不同环境下，分别与正常细胞比较，如图9左排影像所示。可观察到这些内部封定细胞保留了长条形态，与磷酸盐缓冲溶液中的正常细胞形态类似，显示该内部封定方法可保留这些黏附细胞的类细胞特征。为呈现该内部凝胶化细胞单层的稳固结构，本实验将细胞单层置于水中72小时并观察之，如图9右排影像所示。在溶液中的正常细胞，大多数呈现漂浮细胞残骸状。脱落的细胞清除后，培养皿上仅存少数细胞。细胞脱落现象发生后，正常细胞大幅流失，而这些内部封定细胞则维持先前密度，形态改变亦不大。这些内部封定细胞之所以稳定，与交联反应生成的水凝胶骨架带来的稳固锚定效果有关。实验结果显示，该内部封定方法可成功实施于黏附细胞样本上。该内部凝胶化细胞单层由于结构稳固，亦可成为长期库存的商品。
另外，本实验制备内部封定小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)单层。实验显示，该细胞单层可使胚胎干细胞持续生长。首先使用该内部封定技术将MEF单层封定，再将活体小鼠胚胎干细胞培养于该封定单层上。培植这些干细胞24小时后，使用显微镜观察发现明显的干细胞球状体，此结果显示这些干细胞始终维持正确形态，即其未分化状态(未显示于本实验资料中)。
实例4：用于侦测病原体的内部封定红血球细胞
本实验制备源于鸡与小鼠、经封定的红血球细胞(RBCs)。使用冻融法将20％PEGDA与1％I-2959注入这些红血球细胞内部，再以紫外光照射使交联剂聚合。使用DiI替细胞膜染色，并通过荧光显微镜观察到成功维持细胞形态，而内部封定后也成功保留膜成分(结果未显示)，此结果显示该内部封定技术可广泛适用于不同的目标细胞。
另外，本实验也进行血球凝集测定，测定时将内部凝胶化鸡红血球细胞与习知可使红血球细胞凝集的流感病毒(PR8)混合。该流感病毒不存在时，这些内部凝胶化鸡红血球细胞呈现大幅分散状，而流感病毒存在时，这些红血球细胞则显著凝集，如图10所示。该流感病毒成功使内部凝胶化鸡红血球细胞凝集，此结果显示该细胞表面上仍保有生物分子，而此凝集现象则取决于红血球细胞表面唾液酸与该流感病毒所载的血球凝集素之间的交互作用。
实验进一步使用穿透式电子显微镜，检测该流感病毒与这些内部封定鸡红血球细胞的结合情形。仔细观察样本后，可清楚发现这些凝胶化鸡红血球细胞皆保留其脂质双层膜，如图11上排影像所示。该流感病毒存在时，病毒与这些凝胶化细胞之间产生强烈交互作用，并引起大量病毒结合及细胞凝集反应，此结果类似于病毒与天然鸡红血球细胞的交互作用，如图11下排影像所示。凝集成团的内部凝胶化红血球细胞，可作为病毒侦测指标。此外，可继续将这些内部凝胶化红血球细胞自混合物分离，以进行病毒分离。
实例5：受内部封定细胞包覆的微粒
本实验实施一双重乳化程序，将PLGA与磺酸基-Cy5(sulfo-Cy5，红色)混合以合成基于PLGA的微粒。在实验中，亲水性sulfo-Cy5染剂是作为一模式被运送物质，藉此呈现成功包覆被运送物质的结果。以聚离胺酸(poly-L-lysine)包覆微粒后，再将这些被包覆的微粒与内部封定细胞混合，并使用羰花青膜染剂DiO(绿色)染色，最后使用共轭焦显微镜取得该混合物影像。结果显示，这些内部封定细胞成功附着于这些微粒上(结果未显示)。整体而言，以上结果突显了将内部封定囊泡与另一化合物或药物传输剂型结合的可行性。
其他实施例
本说明书揭露的所有技术特征，皆可以任何方式进行组合。本说明书揭露的各项特征，皆可以具备相同、相等或类似目的的其他特征取代。因此，除非另外说明，本说明书揭露的各项特征仅为一系列相等或相似特征中的其中一例。
根据上述说明，本领域技术人员可轻易验证前述实施例所包含的关键特性，且可在不超出前述实施例范围与精神的情况下，对其内容进行各种改变及修饰，以使其能应付各式用途与条件。因此，其他实施例亦包含于本发明的申请专利范围内。
Claims (21)
1.一种生成内部封定脂囊泡的方法，包含：
提供前驱脂囊泡，其具备包覆于脂质膜内的水性内壁，其中所述前驱脂囊泡的脂质膜对交联剂不具通透性；
使所述脂质膜短暂地具备通透性，以生成具通透性的囊泡；
使所述具通透性的囊泡与不具活性但可活化的交联剂接触，所述不具活性但可活化的交联剂藉此进入具通透性的囊泡中；
使所述具通透性的囊泡回复成不具通透性的囊泡；
清除任何囊泡外的交联剂；及
活化所述不具活性但可活化的交联剂，使所述不具通透性的囊泡中产生交联反应，以生成内部封定的脂囊泡。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述前驱脂囊泡为细胞或病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞为人类细胞、非人类细胞、细菌细胞、真菌细胞、不朽化细胞、基因改造细胞、人造细胞、免疫细胞、上皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾细胞、纤维母细胞、软骨细胞、肌肉细胞、血球细胞、骨细胞、分泌细胞、干细胞、耳毛细胞、脑细胞、神经细胞、肺细胞或癌细胞。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述不具活性但可活化的交联剂为光反应交联剂、热反应交联剂或化学反应交联剂。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中使所述前驱脂囊泡具备通透性的步骤是藉由对前驱脂囊泡施加冻融法(freezing and thawing)、渗透压冲击法(osmotic shock)、超声波穿孔法(sonoporation)、电穿孔法(electroporation)、激光、基于界面活性剂的穿孔法或剪切。
7.一种藉由一种方法生成的内部封定脂囊泡，所述方法包含：
(i)提供前驱脂囊泡，其具备包覆于脂质膜内的水性内壁，其中所述前驱脂囊泡的脂质膜对交联剂不具通透性；
(ii)使所述前驱脂囊泡短暂地具备通透性，以生成具通透性的囊泡；
(iii)使所述具通透性的囊泡与不具活性但可活化的交联剂接触，所述不具活性但可活化的交联剂藉此进入具通透性的囊泡中；
(iv)使所述具通透性的囊泡回复成不具通透性的囊泡；
(v)清除任何囊泡外交联剂；及
(vi)活化所述不具活性但可活化的交联剂，使所述不具通透性的囊泡中产生交联反应，以生成内部封定的脂囊泡；
其中所述内部封定的脂囊泡具有脂质膜，所述脂质膜在一或多个特性上与所述前驱脂质膜实质相同。
8.如权利要求7所述的内部封定脂囊泡，其中所述一或多个特性选自由对界面活性剂的敏感性、膜流动性、膜蛋白流动性、膜通透性、膜成分、表面电荷及生物功能所组成的群组。
9.如权利要求7或8所述的内部封定脂囊泡，其中所述前驱脂囊泡为细胞。
10.如权利要求9所述的内部封定细胞，其中所述细胞具有内源、外源或经基因改造的细胞表面蛋白或聚糖。
11.如权利要求9所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞为抗原呈现细胞。
12.如权利要求11所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞为癌细胞或树突细胞。
13.如权利要求9所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞为经培养的饲养细胞。
14.如权利要求13所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞为小鼠胚胎纤维母细胞(mouse embryonic fibroblast)、JK1饲养细胞或SNL 76/7饲养细胞。
15.如权利要求9所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞具有能与药物或候选药物结合的细胞表面受体。
16.如权利要求9所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞具有能与病原体结合的细胞表面受体。
17.如权利要求16所述的内部封定脂囊泡，其中所述细胞为红血球细胞、免疫细胞或血小板。
18.一种调节免疫反应的方法，包含：
提供如权利要求11所述的内部封定脂囊泡；及
使所述内部封定脂囊泡与抗原反应细胞接触。
19.一种培养目标细胞的方法，包含：
提供单层的如权利要求13所述的内部封定脂囊泡；及
共同培养所述单层与目标细胞。
20.一种分析药物或候选药物的方法，包含：
提供如权利要求15所述的内部封定脂囊泡；
使所述内部封定脂囊泡与药物或候选药物接触；及
分析经接触后的所述内部封定脂囊泡。
21.一种结合病原体的方法，包含：
提供如权利要求16所述的内部封定脂囊泡；及
使所述内部封定脂囊泡与含有或疑似含有病原体的样本接触。
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