TW201808267A - 內部封定脂質體 - Google Patents
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Abstract
一種生成內部封定脂質體的方法，包含：提供前驅脂質體，其具備包覆於脂質膜內之水性內壁，其中前驅脂質體之脂質膜對交聯劑不具通透性；使脂質膜短暫地具備通透性，以生成具通透性之囊泡；使具通透性之囊泡與不具活性但可活化之交聯劑接觸，不具活性但可活化之交聯劑藉此進入具通透性之囊泡中；使具通透性之囊泡回復成不具通透性之囊泡；清除任何囊泡外之交聯劑；及活化不具活性但可活化之交聯劑，使不具通透性之囊泡中產生交聯反應，以生成內部封定之脂質體。
Description
本申請案主張於2016年8月1日申請之美國臨時申請案第62/369,440號之優先權，該臨時申請案之全部內容以引用方式併入本文中。
細胞膜由雙層脂質、蛋白質及聚醣組成，以上物質共同構成一細緻界面，負責掌控細胞標誌及物質運輸、信號傳導、細胞黏附等功能。雙層脂質具備高度流動性，可使細胞膜內各種基團側向流動。此細緻界面為許多生物學研究及生醫領域技術應用之核心，而目前亦出現許多於一穩固基質上重構此細緻界面之實務應用技術。細胞本質上較為脆弱，易受各種影響表面生化反應之生物機制(如細胞凋亡及囊泡出芽)左右。
目前維持細胞膜構造之技術包括於平面或球狀基質上重構純化細胞膜，以及使用甲醛(formaldehyde)與戊二醛(glutarasldehyde)等化學交聯劑將細胞完整封定。然而，就重構複雜且具流動性之細胞膜界面而言，這些技術仍有不足之處，例如在合成基質上重構純化細胞膜時，會面臨細胞膜雜質、細胞膜破損、細胞膜覆蓋基質不完全等問題，而使用化學封定技術時，則會造成膜蛋白原始狀態改變、蛋白流動性降低，並在生醫技術應用過程中製造毒性。有鑑於生成穩定且具流動性之細胞膜界面存在諸多困難，許多以膜界面上分子間交互作用為核心之生物學研究及生醫技術應用因此進展有限。
根據本申請案所請發明之一態樣，提供一種生成內部封定脂質體的方法。該方法包括提供前驅脂質體，其具備包覆於脂質膜內之水性內壁，其中前驅脂質體之脂質膜對交聯劑不具通透性；使脂質膜短暫地具備通透性，以生成具通透性之囊泡；使具通透性之囊泡與不具活性但可活化之交聯劑接觸，不具活性但可活化之交聯劑藉此進入具通透性之囊泡中；使具通透性之囊泡回復成不具通透性之囊泡；清除任何囊泡外交聯劑；及活化不具活性但可活化之交聯劑，使不具通透性之囊泡中產生交聯反應，以生成內部封定之脂質體。
在某些實施例中，前驅脂質體為細胞或病毒。例如細胞可為哺乳動物細胞或非哺乳動物細胞，如人類細胞、非人類細胞、細菌細胞、真菌細胞、不朽化細胞、基因改造細胞、人造細胞、免疫細胞、上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、纖維母細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、血球細胞、骨細胞、分泌細胞、幹細胞、耳毛細胞、腦細胞、神經細胞、肺細胞或癌細胞。
在某些實施例中，不具活性但可活化之交聯劑為光反應交聯劑、熱反應交聯劑或化學反應交聯劑。舉例而言，化學反應交聯劑可為具任意分子量之環氧化物(epoxine)、聚氨酯(urethane)、聚醚(polyether)、聚酯纖維(polyester)，或含疏水側基之聚丙烯醯胺(polyacrylamide)衍生物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物(triblock copolymer)、甲基丙烯酸羥基乙酯-甲基丙烯酸甲酯(hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate,HEMA-MMA)、聚丙烯腈-聚氯乙烯(polyacrylonitrile-polyvinyl chloride,
PAN-PVC)、聚異丙基丙烯醯胺(poly(N-isopropyl acrylamide),polyNIPAM)、聚乙烯基己內醯胺(poly(N-vinylcaprolactam))、纖維素(cellulose)衍生物、環氧乙烷-丙烯(ethylene oxide-propylene)或Matrigel膠。具通透性囊泡可與含有1至70wt%(如2、4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70wt%)交聯劑之溶液接觸。在某些實施例中，光起始劑與光交聯劑合併使用。例如交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethyleneglycol diacrylate,PEGDA)即可與光起始劑2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone,I-2959)合併使用。
使前驅脂質體具備通透性之步驟係藉由對前驅脂質體施加凍融法(freezing and thawing)、滲透壓衝擊法(osmotic shock)、超音波穿孔法(sonoporation)、電穿孔法(electroporation)、雷射、基於界面活性劑之穿孔法或剪切。在某些實施例中，此步驟於交聯劑、光起始劑(非必要)存在時進行。
根據本申請案所請發明另一態樣，揭露一種透過本文中提出的方法生成之內部封定脂質體。內部封定脂質體之脂質膜在一或多個特性上與前驅脂質體之脂質膜實質相同，例如對界面活性劑之敏感性、膜流動性、膜蛋白流動性、膜通透性、膜成分、表面電荷及生物功能。製備內部封定脂質體時，可使用任意前驅脂質體，並搭配如本文中所述之不同濃度光反應交聯劑、熱反應交聯劑或化學反應交聯劑。
在某些實施例中，前驅脂質體為細胞。細胞可具有內源、外源或經基因改造之細胞表面蛋白或聚醣。舉例而言，細胞可為抗原呈現細
胞(如一癌細胞或樹突細胞)、經培養之餵養細胞(如一小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast)、JK1餵養細胞或SNL 76/7餵養細胞)、具有能與藥物或候選藥物結合的細胞表面受體之細胞、具有能與病原體結合的細胞表面受體之細胞(如紅血球細胞、免疫細胞或血小板)。
根據本申請案所請發明另一態樣，提出一種調節免疫反應的方法，包括提供自抗原呈現細胞(如癌細胞或樹突細胞)製備之內部封定脂質體，製備過程使用本申請案提出之方法，以及使內部封定脂質體與抗原反應細胞接觸。
另，本申請案所請發明揭露一種培養目標細胞的方法。該方法包含提供自經培養之餵養細胞(如小鼠胚胎纖維母細胞、JK1餵養細胞或SNL 76/7餵養細胞)製備之單層的內部封定脂質體，製備過程使用本申請案提出之方法，以及共同培養單層與目標細胞。
又根據本申請案所請發明一態樣，提供一種分析藥物或候選藥物的方法，包括提供自具有能與藥物或候選藥物結合之細胞表面受體的前驅細胞製備之內部封定脂質體，製備過程使用本申請案提出之方法、使內部封定脂質體與藥物或候選藥物接觸，以及分析經接觸後之內部封定脂質體。
根據本申請案所請發明另一態樣，提出一種結合病原體的方法。該方法包括提供自具有能與病原體結合之細胞表面受體的細胞製備之內部封定脂質體，製備過程使用本申請案提出之方法，以及使內部封定脂質體與含有或疑似含有病原體之樣本接觸。方法可進一步包括結合偵測步驟。
一或多個實施例之具體細節，可參照所附圖式及以下詳細說明。本申請案實施例之其他特徵、目的及優點在參照以下說明、所附圖式及請求項後，將會變得明顯。
第一圖係為比較8%十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下、細胞密度近似之正常細胞與內部凝膠化細胞的一組顯微影像圖。比較兩者後發現，正常細胞於界面活性劑存在時會分解，而內部凝膠化細胞在脂質膜溶解後呈現出水凝膠狀骨架。
第二圖係一組穿透式電子顯微鏡影像圖，分別為正常細胞(上排)、內部凝膠化細胞(中排)、於8% SDS溶液中浸泡過之內部凝膠化細胞(下排)。箭頭標示處為脂質膜。
第三圖係一組圖表，顯示經不同濃度交聯劑內部封定的HeLa細胞，接受光致褪色(photobleaching)後螢光恢復之狀態。該些內部凝膠化細胞之膜流動性接近正常細胞，如其經光致褪色後螢光恢復之訊號所示(上圖)，以及經光致褪色後螢光恢復之半生期所示(下圖)。
第四圖係一圖表，顯示分別使用4、10、20、40wt% PEGDA封定之內部凝膠化細胞，於原子力顯微鏡測定下之可調變楊氏模量(tunable Young’s moduli)。
第五圖係一組顯微影像圖，顯示置於4℃水中30天的經內部封定之HeLa細胞。該些封定細胞於第0天(左)、第10天(中)、第30天(右)時，其細胞結構與形態並未呈現明顯變化。
第六圖係一組圖表，顯示在內部封定樹突細胞(DCs)表面
上所呈現之CD80(上圖)及第一型主要組織相容性複合物(MHC)/SIINFEKL複合物(下圖)。
第七圖係一組圖表，顯示源於骨髓並凝膠化、活化之樹突細胞(BMDCs，上圖)及JAWSII細胞(下圖)，於試管內(in vitro)實驗中刺激T細胞增生之情形。
第八圖係一組圖表，顯示源於骨髓並內部凝膠化、活化之樹突細胞於活體內(in vivo)實驗中刺激T細胞增生之情形。
第九圖係一組影像，顯示不同條件下之黏附HeLa細胞(上排)與內部封定HeLa細胞(下排)。相較之下，兩樣本在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中皆呈現類似生長密度(confluency)及形態。置於水中時，該些內部封定細胞較不易因滲透壓而膨脹。在水中靜置72小時後，該些內部封定細胞較能滯留於培養皿上。
第十圖係一組影像，顯示經內部凝膠化之雞紅血球細胞均勻分散在溶液中(左圖)，而流感病毒PR8存在時則出現血球凝集現象(右圖)。
第十一圖係一組穿透式電子顯微鏡影像，顯示流感病毒不存在(上排)及存在(下排)時，經內部凝膠化之雞紅血球細胞所呈現之狀態。
經研究意外發現，於皆不破壞具流動性外膜表面及相關表面成分之情況下，可封定脂質體(如細胞)。而經內部封定之脂質體則保留原始外層結構，且不易受環境壓力影響。脂質體經內部封定後，其膜脂質及膜蛋白仍保持流動性。
由該方法生成之內部封定脂質體，具有包覆於脂質膜內之封定或凝膠化內部結構，該脂質膜與其前驅未封定脂質體之脂質膜實質相同。前驅脂質體所具備之特性皆可保留，例如對界面活性劑之敏感性、膜流動性、膜蛋白流動性、膜通透性、膜成分、表面電荷及生物功能等。
內部封定脂質體保有具流動性之膜表面時，即可與化合物、生物分子、病原體、細胞等實體進行仿生交互作用。本文中所提出之內部封定方法可廣泛作為保存細胞之手段以利進行生醫分析工作，適用細胞包括難以於活體外(ex vivo)或試管內保存之罕見細胞。舉例而言，可內部封定包含生物細胞之獨立臨床樣本，以利進行後續分析工作，譬如尋找具療效潛力之特定配體。內部封定脂質體亦可作為生物膜研究領域之泛用工具，可提供穩固、多樣化模型，針對受體-配體結合、細胞黏附等界面間作用力進行研究。內部封定脂質體可用於開發複雜裝置，如經類細胞生物官能化之生物感應器，亦可附著於藥物或藥物傳輸系統上，以提升藥物療效。
內部封定脂質體之其他應用方式包括但不限於免疫調節、藥物篩選、組織工程、細胞凝集測定系統及用以去除病原性實體之過濾系統。
視應用方式而定，內部封定脂質體可用於懸浮液中、培養皿上之單層細胞中，或附著於一固態基質(如平板、聚合物或粒子)或其他結構上。
本文中所提出之生成內部封定脂質體的方法，包含使前驅脂質體之脂質膜短暫地具備通透性，以使不具活性但可活化之交聯劑進入脂
質體。交聯劑進入具通透性之脂質體後，囊泡可回復成不具通透性之囊泡，並將交聯劑封入囊泡內部。若囊泡外仍有交聯劑殘留，則可透過清洗囊泡等方式清除之。交聯劑封入囊泡後即活化，並對脂質體進行內部封定，而不損壞膜結構。使囊泡具備通透性之步驟可於交聯劑存在時進行。
內部封定脂質體可由任何由脂質膜組成之前驅脂質體製備。舉例而言，脂質體可為細胞或病毒。細胞可為原核細胞(如細菌細胞)或真核細胞(如哺乳動物細胞或非哺乳動物細胞)。細胞亦可為基因改造細胞或人造細胞。在某些實施例中，細胞可為人類細胞、非人類細胞、真菌細胞、免疫細胞、上皮細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎細胞、纖維母細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、血球細胞、骨細胞、分泌細胞、幹細胞、耳毛細胞、腦細胞、神經細胞、肺細胞或癌細胞。前驅細胞亦可經過基因改造，以大量表現內源性膜蛋白、表現外源性且經基因變異或經融合之膜蛋白，或去除內源性膜蛋白。
為於前驅脂質體上短暫地製造膜穿孔或使其具通透性，可採用本發明所屬技術領域之習知技術，包括但不限於凍融法、滲透壓衝擊法、超音波穿孔法、電穿孔法、雷射致膜穿孔法(laser-induced membrane poration)、剪切致膜穿孔法(shear-induced membrane poration)，及其他機械性手段之技術。舉例而言，當脂質膜鄰近區域出現空洞時，即表示超音波穿孔法產生效果。透過會刺穿脂質膜之聲波微流(acoustic microstreaming)、氣泡震盪(bubble oscillations)、震波(shock waves)及微噴射形成(microjet formation)等方法，可在微泡與膜產生交互作用時短暫地製造穿孔。本發明所屬技術領域之通常知識者能夠判斷如何應用相關
技術，以於膜上短暫地製造穿孔且不使膜永久受損。一般而言，停止實施短暫穿孔技術後，穿孔即會自動關閉。
能通過經通透化處理之脂質膜，以及可於脂質體內部活化以生成封定內壁之任何交聯劑，皆適用本文中所提供之方法。在某些實施例中，交聯劑為可活化、可交聯以形成膠體之單體或聚合物。熱反應性水凝膠交聯、pH-敏感型水凝膠交聯、化學反應性水凝膠交聯及溶膠-凝膠二氧化矽(sol-gel silica)水凝膠交聯，皆屬可活化之交聯技術範例。
在某些實施例中，使用光聚合反應或光交聯反應。光聚合反應為使聚合物進行交聯反應，聚合物觸光時會改變材料性質進而固化或硬化，光通常為紫外光或可見光之電磁波波段。無論是否存在一光起始劑，該反應皆可進行。光起始劑種類包括但不限於陽離子性光起始劑(如鎓鹽、有機金屬及吡啶陽離子鹽)與自由基光起始劑(如二苯甲酮、山酮、醌、安息香醚、苯乙酮、苯肟及醯膦)。光反應性交聯劑種類包括但不限於具任意分子量之環氧化物、聚氨酯、聚醚及聚酯纖維。光反應性交聯劑通常用於丙烯酸酯，以進行交聯反應。舉例而言，分子量為700之聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)可與2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I-2959)合併使用作為光起始劑。
熱反應性聚合物通常包含疏水基，或於臨界溫度下易連鎖凝集的基團。熱反應性聚合物可於特定溫度(如不引起反應的溫度)下，置入經通透化的脂質體，並在溫度改變為臨界溫度之後進行交聯反應。適用本文中提出的內部封定方法之熱敏感聚合物種類，包括但不限於含疏水側基之聚丙烯醯胺衍生物、PEG-PLGA-PEG三嵌段共聚物、甲基丙烯酸羥基
乙酯-甲基丙烯酸甲酯(HEMA-MMA)、聚丙烯腈-聚氯乙烯(PAN-PVC)、聚異丙基丙烯醯胺(polyNIPAM)、聚乙烯基己內醯胺、纖維素衍生物、環氧乙烷-丙烯及Matrigel膠。
舉例而言，可將前驅脂質體懸浮於含光反應交聯劑、光起始劑(如20wt% PEGDA與1wt% I-2959)之溶液中，並置於-20℃下冷凍。經冷凍後，會產生能在該脂質體膜上製造穿孔之冰晶，使交聯劑與光起始劑能夠進入脂質體。在解凍且膜上穿孔自動關閉後，即於等滲透壓溶液中清洗脂質體，以稀釋囊泡外PEGDA及I-2959成分。接著將清洗過之脂質體放至紫外光下照射，PEGDA單體即於脂質體中存在I-2959時產生交聯反應。
另，該方法除可適用懸浮液體中之脂質體，亦可直接適用培養皿上單層之脂質體(如細胞)。舉例而言，細胞可置於組織培養皿上培養，並可附著於組織培養皿上。接著，培養物可經通透化處理，譬如於交聯劑及起始劑(非必要)存在時實施凍融法。細胞膜上短暫開啟之孔洞重新關閉後，再洗去囊泡外任何交聯劑或起始劑，並使位於胞內之交聯劑活化，以於單層細胞內產生內部封定之細胞。
內部封定脂質體之機械性質(如彈性或勁度)，可藉由在脂質體中注入不同濃度交聯劑進行調整，以控制交聯反應程度。舉例而言，可採用高濃度交聯劑，以生成較強韌之內部封定脂質體。本發明所屬技術領域之通常知識者可根據脂質體、交聯劑種類與欲獲得之機械性質，決定適當之交聯劑濃度。
對於能於治療疾病過程中促進或破壞細胞免疫力之免疫調節材料，歷來頗受關注。舉例而言，製備人造抗原呈現細胞之目的，為於活體中使腫瘤專一性T細胞增殖，而耐受性誘導粒子則用於治療自體免疫疾病及提高同種異體移植成功率。商業上習慣透過合成材料模擬抗原呈現細胞，以促使免疫細胞增殖，而同樣技術在研究與臨床實務上亦存在諸多應用。然而，合成材料之免疫調節效果仍不及細胞系統，尤其對於製備合成系統，使之能如實呈現抗原呈現細胞活體上之流動性表面蛋白，即激發免疫作用之主要因子，依然相當困難。另一方面，細胞系統本身即存在一些限制，譬如存活力低、表型易改變，以及可能成為病毒性傳染病之傳染源。
本文中提出之內部封定方法可破壞抗原呈現細胞之增殖能力，但不破壞其抗原呈現能力，使其成為具流動性表面蛋白的一新穎平台以刺激T細胞。該些內部封定細胞仍保有增強免疫的能力，同時不具致癌風險。因此，為激發免疫反應，可將經內部封定之抗原呈現細胞施予一受試對象。舉例而言，癌細胞可經內部封定，並用以使腫瘤專一性T細胞於活體內或活體外增殖。本文中提出之內部封定方法適用於任何癌細胞，包括但不限於黑色素瘤細胞、白血病細胞、肝癌細胞、胰臟癌細胞、前列腺癌細胞、乳癌細胞及卵巢癌細胞。研究結果顯示，經T細胞共同刺激因子(如CD80)轉染之癌細胞，能促發T細胞之強力抗癌反應。因此，在某些實施例中，即將內部封定之癌細胞可接受基因改造，以表現一或多個免疫調節分子，包括但不限於CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、CD40、CD3、CD28及CD58蛋白質。本文中提出之方法亦可適用於內部封定樹突細胞等其他抗原呈現細胞，只要將目標抗原脈衝注入前述細胞，即可呈現抗原。
細胞與組織培養系統的市場日益擴大。能精細模仿細胞天然環境棲位(niche)之仿生系統，可提升組織培養的增殖力與存活力。舉例而言，維持幹細胞經常需要特定養分，譬如纖維母細胞、細胞介質及胞外間質成分。進行幹細胞培養時，往往需要在培養基質上鋪一層餵養細胞，以提供維持幹細胞多能性所需之微環境。此餵養細胞層通常以小鼠胚胎纖維母細胞(MEFs)、JK1餵養細胞或SNL 76/7餵養細胞製備而成。然而，使用活體餵養細胞耗費的工程較大，也會導致細胞汙染。歷來已研發出數種取代幹細胞培養所需活體餵養細胞之方法，而這些合成系統則包括以蛋白質覆蓋之培養皿及經化學封定之餵養細胞層，以利保留維持幹細胞所需之生物分子信號。
相較於蛋白質覆蓋之基質與以其他化學封定技術製備之餵養細胞，由本文中提出方法所生成之內部封定細胞具備較多優點。若僅使該些細胞進行細胞質交聯，即可維持其原本形態、膜流動性及膜蛋白動態。包括小鼠胚胎纖維母細胞(MEFs)在內之餵養細胞，在經製備並內部封定後，可繼續用於幹細胞繼代培養。經內部封定之單層小鼠胚胎纖維母細胞仍保有原本形態及流動性膜蛋白，以提供維持幹細胞所需之刺激物。由於該些內部封定細胞並非活體，因此可被穩定保存及運送。製備彈性不同、經封定之餵養細胞時，亦可以滿足特定組織培養需求為目標，手段包括調整交聯反應程度。可滿足組織培養需要之內部封定細胞單層，其種類包括但不限於小鼠胚胎纖維母細胞、JK1餵養細胞、SNL 76/7餵養細胞與人源纖
維母細胞。內部封定之餵養細胞可用於培養及維持不同種類的細胞，如免疫細胞、癌細胞、初代細胞株與不同來源之幹細胞。
有鑑於膜通透性與蛋白質結合反應會影響藥物吸收與分布，可先在試管內針對分子與細胞膜間交互作用進行檢驗，即可於手續較為繁複之活體內檢測前先進行初期篩選工作。於化合物存在下，可搭配使用微脂體(liposomes)與由粒子支持之脂質膜，以分析兩者和細胞之間的交互作用。然而，即使採用前述方法，仍無法再現真實細胞表面的複雜構造。另一方面，活體細胞也無法承受化學性壓力，因此無法直接用於檢測分子運輸動態變化。
本文中提出之內部封定方法，可作為理想的藥物與分子篩選方案。經內部封定之細胞仍保留其天然磷脂質雙層膜與表面蛋白，亦可承受化學性壓力，因此可與不同化合物(如候選藥物)混合並接受分析，以掌握膜結合反應及/或化合物運輸動態變化情形。分析藥物通透性與吸收效果時，可針對任何細胞種類進行內部封定。可經內部封定並用於分子篩選之細胞種類，包括但不限於腸道上皮細胞(如分析口服吸收情形)、腦細胞(如分析腦與血漿間物質之分布情形)、癌細胞(如分析癌細胞標靶療法效果)、免疫細胞與紅血球細胞。該內部封定技術可用於篩選小分子化合物、碳水化合物、聚合物、胜肽、蛋白質與核酸等分子。
毒素、病毒、細菌、寄生蟲與真菌等病原體結構通常對細胞膜具高度親合性，可藉此攻擊特定細胞或組織，以入侵宿主、剝奪養分及逃脫免疫。有鑑於前述病原體結構性質，可改造裝置，使其具有和病原體進行交互作用之類細胞外層結構，進而用來偵測或分離病原體。經本文中提出方法製備之內部封定脂質體，具備可模擬天然生物膜之一脂質膜，並可與黏附細胞的病原體進行仿生交互作用。舉例而言，該內部封定脂質體可偵測或與樣本中之一病原體結合，亦可用於分離或過濾(如清除)樣本中之病原體。
具有病原體親合性膜之任何前驅脂質體(如細胞)，皆可用以製備內部封定囊泡，以偵測或與該病原體結合。可經內部封定、用以偵測特定病原體之細胞種類包括但不限於紅血球細胞(與流感病毒、大腸桿菌及瘧疾寄生蟲結合)、免疫細胞(與人類免疫缺乏病毒結合)與血小板(與金黃色葡萄球菌及循環腫瘤細胞結合)。前驅細胞可經基因改造，以針對病原體表現細胞表面受體。該些內部封定細胞可置於懸浮液中或固定於固態基質上，以偵測、分離及/或過濾病原體。視待偵測病原體而定，本發明所屬技術領域之通常知識者可選擇適當前驅細胞作為製備內部封定細胞之用，以與病原體結合並偵測結合反應。
舉例而言，可製備並利用內部封定紅血球，以結合並偵測流感病毒。紅血球的細胞膜上具有唾液酸受體，可與病毒表面上表現的血球凝集素醣蛋白結合。該結合反應會導致可觀察到的紅血球凝集現象，該現象係病毒存在之指標。在商業上，源於不同動物之紅血球可作為病毒定量工具，然而天然紅血球較為脆弱，因此庫存效期有限。另一方面，經本文
中提出方法製備之內部封定紅血球則會保留其原始形態、功能與細胞膜成分，以利與病毒進行交互作用，同時較天然紅血球不易受環境壓力與崩解作用影響。
應理解的是，以下實例僅作為示例說明之用，而非以任何方式限制本案所揭露的其餘內容。無須進一步闡述，咸相信本發明所屬技術領域之通常知識者可基於本文中之敘述，將本案揭露之技術利用至最廣程度。
製備內部封定細胞時，使用置於懸浮液中之HeLa細胞、交聯劑單體聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)與光起始劑2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I-2959)。
使用凍融法，將PEGDA與I-2959由膜上暫時穿孔注入HeLa細胞內部。該些細胞懸浮於含20wt% PEGDA與1wt% I-2959之溶液中，並冰凍於-20℃下。細胞膜經冰凍後會出現穿孔，使交聯劑與光起始劑能進入細胞中。在解凍及膜上穿孔自動關閉後，即於等滲透壓溶液中清洗該些細胞，以稀釋胞外PEGDA及I-2959成分。接著將該些清洗過的細胞置於紫外光下照射，該PEGDA單體即於I-2959存在時產生交聯反應。當胞外存在大量經稀釋之PEGDA與I-2959，則僅細胞內壁會產生交聯反應。實施封定技術後，經交聯之水凝膠形同合成細胞骨架，可支撐該具動態結構之脂質雙層膜。
為呈現經紫外光催化形成之水凝膠而內部封定成功之目標
細胞，首先將內部封定細胞置於8%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中，以判斷經水凝膠交聯而形成之細胞內間質狀態，並取未經內部封定之正常細胞為控制組。將正常細胞置於8% SDS溶液中後，界面活性劑會使脂質膜上成分溶解，導致該些細胞快速溶解，透過光學顯微鏡可觀察到最後僅存細胞殘骸，如第一圖左方影像所示。另一方面，經內部封定之細胞則呈現球狀骨架，其大小近似原始細胞基質，如第一圖右方影像所示。實驗結果顯示，細胞表面膜內部成功產生水凝膠交聯反應。由於水凝膠不會被界面活性劑溶解，在可溶解脂質膜成分的SDS存在之情形下，依然可觀察到細胞大小之骨架。
為判斷實施該內部封定技術後該膜界面是否可維持，以穿透式電子顯微鏡(TEM)觀察經內部封定之細胞表面狀況。在TEM下，正常細胞(第二圖上排)與內部封定細胞(第二圖中排)表面未呈現任何明顯差異。在此二樣本中，脂質雙層膜皆清晰可辨識(第二圖中箭頭標示處)，表示在實施內部封定技術後，該細胞膜界面仍然存在。使用8% SDS溶解細胞膜後，該些內部封定細胞之脂質膜即消失，僅留下細胞內部之水凝膠骨架，如第二圖下排所示。實驗結果顯示，該內部封定技術並未破壞外層膜界面，並能保留可被界面活性劑分解之完整無損的雙層膜。
以親脂性染劑1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青過氯酸鹽(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)將該些內部封定細胞之細胞膜染色，以使表面脂質膜顯像。使用共軛焦顯微鏡觀察結果時，可發現該親脂性染劑標示出該些內部凝膠化細胞外壁，換言之，表面膜仍完整無損且仍具親脂性(結果未顯示)。
該些內部封定細胞之膜流動性，可透過一光致褪色後螢光回復技術(fluorescence recovery after photo-bleaching,FRAP)確認。該技術使用高能量雷射，對經螢光標記之一細胞膜片段進行轟擊，以將該區域之螢光物質光致褪色。在關閉雷射後，即可於該區域觀察到螢光回復現象。本研究使用不同濃度之PEGDA製備內部封定HeLa細胞，如4wt%、10wt%、20wt%與40wt%。實驗結果顯示，儘管各樣本之水凝膠形成狀況不同，即交聯反應程度互有差異，整體螢光回復情形仍大致類似，此光致褪色後之螢光回復現象如第三圖上方所示。相較於該些內部封定細胞，使用三聚甲醛(paraformaldehyde)及戊二醛之經傳統封定技術製備的細胞之膜流動性則明顯降低，如第三圖上方所示。由其螢光回復半生期，即經光致褪色後之區域回復50%最終螢光量所需之時間判斷，該內部封定技術相較於使用三聚甲醛或戊二醛之傳統化學封定技術，對螢光回復幾乎不造成影響，如第三圖下方所示。實驗結果證實，該些細胞膜經內部封定後仍具備流動性。
除檢測該些內部封定細胞之脂質膜流動性，也進一步使用全反射顯微鏡(total internal reflection microscopy,TIRF)檢測穿膜蛋白流動性。首先將被綠色螢光蛋白標記的CD80蛋白(CD80-GFP)轉染至HeLa細胞內，以在螢光顯微鏡下使穿膜蛋白顯像。轉染步驟完成後，表現CD80-GFP的HeLa細胞或以2.5%戊二醛封定，或以20wt% PEGDA及I-2959內部封定。接著使用全反射顯微鏡，比較經處理後之細胞與未經處理且表現CD80-GFP之HeLa細胞。在顯微鏡下，普通且未經處理之細胞會顯現動態綠色螢光亮點，該些亮點隨時間改變位置，顯示穿膜蛋白可在該脂質膜內自由移動(結果未顯示)。該些內部封定細胞表現出的螢光亮點，其表現模式也與前者
類似(結果未顯示)，此結果顯示儘管細胞內產生封定現象，細胞膜外層仍保持脂質流動性與蛋白流動性。相反的，使用傳統交聯劑戊二醛封定之細胞則會顯現靜態綠色亮點，該些亮點不隨時間改變位置(結果未顯示)。此研究突顯了該內部封定方法之獨特性質，可使細胞膜與其關聯成分維持動態性質。
可將不同濃度之交聯劑注入細胞內部，以進行內部封定反應，使可透過交聯反應程度控制該些內部封定細胞之機械性質。本實驗藉由原子力顯微鏡，顯示該些內部封定細胞之楊氏模量隨著PEGDA之wt%濃度變高而增加。在原子力顯微鏡下，該些內部封定細胞仍維持其類細胞形態(結果未顯示)。另一方面，當內部封定時，隨著PEGDA單體濃度由4wt%增加至40wt%，該楊氏模量則由平均33.79變化至101.8kPa，如第四圖所示。
該些內部封定細胞具備一項關鍵特性，即該些細胞較普通且未實施封定技術之細胞堅固且更不易崩解，因為細胞內壁經水凝膠骨架充填，使細胞結構得以保持完整。將該些內部封定細胞置於水中並存放於4℃下30天，在庫存期間，該些內部封定細胞皆明顯維持其類細胞結構與形態，如第五圖所示。至於未經封定處理之細胞，則會在不良的細胞培養條件下進行細胞凋亡並迅速崩解。相反的，實驗結果顯示，該些內部封定細胞可承受嚴酷培養條件。因此，該些內部封定細胞可提供一可靠且多元的平台，以利實施涉及細胞膜界面之生醫應用技術。
實驗顯示，經基因改造並刺激而於細胞表面上表現CD80及MHC-I分子之B16黑色素瘤細胞，可被內部封定。根據流式細胞儀分析結果，該些內部封定B16細胞的表面仍保留前述免疫調節分子(結果未顯示)
另外，本實驗探討表現於經活化樹突細胞上之淋巴細胞活化訊號1與2，是否可在樹突細胞內部封定後仍正確表現。實驗使用JAWSII小鼠樹突細胞株作為模式細胞，並透過OT-I胜肽脈衝處理及使用脂多醣(LPS)刺激以完成活化步驟。本實驗利用流式細胞儀測定後，發現活化樹突細胞內之CD80表現程度相當高(約80.6%)，而未活化樹突細胞內之CD80表現程度則偏低(約53.6%)。值得探究的是，內部封定樹突細胞中仍持續表現CD80(活化細胞中約為59.1%，未活化細胞約為32.8%，如第六圖上方圖表所示)，顯示該封定方法並未使訊號2表現受限。另，將卵白蛋白(OVA)脈衝注入細胞內後，於經封定與未經封定細胞內之MHC-I SIINFEKL複合物(訊號1)表現程度分別為99.1%與92.2%，如第六圖下方圖表所示。在未脈衝注入OVA之正常樹突細胞與經封定之樹突細胞上，皆測得可忽略之訊號。實驗結果顯示，該內部封定方法並未減弱活化抗原表現細胞上之膜結合淋巴細胞活化訊號。
為確認內部封定樹突細胞是否可保留活體細胞之生物功能，本實驗將經內部封定之樹突細胞置於試管中，進行T細胞增殖測定。首先將CD8 T細胞自OT-I小鼠分離，並以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)標記。接著將該些細胞與經內部封定、源於骨髓之樹突細胞(BMDCs)或正常源於骨髓之樹突細胞一同培養。將所有細胞共同培養72小時並收成，接著以經異藻藍素
(allophycocyanin)標記之抗鼠CD3抗體染色，再使用流式細胞儀分析所有樣本。經OT-I脈衝處理之正常與封定BMDC皆使OT-I T細胞數量增加，如第七圖上方圖表所示。此結果顯示該封定程序可保留BMDC功能。實施試管內增殖測定時，使用小鼠樹突細胞株JAWSII，並將以CFSE標記之T細胞與正常或內部凝膠化JAWSII細胞共同培養。值得探究的是，該試管內測定結果顯示經脈衝注入OVA之內部封定及未封定JAWSII樹突細胞，皆會引起抗原專一性CD8 OT-I T細胞增殖，如第七圖下方圖表所示。相較於經脈衝注入OVA並封定之樹突細胞，經脈衝注入OVA之正常樹突細胞引起之T細胞增殖程度較高(分別為64.1%與84.4%)，如第七圖下方圖表所示。此一差異可能與第三淋巴細胞活化訊號(細胞介質)有關，此訊號容易釋放自活體細胞，但不存在於經封定細胞中。
另外，為確認內部封定樹突細胞是否可於活體實作時保留自身生物功能，本實驗將經內部封定之樹突細胞置於活體中，進行T細胞增殖測定。首先將CD8 T細胞自基因轉殖OT-I小鼠分離並以CFSE標記，再將該些細胞靜脈注射入小鼠體內。注射後24小時，將經OT-I脈衝處理之活體樹突細胞(已活化)、未經OT-I脈衝處理之活體樹突細胞(未活化)、經內部封定之活化樹突細胞或經內部封定之未活化樹突細胞透過靜脈分別施打於四組不同的小鼠上。再經過三天後，該些小鼠全數犧牲，此時取出其脾臟細胞進行分析。流式細胞儀分析結果顯示，經活化之活體樹突細胞與經內部封定之活化樹突細胞皆具備使抗原專一性CD8+ T細胞增殖的能力，表示該內部封定方法可保留細胞表面抗原之生物功能，如第八圖所示。至於未活化之樹突細胞，無論活體或經封定組別皆不具備使CD8 T細胞增殖的能
力，因此可進一步確認由經封定之活化樹突細胞觸發的T細胞增殖現象，係抗原表現後之結果，如第八圖所示。
將該內部封定技術實施於黏附HeLa細胞之單層上。首先將生長密度約70%之HeLa細胞培養於組織培養皿上，以使細胞黏附於培養皿上。培養步驟完成後，使用凍融膜穿孔法搭配20% PEGDA與1% I-2959，將其中一組培養樣本內部封定。紫外光活化交聯反應後，將該內部封定(凝膠化)之細胞單層置於不同環境下，分別與正常細胞比較，如第九圖左排影像所示。可觀察到該些內部封定細胞保留了長條形態，與磷酸鹽緩衝溶液中的正常細胞形態類似，顯示該內部封定方法可保留該些黏附細胞之類細胞特徵。為呈現該內部凝膠化細胞單層之穩固結構，本實驗將細胞單層置於水中72小時並觀察之，如第九圖右排影像所示。在溶液中的正常細胞，大多數呈現漂浮細胞殘骸狀。脫落的細胞清除後，培養皿上僅存少數細胞。細胞脫落現象發生後，正常細胞大幅流失，而該些內部封定細胞則維持先前密度，形態改變亦不大。該些內部封定細胞之所以穩定，與交聯反應生成之水凝膠骨架帶來的穩固錨定效果有關。實驗結果顯示，該內部封定方法可成功實施於黏附細胞樣本上。該內部凝膠化細胞單層由於結構穩固，亦可成為長期庫存之商品。
另外，本實驗製備內部封定小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)單層。實驗顯示，該細胞單層可使胚胎幹細胞持續生長。首先使用該內部封定技術將MEF單層封定，再將活體小鼠胚胎幹細胞培養於該封定單層
上。培植該些幹細胞24小時後，使用顯微鏡觀察發現明顯的幹細胞球狀體，此結果顯示該些幹細胞始終維持正確形態，即其未分化狀態(未顯示於本實驗資料中)。
本實驗製備源於雞與小鼠、經封定之紅血球細胞(RBCs)。使用凍融法將20% PEGDA與1% I-2959注入該些紅血球細胞內部，再以紫外光照射使交聯劑聚合。使用DiI替細胞膜染色，並透過螢光顯微鏡觀察到成功維持細胞形態，而內部封定後也成功保留膜成分(結果未顯示)，此結果顯示該內部封定技術可廣泛適用於不同的目標細胞。
另外，本實驗也進行血球凝集測定，測定時將內部凝膠化雞紅血球細胞與習知可使紅血球細胞凝集之流感病毒(PR8)混合。該流感病毒不存在時，該些內部凝膠化雞紅血球細胞呈現大幅分散狀，而流感病毒存在時，該些紅血球細胞則顯著凝集，如第十圖所示。該流感病毒成功使內部凝膠化雞紅血球細胞凝集，此結果顯示該細胞表面上仍保有生物分子，而此凝集現象則取決於紅血球細胞表面唾液酸與該流感病毒所載之血球凝集素之間的交互作用。
實驗進一步使用穿透式電子顯微鏡，檢測該流感病毒與該些內部封定雞紅血球細胞的結合情形。仔細觀察樣本後，可清楚發現該些凝膠化雞紅血球細胞皆保留其脂質雙層膜，如第十一圖上排影像所示。該流感病毒存在時，該病毒與該些凝膠化細胞之間產生強烈交互作用，並引起大量病毒結合及細胞凝集反應，此結果類似於病毒與天然雞紅血球細胞之
交互作用，如第十一圖下排影像所示。凝集成團之內部凝膠化紅血球細胞，可作為病毒偵測指標。此外，可繼續將該些內部凝膠化紅血球細胞自該混合物分離，以進行病毒分離。
本實驗實施一雙重乳化程序，將PLGA與磺酸基-Cy5(sulfo-Cy5，紅色)混合以合成基於PLGA之微粒。在實驗中，該親水性sulfo-Cy5染劑係作為一模式被運送物質，藉此呈現成功包覆被運送物質之結果。以聚離胺酸(poly-L-lysine)包覆微粒後，再將該些被包覆之微粒與內部封定細胞混合，並使用羰花青膜染劑DiO(綠色)染色之，最後使用共軛焦顯微鏡取得該混合物影像。結果顯示，該些內部封定細胞成功附著於該些微粒上(結果未顯示)。整體而言，以上結果突顯了將內部封定囊泡與另一化合物或藥物傳輸劑型結合之可行性。
本說明書揭露之所有技術特徵，皆可以任何方式進行組合。本說明書揭露之各項特徵，皆可以具備相同、相等或類似目的之其他特徵取代。因此，除非另外說明，本說明書揭露之各項特徵僅為一系列相等或相似特徵中之其中一例。
根據上述說明，本發明所屬技術領域之通常知識者可輕易驗證前述實施例所包含之關鍵特性，且可在不超出前述實施例範圍與精神之
情況下，對其內容進行各種改變及修飾，以使其能應付各式用途與條件。因此，其他實施例亦包含於本發明之申請專利範圍內。
Claims (21)
- 一種生成一內部封定脂質體的方法，包含：提供一前驅脂質體，其具備包覆於一脂質膜內之一水性內壁，其中該前驅脂質體之該脂質膜對一交聯劑不具通透性；使該脂質膜短暫地具備通透性，以生成一具通透性之囊泡；使該具通透性之囊泡與一不具活性但可活化之交聯劑接觸，該不具活性但可活化之交聯劑藉此進入該具通透性之囊泡中；使該具通透性之囊泡回復成一不具通透性之囊泡；清除任何囊泡外之交聯劑；及活化該不具活性但可活化之交聯劑，使該不具通透性之囊泡中產生交聯反應，以生成一內部封定之脂質體。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該前驅脂質體為一細胞或一病毒。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該細胞為一哺乳動物細胞或一非哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該細胞為一人類細胞、一非人類細胞、一細菌細胞、一真菌細胞、一不朽化細胞、一基因改造細胞、一人造細胞、一免疫細胞、一上皮細胞、一肝細胞、一脂肪細胞、一腎細胞、一纖維母細胞、一軟骨細胞、一肌肉細胞、一血球細胞、一骨細胞、一分泌細胞、一幹細胞、一耳毛細胞、一腦細胞、一神經細胞、一肺細胞或一癌細胞。
- 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之方法，其中該不具活性但可 活化之交聯劑為一光反應交聯劑、一熱反應交聯劑或一化學反應交聯劑。
- 如申請專利範圍第1~4項中任一項所述之方法，其中使該前驅脂質體具備通透性之步驟係藉由對該前驅脂質體施加凍融法(freezing and thawing)、滲透壓衝擊法(osmotic shock)、超音波穿孔法(sonoporation)、電穿孔法(electroporation)、雷射、基於界面活性劑之穿孔法或剪切。
- 一種藉由一方法生成之內部封定脂質體，該方法包含：(i)提供一前驅脂質體，其具備包覆於一脂質膜內之一水性內壁，其中該前驅脂質體之該脂質膜對一交聯劑不具通透性；(ii)使該前驅脂質體短暫地具備通透性，以生成一具通透性之囊泡；(iii)使該具通透性之囊泡與一不具活性但可活化之交聯劑接觸，該不具活性但可活化之交聯劑藉此進入該具通透性之囊泡中；(iv)使該具通透性之囊泡回復成一不具通透性之囊泡；(v)清除任何囊泡外交聯劑；及(vi)活化該不具活性但可活化之交聯劑，使該不具通透性之囊泡中產生交聯反應，以生成一內部封定之脂質體；其中該內部封定之脂質體具有一脂質膜，該內部封定之脂質體之該脂質膜在一或多個特性上與該前驅脂質體之該脂質膜實質相同。
- 如申請專利範圍第7項所述之內部封定脂質體，其中該一或多個特性係選自由對界面活性劑之敏感性、膜流動性、膜蛋白流動性、膜通透 性、膜成分、表面電荷及生物功能所組成之群組。
- 如申請專利範圍第7或第8項所述之內部封定脂質體，其中該前驅脂質體為一細胞。
- 如申請專利範圍第9項所述之內部封定脂質體，其中該細胞具有一內源、一外源或一經基因改造之一細胞表面蛋白或一聚醣。
- 如申請專利範圍第9項所述之內部封定脂質體，其中該細胞為一抗原呈現細胞。
- 如申請專利範圍第11項所述之內部封定脂質體，其中該細胞為一癌細胞或一樹突細胞。
- 如申請專利範圍第9項所述之內部封定脂質體，其中該細胞為一經培養之餵養細胞。
- 如申請專利範圍第13項所述之內部封定脂質體，其中該細胞為一小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast)、JK1餵養細胞或SNL 76/7餵養細胞。
- 如申請專利範圍第9項所述之內部封定脂質體，其中該細胞具有能與一藥物或一候選藥物結合之一細胞表面受體。
- 如申請專利範圍第9項所述之內部封定脂質體，其中該細胞具有能與一病原體結合之一細胞表面受體。
- 如申請專利範圍第16項所述之內部封定脂質體，其中該細胞為一紅血球細胞、一免疫細胞或一血小板。
- 一種調節免疫反應的方法，包含：提供如申請專利範圍第11項所述之該內部封定脂質體；及 使該內部封定脂質體與一抗原反應細胞接觸。
- 一種培養目標細胞的方法，包含：提供一單層之如申請專利範圍第13項所述之該內部封定脂質體；及共同培養該單層與一目標細胞。
- 一種分析藥物或候選藥物的方法，包含：提供如申請專利範圍第15項所述之該內部封定脂質體；使該內部封定脂質體與一藥物或一候選藥物接觸；及分析經接觸後之該內部封定脂質體。
- 一種結合病原體的方法，包含：提供如申請專利範圍第16項所述之該內部封定脂質體；及使該內部封定脂質體與含有或疑似含有一病原體之一樣本接觸。
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