CN109706260A - 火龙果果实不同发育时期内参基因的筛选与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与火龙果果实不同发育时期相关的内参基因与应用，所述内参基因为TBP2和YLS8；其中所述内参基因TBP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，内参基因YLS8的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从火龙果转录组数据及前人研究中筛选出较稳定的17个候选内参基因，利用qRT‑PCR技术，通过geNorm和NormFinder软件进行基因稳定性评估，得出TBP2和YLS8是在火龙果果实发育过程中稳定表达的内参基因。本发明提供的内参基因组合为火龙果色素代谢及果实发育中关键基因的研究提供有力的支持，同时为选育优良果质有重要的指导意义。

Description

火龙果果实不同发育时期内参基因的筛选与应用

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种与火龙果果实不同发育期相关的内参基因与应用。

背景技术：

火龙果(Hylocereus undatus)属仙人掌科(Cactaceae)三角柱属(Hylocereus)。根据火龙果果皮果肉颜色可分为红皮白肉、红皮红肉、黄皮白肉，其中火龙果的红皮和红肉含大量的天然色素，甜菜色素的含量是火龙果呈色的关键因素，目前已有很多研究将火龙果作为原料来提取其中的色素，参与调控甜菜色素代谢途径相关基因表达水平研究并运用分子生物学方法研究火龙果甜菜色素代谢途径及其调控机理已成为热点。

实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescence quantitative PCR)技术是在PCR反应体系中加入特定荧光基团，对产物变化进行实时监测，实现对目标基因(target gene)定性定量表达分析，具有特异性强、灵敏性高、简单高效等优点，因此在基因表达分析方面被广泛应用。但分析过程中易受到RNA完整性、反转录cDNA质量、引物特异性和PCR扩增效率等因素影响，PCR扩增过程中通常使用内参基因对目标基因表达量进行校正，使表达数据更为标准化。近年来大量研究表明，内参基因的表达具有特异性，适用于同一物种的不同发育时期以及不同培养条件下能始终稳定表达的内参基因并不存在，不加以筛选盲目以一种看家基因作为任意实验条件下的内参，容易得到精确度低甚至错误的结果。因此，内参基因的筛选和评估对获得精准荧光定量PCR实验结果是非常重要的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题：

筛选出火龙果果实不同发育时期稳定表达的内参基因，克服传统看家基因的缺点和不足，更精确的验证基因表达水平，为火龙果色素代谢及果实发育中关键基因的挖掘奠定基础。

本发明的技术方案：

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案实现：

火龙果果实不同发育时期的内参基因，所述内参基因为TBP2和YLS8，其中内参基因TBP2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，内参基因YLS8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的火龙果果实不同发育时期内参基因，其中内参基因TBP2特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，内参基因YLS8特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

基因TBP2特异性引物：

TBP2-F：5'-ATAAAGGAAGGGAGGGAGAC-3'

TBP2-R：5'-ATGATTACAGCAGCGAAACG-3'；

基因YLS8特异性引物：

YLS8-F：5'-GCTCGGTTATGTCCACAAGGTA-3'

YLS8-R：5'-CGGAAGAAGAGCGTCTCGTTA-3'。

本发明所述的内参基因TBP2和YLS8在qRT-PCR中的应用，火龙果色素基因表达水平的实验采用内参基因定量，所述TBP2和YLS8基因作为荧光定量PCR内参基因使用。

本发明内参基因筛选步骤：

(1)从火龙果转录组测序结果及前人研究基础中筛选出较稳定的17条序列作为候选内参基因。

(2)选取火龙果不同发育时期的果实，利用高质量的RNA逆转录成相同浓度的cDNA，再通过qRT-PCR检测候选内参基因的表达量。

(3)根据火龙果果实不同发育时期的表达水平，通过geNorm和NormFinder软件对各候选内参基因稳定性评估，最后综合两种算法的结果，通过等权重重新排序。

本发明与现有技术不同之处在于：

本发明从17个候选内参基因中筛选出2个内参基因组合比现有研究使用1个内参基因校正造成的实验误差低得多；由于内参基因不存在绝对的稳定性，同一物种不同实验条件、不同发育时期、不同部位等表达量差异较大，为提高实验的精准度，本发明更加全面系统的筛选火龙果果实不同发育时期的内参基因。

3)本发明具有下列优点和积极效果：

(1)本发明从17个候选内参基因中筛选出火龙果果实发育不同时期最稳定的内参基因，数据真实可靠，为后期深入挖掘果实功能基因奠定基础。

(2)筛选出的内参基因适用于火龙果果实发育过程中关键基因的表达分析，能显著提高所得数据的精准性，应用广泛、灵敏度高、稳定性好。

(3)本研究经过严格的筛选内参基因程序，确定了适用于火龙果果实不同发育时期稳定的内参基因，明确了看家基因并不是理想的内参基因。

附图说明

图1火龙果17种候选内参基因的PCR扩增产物：其中M:DL2000 Marker；1:TBP2；2:ACT；3:DNJH；4:G3P；5:UBC；6:GUN25；7:FK111；8:CYP1；9:RH2；10:YLS8；11:PTBP1；12:RDR6；13:2AAG；14:TBB；15:TBA3；16:Q8H3I3；17:Q9SKN1；

图2 GeNorm软件分析的火龙果17个候选内参基因表达稳定值(M)：M值越小，基因稳定性越高；

图3 GeNorm软件分析火龙果内参基因配对变异系数：本研究V_2/3为0.105，小于0.15，所以不必引入第3个基因进行校正，内参基因最适数目为2个，即YLS8和ACT；

图4 NormFinder软件分析火龙果17个候选内参基因的表达稳定值：其中基因TBP2和YLS8最稳定；

图5以内参基因YLS8和TBP2检测不同发育时期中火龙果色素代谢途径关键基因HpCytP450-like1的表达水平。

具体实施方式

实施例1：火龙果果实不同发育时期中最稳定内参基因的筛选，包括如下步骤:

1、实验材料：取红肉火龙果品种—紫红龙，白肉火龙果品种—晶红龙，采自贵州省罗甸火龙果种植基地(兴成果园)。人工授粉后第25d、30d、35d、40d采果肉样品，依次为红肉果实的着色前期(H1)、破色期(H2)、着色期(H3)、成熟期(H4)及同时期白肉B1、B2、B3、B4，每次取3个样本，每个样本设3个生物学重复，参照Cheng等方法取样，液氮速冻后存于-80℃超低温冰箱。

2、总RNA提取：将火龙果不同时期材料按照总RNA提取试剂盒(天根)说明书步骤提取总RNA。

3、cDNA合成：采用反转录试剂盒(TakaRa)，按照说明书将步骤2的总RNA反转录成cDNA，RNA用量为1μg，反转录产物5倍稀释后-20℃保存。从火龙果转录组数据及前人研究中筛选出较稳定的17条序列，引物合成于上海生工(PAGE纯化法)，实时荧光定量PCR特异性引物如表1所示，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测17个候选内参基因PCR扩增产物(图1)。

表1本发明中火龙果17个候选内参基因的基因名、功能注释、引物序列、扩增长度、PCR扩增序列、回归系数。

4、实时荧光定量PCR：在荧光定量PCR仪(CFXconnect)运行。实验体系为:5μL荧光染料Select Master Mix，10μmol/L的上下游引物各0.25μL，cDNA模版1μL(反应转录起始RNA用量为1μg，cDNA产物100倍稀释)，3.5μL超纯水。实验条件采用两步法：94℃预变性10min，94℃变性15s，退火30s，延伸1min，进行40个循环，65～95℃每0.5℃进行1次荧光监测测定熔解曲线，每个样品设三个重复。反应后的熔解曲线均为单一信号峰，表明17对引物均能特异性扩增出目的基因产物，qRT-PCR反应专一性高，结果是准确可信的。

5、采用geNorm软件计算各内参基因的稳定值(图2)及配对变异系数(图3)和NormFinder软件计算各内参基因的稳定值(图4)，将17个候选内参基因的原始Cq值根据公式(Q＝2^{Cqmax–Cqsample}，Q代表相对表达量，Cq_max为依次从各候选内参基因中选出的各样品中的最大Cq值，Cq_sample为该候选内参基因的各样品Cq值)转换成相对表达量Q，然后将其输入到软件中进行计算，最终综合两种算法的结果，通过等权重重新排序(表2)选取TBP2和YLS8作为火龙果果实不同发育时期理想的内参基因。

本发明中火龙果17个候选内参基因M值及geNorm、Normfinder排名次序和综合排名。

6、内参基因稳定性验证：本研究以内参基因YLS8和TBP2分别对CytP450-like1进行验证，发现火龙果中CytP450-like1基因的表达和甜菜色素含量成正比；以二者共同为内参基因时在火龙果不同发育时期表达规律基本一致(图5)。

以上结果表明：YLS8和TBP2可作为理想的内参基因用于火龙果果实不同发育时期关键基因的表达研究。

序列表

<110> 贵州大学

<120>火龙果果实不同发育时期内参基因的筛选与应用

<160> 6

<210> 1

<211>1286

<212> DNA

<213>TBP2

<400> 1

CGACCTCTCA TTCCCAGCAA CCCCCTCTTC TCTCTCTCTC TCCTCTGATA TAATCCTCTC 60

TCCTATCTCC GTCATATAAG ACCTCCATCC TTCAAATTTC TCATCTCCAT CTCATATAAA 120

ACACTAGCCT TTTCAATTTC TTCGCGCTTG TTGCCTCAAA TCCAACACTT GTGATTGAAG 180

AGCATAAAGG AAGGGAGGGA GACGGTTCCG GATAGAGAAC AATGGCAGAA CAAGCCATGG 240

AAGGAAGCCA GCCCGTGGAT CTGGCCAAGC ACCCATCTGG GATCGTCCCT ACGCTCCAGA 300

ATATTGTCTC AACGGTCAAC TTGGACTGCA AGTTGGATCT CAAAGCCATT GCATTGCAAG 360

CTCGTAACGC AGAGTATAAT CCCAAGCGTT TCGCTGCTGT AATCATGAGG ATAAGGGAGC 420

CAAAGACGAC TGCGTTGATA TTTGCCTCCG GGAAAATGGT CTGCACTGGA GCTAAGAGCG 480

AGCATCAGTC GAAACTGGCT GCTCGTAAGT ATGCGCGCAT CATTCAGAAG CTGGGTTTCC 540

CTGCCAAATT TAAGGATTTT AAAATCCAGA ATATAGTAGG ATCTTGTGAT GTCAAGTTTC 600

CTATACGACT GGAGGGGCTT GCATACTCCC ATGGTGCTTT CTCTAGCTAT GAACCGGAAC 660

TATTTCCTGG CTTAATTTAC CGAATGAAGC AGCCCAAGAT TGTGCTACTC ATATTTGTAT 720

CGGGCAAGAT TGTTCTTACA GGAGCTAAGG TGAGGGAAGA GACCTATACT GCCTTTGAGA 780

ACATATATCC AGTGCTCACT GAGTTCAGGA AAAACCAGCA ATGATTTGTG GGAGGAGTTG 840

CTGAAGATGT GTGCCCTCCA GGAGCTTGAT GCCCTTTCAT CGTGTGAACT GTAAATAGAT 900

GAAAGGAGAT AAAGATATAA GGCGCTTGCC CTGCCGTTTG GATTGAATTT ATGTACTAGC 960

GTTGTATGCC TATGCCTAGT TGTGGGGACT GGATCATGTA TGACCTGGCC GAAACACGAT 1020

CGTCTAAGTC GCTGACTCAA ATGACCATCT AAAAATTTTG AAAGACTATT CGATTGTCTG 1080

CTGATTGTAG GTTGCCTCAA TTTAAACTTC AAACCTAATT TTTGCTGTTA ATTTTAGCCT 1140

TTGCTGACGA TGTGTTCCTT CCATATTTCA CAAAAGACGA AAACAGAGTT ATTGACTTGT 1200

CTTCCCGTTT GCAAATCACA ATGTTTCTCT TGTTTGCAAC TGTCTTTCAA TATTTGTTCC 1260

GTGTTCTTCT TAGTGATGGT TTCCGG 1286

<210> 2

<211>1005

<212> DNA

<213>YLS8

<400> 2

ATGGAGGCCA ATTTAACCGA AGTTCCCTGA AACAATTTCG TCAGATATTT TGCGCCTTCC 60

TGTATCGGCT GCTGGTGAGT TGATCGCAGG CAGGCGGGCG AGAGAGGGAG AGAGAGAGAG 120

AGGATGTCGT ACCTGCTGCC GCACTTGCAC TCAGGATGGG CTGTGGATCA GGCCATCCTC 180

GCCGAAGAAG AGCGTCTCGT TATCATACGC TTCGGCCATG ACTGGGACGA AACTTGCATG 240

CAGATGGATG AAGTATTGGC CTCCGTTGCA GAGACAATAA AGAACTTTGC TGTGATATAC 300

CTTGTGGACA TAACCGAGGT TCCTGATTTC AACACAATGT ACGAGCTGTA TGATCCTTCA 360

ACTGTTATGT TCTTTTTCAG GAACAAGCAC ATAATGATAG ATCTTGGTAC CGGTAACAAC 420

AACAAGATCA ATTGGGCATT GAAGGACAAG CAGGAGTTCA TAGACATTGT TGAGACTGTC 480

TATCGTGGAG CACGAAAGGG TCGAGGTCTT GTGATTGCAC CAAAAGATTA CTCGACCAAG 540

TACCGCTACT AAGCCCCTGT AGGTCATGCT GCTGGTAAAT TCATACCGTT CAGGTTGAGG 600

CGAAGCACTG ATCTTGTTTA ACCTATATCA AACTGCAACT CTCATCACAA GTGTAATGTT 660

AAATTTGATA AGCTGCTTGC CTATGCTTAG TTTGGGGTAT CTGGCAAAAA AATTCATGTT 720

CAGAACAGTG TTGTACTTTT ATTGATTTGA AGGTTGTGTC TTCAATGAAG GAAACGGTTT 780

TCTTAGCTTC TATTATGGCT TACTGGTAAA CCATTGTCAG TTTTCAAGGC GCACGTGGTG 840

GTGGTATGTC TATAATTCAT CAATCTCAAG CTTTATAACC AGGTGTGTTT GAAATCAGGC 900

TTTGTATTTC TTGAAGCATT TTGCATCAAA CTCCAACCTG AAAGCCTATG AGGGTGAGAC 960

TGCTTGAGAA GGTCTTAGAA GCCTTTTACT TTGAGACGAA CTTGC 1005

<210> 3

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

ATAAAGGAAGGGAGGGAGAC

<210> 4

<211>20

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 4

ATGATTACAGCAGCGAAACG

<210> 5

<211>22

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 5

GCTCGGTTATGTCCACAAGGTA

<210> 6

<211>22

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 6

CGGAAGAAGAGCGTCTCGTTA

Claims (3)

1.火龙果果实不同发育时期的内参基因，其特征在于：所述的内参基因为TBP2和YLS8，所述内参基因TBP2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述内参基因YLS8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的火龙果果实不同发育时期的内参基因，其特征在于：合成所述内参基因TBP2的特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；合成所述内参基因YLS8的特异性引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求1或2所述的内参基因在火龙果色素相关基因qRT-PCR检测中的应用。