CN109699498A

CN109699498A - 一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法

Info

Publication number: CN109699498A
Application number: CN201910180134.9A
Authority: CN
Inventors: 王跃华; 陈芳; 黄鹏; 马涛; 唐婕; 杜媛; 占洋; 李航宇; 石鑫; 王兰; 彭轶妮
Original assignee: Tianquan County Tongchuang Heavy Building Planting Farmers'specialized Cooperatives; Chengdu University
Current assignee: Tianquan County Tongchuang Heavy Building Planting Farmers'specialized Cooperatives; Chengdu University
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109699498B

Abstract

本发明公开了一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法，该方法包括如下步骤：外植体的选取和预培养→愈伤组织的诱导培养→愈伤组织的增殖培养。本发明采用杜鹃兰幼嫩花葶为外植体，通过愈伤组织诱导培养和增殖培养，可快速获得大量质地优良的杜鹃兰愈伤组织，从而可有效解决当前杜鹃兰植物资源和药材资源短缺的问题。

Description

一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法

技术领域

本发明涉及一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法，特别是涉及一种以杜鹃兰花葶为外植体的杜鹃兰愈伤组织的培养方法。

背景技术

杜鹃兰是兰科草本植物，主要分布于四川、云南、贵州等长江以南各省区,其假鳞茎为药材山慈菇。目前从山慈菇药材中分离出菲类、联苄类、苷类、木脂素类和黄烷类等60多个化合物。山慈菇味甘、微辛、寒，有小毒，入肝脾经，有消肿散结、化痰、清热、解毒之功效，所含秋水仙碱及其加入稀氨溶液后的合成物秋水仙碱，均有与长春碱相似的抗肿瘤作用，广泛应用于抗肿瘤药物之中；同时秋水仙碱还有镇静催眠协同作用。

长期以来，由于山慈菇独特的药用价值,使得杜鹃兰药用植物的需求量日趋增大；然而，杜鹃兰作为兰科植物，其种子在成熟过程中缺乏胚乳，致使种子在自然界很难萌发。当前，杜鹃兰植物采用的分株繁殖也存在生产成本高、栽种规模很难扩大的问题。何明高的《海南兰科植物种子生物学初步研究》中写到：“有的兰科种子萌发过程需要的时间长达几年，有的兰科植物种子只能保存较短时间，通常条件只能存活几个月到两年左右。”并且杜鹃兰自然储量稀少，片面追求经济效益的人们滥挖滥采，使得野生杜鹃兰的生存状态恶化,数量急剧减少。为保护杜鹃兰这一珍稀的物种资源，同时满足药材市场对山慈菇的巨大需求，必须要解决杜鹃兰种子快速萌发的技术瓶颈问题。

利用组织培养技术生产药用植物具有生长周期短，繁殖率高、能有效降低灾害性气候对植物生长的不利影响等优点，可进行周年培养生产，且培养条件优越，对植物生长极为有利；因此应用组织培养方法进行杜鹃兰植物的快速繁殖是解决当前山慈菇药材短缺和更好地保护其野生植物资源的有效方法。

目前还未见以杜鹃兰花葶为外植体成功诱导出愈伤组织的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法，该方法能成功诱导出杜鹃兰愈伤组织，并实现愈伤组织的快速增殖，以缓解当前山慈菇(杜鹃兰)药材资源紧缺的问题。

为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成：

(1)外植体的选取和预培养：选取杜鹃兰植物上幼嫩的花葶，清洗干净后，剪去其上的花蕾，将剪去花蕾的花葶作为外植体，将外植体消毒后接入MS0预培养基中，在温度为15～22℃及无光照的条件下进行3～7天的预培养；

(2)愈伤组织的诱导培养：将预培养后的外植体以插入的方式接入愈伤组织诱导培养基B5+KT0.1～1.0mg·L^-1+NAA0.5～1.5mg·L^-1+2,4-D1～1.5mg·L^-1+硫脲50～150mg·L^-1+活性炭0.1～0.5％中，在温度为18～28℃、每天光照4～10小时、光照强度为800～2000lx的条件下进行愈伤组织诱导培养；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取质地紧密、颜色为浅绿色的愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA0.1～1.0mg·L^-1+NAA0.1～0.5mg·L^-1+2,4-D1～3mg·L^-1+柠檬酸100～300mg·L^-1中，在温度为18～28℃、每天光照8～18小时、光照强度为1000～3000lx的条件下进行愈伤组织增殖培养；

上述所有培养基的pH值为5.6～6.5、蔗糖30～50g·L^-1、琼脂为6.0～7.0g·L^-1。

进一步地，步骤(1)中所述幼嫩的花葶是指其上花蕾还未开放的花葶，花葶采用浓度为2～5％的消洗灵清洗。

进一步地，步骤(1)中所述消毒是指将外植体用浓度为0.1～0.2％的升汞消毒4～12min，再用无菌水冲洗3～6次，最后用已灭菌的滤纸吸干其上的水分。

本发明采用杜鹃兰幼嫩花葶为外植体，通过愈伤组织诱导培养和增殖培养，可快速获得大量质地优良的杜鹃兰愈伤组织，从而可有效解决当前杜鹃兰植物资源和药材资源短缺的问题。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的杜鹃兰愈伤组织的培养方法包括如下步骤：

(1)外植体的选取和预培养：选取杜鹃兰植物上未开花的幼嫩花葶，用浓度为2％的消洗灵洗干净后，剪去其上的花蕾，将剪去花蕾的花葶作为外植体，将外植体放在超净工作台上，用浓度为0.1％的升汞消毒4min，再用无菌水冲洗3次，然后用已灭菌的滤纸吸干其上的水分后接入MS0预培养基中，在温度为15℃及无光照的条件下预培养3天；

(2)愈伤组织的诱导培养：将预培养后的外植体以插入的方式接入愈伤组织诱导培养基B5+KT0.1mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+2,4-D1.0mg·L^-1+硫脲50mg·L^-1+活性炭0.1％中，在温度为18℃、每天光照4小时、光照强度为800lx的条件下进行愈伤组织诱导培养；7天后产生白色的愈伤组织，随着生长时间延长白色愈伤组织逐渐变为浅绿色，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为69.67％；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取质地紧密、颜色为浅绿色的团块状愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA0.1mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+2,4-D1.0mg·L^-1+柠檬酸100mg·L^-1中，在温度为18℃、每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行愈伤组织增殖培养，培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为2.87；

上述所有培养基的pH值为5.6、蔗糖30g·L^-1、琼脂为6.0g·L^-1。

实施例2

本实施例提供的杜鹃兰愈伤组织的培养方法包括如下步骤：

(1)外植体的选取和预培养：选取杜鹃兰植物上未开花的幼嫩花葶，用浓度为3.5％的消洗灵洗干净后，剪去其上的花蕾，将剪去花蕾的花葶作为外植体，将外植体放在超净工作台上，用浓度为0.15％的升汞消毒8min，再用无菌水冲洗5次，然后用已灭菌的滤纸吸干其上的水分后接入MS0预培养基中，在温度为18℃及无光照的条件下预培养5天；

(2)愈伤组织的诱导培养：将预培养后的外植体以插入的方式接入愈伤组织诱导培养基B5+KT0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1+2,4-D1.2mg·L^-1+硫脲100mg·L^-1+活性炭0.3％中，在温度为24℃、每天光照8小时、光照强度为1400lx的条件下进行愈伤组织诱导培养；7天后产生白色的愈伤组织，随着生长时间延长白色愈伤组织逐渐变为浅绿色，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为81.4％；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取质地紧密、颜色为浅绿色的团块状愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA0.5mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+2,4-D2.0mg·L^-1+柠檬酸200mg·L^-1中，在温度为22℃、每天光照12小时、光照强度为2000lx的条件下进行愈伤组织增殖培养，培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为3.69；

上述所有培养基的pH值为6.0、蔗糖40g·L^-1、琼脂为6.5g·L^-1。

实施例3

本实施例提供的杜鹃兰愈伤组织的培养方法包括如下步骤：

(1)外植体的选取和预培养：选取杜鹃兰植物上未开花的幼嫩花葶，用浓度为5％的消洗灵洗干净后，剪去其上的花蕾，将剪去花蕾的花葶作为外植体，将外植体放在超净工作台上，用浓度为0.2％的升汞消毒12min，再用无菌水冲洗6次，然后用已灭菌的滤纸吸干其上的水分后接入MS0预培养基中，在温度为22℃及无光照的条件下预培养7天；

(2)愈伤组织的诱导培养：将预培养后的外植体以插入的方式接入愈伤组织诱导培养基B5+KT1.0mg·L^-1+NAA1.5mg·L^-1+2,4-D1.5mg·L^-1+硫脲150mg·L^-1+活性炭0.5％中，在温度为28℃、每天光照10小时、光照强度为2000lx的条件下进行愈伤组织诱导培养；7天后产生白色的愈伤组织，随着生长时间延长白色愈伤组织逐渐变为浅绿色，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为84.1％；

(3)愈伤组织的增殖培养：选取质地紧密、颜色为浅绿色的团块状愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1+2,4-D3.0mg·L^-1+柠檬酸300mg·L^-1中，在温度为28℃、每天光照18小时，光照强度为3000lx的条件下进行愈伤组织增殖培养，培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为3.01；

上述所有培养基的pH值为6.5、蔗糖50g·L^-1、琼脂为7.0g·L^-1。

实施例4

在实施例2步骤(1)中，将花葶外植体的预培养时间改为3天，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为77.1％。

实施例5

在实施例2步骤(1)中，将花葶外植体的预培养时间改为7天，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为79.7％。

实施例6

在实施例2步骤(2)中，将愈伤组织诱导培养基改为B5+KT0.1mg·L^-1+NAA1.5mg·L^-1+2,4-D1.5mg·L^-1+硫脲150mg·L^-1+活性炭0.5％，其它步骤条件同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为73.6％。

实施例7

在实施例2步骤(3)中，将愈伤组织增殖培养基改为1/2MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+2,4-D1mg·L^-1+柠檬酸300mg·L^-1，其它步骤同实施例2，培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为2.75。

比较实施例1

在实施例2步骤(1)中，改选花全部开放的花葶作为外植体，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为0％。

比较实施例2

在实施例2步骤(1)中，改选没有去掉花蕾的幼嫩花葶作为外植体，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为0％,且外植体出现褐化。

比较实施例3

在实施例2步骤(1)中，取消将花葶外植体接入MS0培养基中进行预培养的步骤，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率仅为9.20％。

比较实施例4

在实施例2步骤(2)中，将预培养后的花葶外植体改为平放在培养基表面的接种方式，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率仅为12％。

比较实施例5

在实施例2步骤(2)中，将愈伤组织诱导培养基改为MS+KT0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1+2,4-D1.2mg·L^-1+硫脲100mg·L^-1+活性炭0.3％，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为23.16％。

比较实施例6

在实施例2步骤(2)中，将愈伤组织诱导培养基改为B5+6-BA0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1+活性炭0.3％，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为11.78％。

比较实施例7

在实施例2步骤(2)中，将愈伤组织诱导培养基改为B5+KT0.5mg·L^-1+NAA1.0mg·L^-1+活性炭0.3％，其它步骤同实施例2，培养30天后统计其愈伤组织的诱导率为19.81％。

比较实施例8

在实施例2步骤(3)中，将愈伤组织增殖培养基改为1/2MS+6-BA0.5mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1+2,4-D 2mg·L^-1，其它步骤条件同实施例2，增殖培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为1.45。

比较实施例9

在实施例2步骤(3)中，将增殖培养条件改为温度14℃、每天光照5小时、光照强度为500lx，其它步骤同实施例2，增殖培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为1.35倍。

比较实施例10

在实施例2步骤(3)中，将增殖培养条件改为温度35℃、每天光照24小时、光照强度为3500lx，其它步骤同实施例2，增殖培养30天后统计愈伤组织的增殖倍数为1.09。

Claims

1.一种杜鹃兰愈伤组织的培养方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的杜鹃兰愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述幼嫩的花葶是指其上花蕾还未开放的花葶，花葶采用浓度为2～5％的消洗灵清洗。

3.根据权利要求1或2所述的杜鹃兰愈伤组织的培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述消毒是指将外植体用浓度为0.1～0.2％的升汞消毒4～12min，再用无菌水冲洗3～6次，最后用已灭菌的滤纸吸干其上的水分。