CN109694844A - 一种用于培养肝细胞的完全培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于培养肝细胞的完全培养基，所述完全培养基组分包括基础培养基和混合血清。其中所述混合血清由门静脉血清和胎牛血清组成。本发明所提供的完全培养基可以应用于培养肝癌细胞系HepG2，还可以提升肝细胞的色素代谢酶表达。本发明能够在保证肝细胞正常的生长和肝细胞存活的前提下，提升肝细胞的代谢酶基因表达水平。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种用于培养肝细胞并提升酶基因表达的完全培养基。
背景技术
药物研发以及药物测试的过程中，药物安全性评价是较为重要的一个环节，其中包括生物化学分析、细胞学实验、毒理学实验、动物实验和人体临床实验等。前期如果在细胞水平上就能较好地模拟体内代谢物，将减轻后期动物实验和人体临床实验失败的风险。
药物在生物体内的代谢器官主要是肝脏，执行代谢功能的最小单位是肝细胞。在生物化学水平上研究体内药物的代谢，主要涉及两个过程：I相代谢和II相代谢。具体地，I相代谢是指，药物在I相药物代谢酶的催化下，药物分子在肝细胞内发生如氧化、去甲基化、水解等反应，生成极性增大、水溶性提高的I相代谢物。II相代谢是指，I相代谢物在II相代谢酶的催化下，进一步地与细胞内源物质结合，所生成的II相代谢物的极性、水溶性进一步提高，便于排出体外。I相代谢酶主要有细胞色素P450(CYPS)、ALDH等；I相代谢酶主要有葡萄糖酵酸转移酶(UGTS)等。
换而言之，衡量体外培养的肝细胞能否达到体内环境肝细胞的药物代谢能力，可以I相代谢和II相代谢的相关反应物和代谢物的变化量作为指标，也可以以I相代谢和II相代谢的相关反应酶的活性作为指标。更进一步，I相代谢和II相代谢相关基因的表达水平也可以作为衡量肝细胞药物代谢能力的指标。当体外培养肝细胞达到体内培养肝细胞的I相代谢和II相代谢对应基因的表达水平，则体外的肝细胞药物代谢实验可以更加客观可靠地反映同种药物在体内肝细胞的代谢状况。
在进行体外细胞培养的过程中，影响细胞生长和代谢酶对应基因表达的因素有很多，其中比较重要的影响因素是细胞培养的基础——细胞培养基。就目前的体外肝细胞培养，一般采用基础培养基混合占比10％-15％的胎牛血清。在混合了血清的基础培养基上的生长状态还是远不如在细胞在体内的生长状态，体外细胞中代谢酶的基因表达水平也不及体内细胞代谢酶的基因表达水平。受限于此，在进行细胞培养和药物测试的过程中，难以还原生物体内的细胞的自然状态，因此细胞学实验的效果将大打折扣，不能最大程度地模拟在体内药物与细胞的代谢。
体外细胞培养不能很好地还原体内的细胞环境，也不能提升体外细胞的对应代谢酶在基因水平上表达其中一个重要原因就是细胞培养基。经不同培养基培养的肝细胞或其他细胞在基因表达的水平上存在差异，特别是传代细胞与原代细胞之间的差异则更为明显，而这一差异直接影响到细胞的药物代谢水平，进一步影响细胞实验的结果精确性与可靠性。因此，研究出一种能够提升细胞基因表达的水平与体内一致或较大程度接近的细胞培养基显得尤为必要。
发明内容
本发明旨在提供一种用于培养肝细胞的完全培养基，至少部分能够克服上述技术缺陷，所述完全培养基至少具有以下特点：
1.本发明所涉及的一种用于培养肝细胞的完全培养基能满足细胞生长的基本营养要求，并使所培养的肝细胞代谢能力增强
2.一种用于培养肝细胞的完全培养基能诱导细胞的基因表达水平提升，所述基因包括但不限于细胞色素代谢酶、肝细胞白蛋白(ALB)、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因；
3.本发明的所述完全培养基能够使体外培养的细胞较高程度地还原体内生长的环境；
4.本发明的所述完全培养基在保证培养效果的前提下，节省成本；
5.本发明的所述完全培养基具有工业化和商业化的前景，能够批量生产。
为了达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种用于培养肝细胞的完全培养基，所述完全培养基组分包括基础培养基和混合血清。其中所述混合血清由门静脉血清和胎牛血清组成。
优选地，所述门静脉血清采用至少一种哺乳类动物门静脉血清。
更优选地，所述门静脉血清的制备方法包括以下步骤：
(1)收集新鲜的门静脉血液；
(2)将所述门静脉血液离心，取下层清液；
(3)在50℃-60℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
(4)过滤所述灭活清液，收集得门静脉血清。
进一步优选地，所述门静脉血液离心的时间为12min或以上。
进一步优选地，将所述门静脉血液以2000xg-5000xg的离心力进行离心。
进一步优选地，所述加热下层清液的时间为30min或以上。
进一步优选地，所述加热下层清液的温度为56℃。
进一步优选地，过滤所述灭活清液，采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜。
更优选地，所述哺乳类动物门静脉血清采用猪门静脉血清。
优选地，按照体积比计算，所述混合血清至少占所述完全培养基的10％。
优选地，按照体积比计算，所述门静脉血清占所述混合血清的比例为30％～80％。
更优选地，按照体积比计算，所述门静脉血清占所述混合血清的比例为30％、50％、70％、80％的任一比例。
优选地，所述完全培养基还包括1％体积比的抗生素。
优选地，所述基础培养基为DMEM高糖基础培养基。
本发明还提供了一种用于培养肝细胞的完全培养基，所述完全培养基为上述任意一发明方案所述的完全培养基，所述完全培养基用于培养肝癌细胞系HepG2。
本发明所提供的一种用于培养肝细胞的完全培养基，为上述任意一发明方案所述的完全培养基，所述完全培养基用于提升肝细胞的药物代谢相关的酶的对应基因表达。
本发明提供了一种用于培养肝细胞的完全培养基，能够更好地还原体内细胞外环境，提供足够的营养供细胞生长，并且能够更好地诱导细胞的代谢酶对应基因表达，所述基因包括但不限于细胞色素代谢酶、肝细胞白蛋白(ALB)、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因，使肝细胞的体外培养能够尽可能地还原体内的生长状态。利用本发明所述的用于培养肝细胞的完全培养基所作的实验，为后续动物实验或人体临床试验提供可靠参考，甚至可以在一定程度替代动物实验或人体临床实验，减少时间消耗和成本，同时避免伦理风险。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点，将从下面结合附图对实验结果的展示中变得明显和容易理解，其中：
图1为荧光定量PCR测定基因的引物序列图；
图2为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中CYP1A2酶的基因表达水平柱状图；
图3为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中CYP2E1酶的基因表达水平柱状图；
图4为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中CYP3A4酶的基因表达水平柱状图；
图5为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中CYP2D6酶的基因表达水平柱状图；
图6为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中UGT1A6酶的基因表达水平柱状图；
图7为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中UGT2A3酶的基因表达水平柱状图；
图8为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中UGT2B4酶的基因表达水平柱状图；
图9为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中肝细胞白蛋白(ALB)的基因表达水平柱状图；
图10为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2中氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)的基因表达水平柱状图；
图11为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2的生长曲线柱状图；
图12为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2的碘化丙啶(PI)染色荧光图；
图13为本发明一种用于培养肝细胞的完全培养基所培养肝癌细胞系HepG2的钙黄绿素-AM染色荧光图；
图14为图12和图13的荧光染色合并图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的对应实验结果或数据在附图中示出，其中自始至终相同或类似的名词表示相同或类似的物质或具有相同或类似功能的物质。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明的技术方案的选例，而不能解释为对本发明的限制。
一、所述完全培养基的制备：
仅在具体实施方式下的实施例中选用Hyclone DMEM培养基配方作为基础培养基，在其他实验或培养条件允许的情况和不脱离本发明思路的前提下，可以选用其他基础培养基。所述Hyclone DMEM培养基配方如下：
无机盐至少包括：
氨基酸至少包括：
维生素至少包括：
其他物质至少有：
D-葡萄糖 4500mg/L
酚红钠 15.9mg/L
碳酸氢钠 3700mg/L
实施例1：完全培养基1的制备：
本实施例中，采用上述Hyclone DMEM培养基配方的粉剂作为基础培养基并在此基础上配置本发明所述的完全培养基，具体步骤如下：
1)对配置用的器械和用具进行消毒或灭菌，需要用的包括但不限于血清瓶、磁力搅拌珠、容量瓶、烧杯、pH计等；
2)收集新鲜的西藏小型猪的门静脉血液；
3)将所述门静脉血液以3000xg离心力离心12min，取下层清液；
4)在56℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
5)采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤所述灭活清液，收集得猪门静脉血清，保藏备用；
6)将所述猪门静脉血清与胎牛血清以1:1体积比混合均匀，得到混合血清，保藏备用；
7)经过计量之后称取合适重量的所述DMEM高糖培养基的粉剂；
8)将所述粉剂溶于适量纯水，并混合均匀成混合液1-1；
9)向所述混合液1-1中加入所述混合血清，加入量占最终完全培养基的10％，混合均匀成混合液1-2；
10)向所述混合液1-2中加入抗生素，加入量占最终完全培养基的1％，混合均匀成混合液1-3；
11)将混合液1-3转移至定容容器或其他量具中，以纯水定容至指定体积，混合均匀为混合液1-4；
12)向混合液1-4中滴加氢氧化钠溶液或盐酸溶液，并混合均匀，调节混合液1-4至指定pH值或范围，仅在本实施例中，调节所述混合液1-4的pH值范围至7.1-7.3；
13)将调节pH后的混合液1-4，经滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后制成完全培养基1，保藏备用。
实施例2：完全培养基2的制备：
本实施例中，采用上述Hyclone DMEM培养基配方的粉剂作为基础培养基并在此基础上配置本发明所述的完全培养基，具体步骤如下：
1)对配置用的器械和用具进行消毒或灭菌，需要用的包括但不限于血清瓶、磁力搅拌珠、容量瓶、烧杯、pH计等；
2)收集新鲜的西藏小型猪的门静脉血液；
3)将所述门静脉血液以3000xg离心力离心12min，取下层清液；
4)在56℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
5)采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤所述灭活清液，收集得猪门静脉血清，保藏备用；
6)将所述猪门静脉血清与胎牛血清以3:7体积比的比例混合均匀，得到混合血清，保藏备用；
7)经过计量之后称取合适重量的所述DMEM高糖培养基的粉剂；8)将所述粉剂溶于适量纯水，并混合均匀成混合液2-1；
9)向所述混合液2-1中加入所述混合血清，加入量占最终完全培养基的10％，混合均匀成混合液2-2；
10)向所述混合液2-2中加入抗生素，加入量占最终完全培养基的1％，混合均匀成混合液2-3；
11)将混合液2-3转移至定容容器或其他量具中，以纯水定容至指定体积，混合均匀为混合液2-4；
12)向混合液2-4中滴加氢氧化钠溶液或盐酸溶液，并混合均匀，调节混合液2-4至指定pH值或范围，仅在本实施例中，调节所述混合液2-4的pH值范围至7.1-7.3；
13)将调节pH后的混合液2-4，经滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后制成完全培养基2，保藏备用。
实施例3：完全培养基4的制备：
本实施例中，采用上述Hyclone DMEM培养基配方的粉剂作为基础培养基并在此基础上配置本发明所述的完全培养基，具体步骤如下：
1)对配置用的器械和用具进行消毒或灭菌，需要用的包括但不限于血清瓶、磁力搅拌珠、容量瓶、烧杯、pH计等；
2)收集新鲜的西藏小型猪的门静脉血液；
3)将所述门静脉血液以3000xg离心力离心12min，取下层清液；
4)在56℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
5)采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤所述灭活清液，收集得猪门静脉血清，保藏备用；
6)将所述猪门静脉血清与胎牛血清以10:3体积比的比例混合均匀，得到混合血清，保藏备用；
7)经过计量之后称取合适重量的所述DMEM高糖培养基的粉剂；；
8)将所述粉剂溶于适量纯水，并混合均匀成混合液4-1；
9)向所述混合液3-1中加入所述混合血清，加入量占最终完全培养基的10％，混合均匀成混合液3-2；
10)向所述混合液3-2中加入抗生素，加入量占最终完全培养基的1％，混合均匀成混合液3-3；
11)将混合液3-3转移至定容容器或其他量具中，以纯水定容至指定体积，混合均匀为混合液3-4；
12)向混合液3-4中滴加氢氧化钠溶液或盐酸溶液，并混合均匀，调节混合液3-4至指定pH值或范围，仅在本实施例中，调节所述混合液3-4的pH值范围至7.1-7.3；
13)将调节pH后的混合液3-4，经滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后制成完全培养基3，保藏备用。
实施例4：完全培养基4的制备：
本实施例中，采用上述Hyclone DMEM培养基配方的粉剂作为基础培养基并在此基础上配置本发明所述的完全培养基，具体步骤如下：
1)对配置用的器械和用具进行消毒或灭菌，需要用的包括但不限于血清瓶、磁力搅拌珠、容量瓶、烧杯、pH计等；
2)收集新鲜的西藏小型猪的门静脉血液；
3)将所述门静脉血液以3000xg离心力离心12min，取下层清液；
4)在56℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
5)采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤所述灭活清液，收集得猪门静脉血清，保藏备用；
6)将所述猪门静脉血清与胎牛血清以7:3体积比的比例混合均匀，得到混合血清，保藏备用；
7)经过计量之后称取合适重量的所述DMEM高糖培养基的粉剂；；
8)将所述粉剂溶于适量纯水，并混合均匀成混合液3-1；
9)向所述混合液4-1中加入所述混合血清，加入量占最终完全培养基的10％，混合均匀成混合液4-2；
10)向所述混合液4-2中加入抗生素，加入量占最终完全培养基的1％，混合均匀成混合液4-3；
11)将混合液4-3转移至定容容器或其他量具中，以纯水定容至指定体积，混合均匀为混合液4-4；
12)向混合液4-4中滴加氢氧化钠溶液或盐酸溶液，并混合均匀，调节混合液4-4至指定pH值或范围，仅在本实施例中，调节所述混合液4-4的pH值范围至7.1-7.3；
13)将调节pH后的混合液4-4，经滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后制成完全培养基4，保藏备用。
基础培养基5的制备：
基础培养基5的制备中，采用上述同样的Hyclone DMEM培养基配方的粉剂作为基础培养基，具体步骤如下：
1)对配置用的器械和用具进行消毒或灭菌，需要用的包括但不限于血清瓶、磁力搅拌珠、容量瓶、烧杯、pH计等；
2)经过计量之后称取合适重量的所述DMEM高糖培养基的粉剂；
3)将所述粉剂溶于适量纯水，并混合均匀成混合液5-1；
4)向所述混合液5-1中加入所述胎牛血清，加入量占最终完全培养基的10％，混合均匀成混合液5-2；
5)向所述混合液5-2中加入抗生素，加入量占最终完全培养基的1％，混合均匀成混合液5-3；
6)将混合液5-3转移至定容容器或其他量具中，以纯水定容至指定体积，混合均匀为混合液5-4；
7)向混合液5-4中滴加氢氧化钠溶液或盐酸溶液，并混合均匀，调节混合液5-4至指定pH值或范围，为控制变量，调节所述混合液5-4的pH值范围至7.1-7.3；
8)将调节pH后的混合液5-4，经滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后制成完全培养基5，保藏备用。
值得注意的是，仅在实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中，所述门静脉血液收集自西藏小型猪，在其它可能的实施方式中，所述门静脉血液还可以收集自其他品种的猪，更进一步地，所述门静脉血液还可以收集自其他，包括但不限于马、牛、兔、鼠等哺乳类动物。
另外，离心的离心力和时间、加热的时间和温度、培养基pH等实验条件，在其他可能的实施方式中，在不脱离本发明的基本思路和原理的前提下，可根据实验仪器等实验条件限制或需要作出调整。
二、本发明所述完全培养基的效果实验：
1.在基因转录水平上，检测细胞色素代谢酶、肝细胞白蛋白(ALB)、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达量实验：
将肝癌细胞系HepG2以500cell/孔的密度接种在三维细胞培养琼脂糖上，进行成球实验，所述三维细胞培养琼脂糖的规格为16行16列，共计256孔的三维细胞培养琼脂糖。设置实验组A、实验组B、实验组C和控制对照组D，其中：
实验组A向已经接种肝癌细胞系HepG2的三维细胞培养琼脂糖中加入所述完全培养基1；
实验组B向已经接种肝癌细胞系HepG2的三维细胞培养琼脂糖中加入所述完全培养基2；
实验组C向已经接种肝癌细胞系HepG2的三维细胞培养琼脂糖中加入所述完全培养基3；
控制对照组D向已经接种肝癌细胞系HepG2的三维细胞培养琼脂糖中加入所述基础培养基5。
将实验组A、实验组B、实验组C和控制对照组D的细胞置于适宜温度下培养一段时间后，采用invitrogen RNA试剂盒提取细胞RNA。具体地，吸去培养细胞的培养基，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞三次，收集细胞球，加入TRIZO(总RNA提取液)1mL用于提取细胞RNA。
采用tarakra试剂盒对所提取的RNA进行逆转录。采用SYBR Green染色法进行荧光定量PCR，对肝癌细胞系HepG2的I相酶(包括：CYP1A2、CYP2E1，CYP3A4、CYP2D6)和II相酶(包括：UGT1A6、UTG2A3、UGT2B4)进行测定。另外，本实验还以同样的方法测定肝细胞白蛋白(ALB)及尿素合成关键酶对应mRNA(CPS1)的基因表达水平。附图1中列出所采用的引物序列。
实验结果：值得注意的是，附图2～附图10为本实验的实验数据所绘制的图表，其中纵坐标所称Relative Expression Level是指对应基因的相对表达水平，即将控制对照组D所培养细胞检测的对应基因表达水平定义为1或1.0，实验组A、实验组B、实验组C在控制对照组D的基础上进行量化。其中，柱状图中每一柱顶端的标记：“*”表示P＜0.05，意味着与控制对照组D比较，具有统计学差异；“**”表示P＜0.01，意味着与控制对照组D比较，具有明显统计学差异。(P为统计学上结果可信程度的一个递减指标)
(1)实验组A、实验组B、实验组C、控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的I相药物代谢酶的基因表达水平：
针对CYP1A2酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图2。附图2中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP1A2酶对应基因表达水平明显高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的CYP1A2酶对应基因表达水平。其中，实验组A、实验组B所培养肝癌细胞系HepG2的CYP1A2酶对应基因表达水平具有明显的统计学差异。
针对CYP2E1酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图3。附图3中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2E1酶对应基因表达水平明显高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2E1酶对应基因表达水平。其中，实验组A、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2E1酶对应基因表达水平具有统计学差异。
针对CYP3A4酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图4。附图4中可以看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP3A4酶对应基因表达水平与控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的CYP3A4酶对应基因表达水平基本相当。
针对CYP2D5酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图5。附图5中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2D5酶对应基因表达水平明显高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2D5酶对应基因表达水平。其中，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的CYP2D5酶对应基因表达水平都具有统计学差异。
(2)实验组A、实验组B、实验组C、控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的II相药物代谢酶的基因表达水平：
针对UGT1A6酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图6。附图6中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的UGT1A6酶对应基因表达水平明显高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的UGT1A6酶对应基因表达水平。其中，实验组A、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的UGT1A6酶对应基因表达水平具有明显的统计学差异。
针对UGT2A3酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图7。附图7中可以清晰地看出，实验组A、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平；实验组B所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平与控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平相当。
针对UGT2B4酶对应基因表达水平的检测结果，请参考附图8。附图8中可以清晰地看出，实验组A、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2B4酶对应基因表达水平高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2B4酶对应基因表达水平；实验组B所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平与控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2A3酶对应基因表达水平相当。其中，实验组A、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的UGT2B4酶对应基因表达水平具有明显的统计学差异。
(3)实验组A、实验组B、实验组C、控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)及氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平：
针对肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平的检测结果，请参考附图9。附图9中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平略低于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平。其中，实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平具有统计学差异。值得注意的是，实验组A、实验组B所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平仅是略低于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的肝细胞白蛋白(ALB)对应基因表达水平，且无统计学上的差异，因此实验组A所采用的完全培养基1、实验组B所采用的完全培养基2仍然适合用于培养肝癌细胞系HepG2或者其他肝细胞而不会对细胞白蛋白基因表达产生影响。
针对氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平的检测结果，请参考附图10。附图10中可以清晰地看出，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平高于控制对照组D所培养肝癌细胞系HepG2的氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平。其中，实验组A、实验组B、实验组C所培养肝癌细胞系HepG2的氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平具有统计学差异。
综合上述实验结果，可以得出以下结论：实验组A、实验组B、实验组C采用的所述完全培养基对于肝癌细胞系HepG2的细胞色素代谢酶、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达水平有显著提升作用，其中实验组A、实验组B对肝癌细胞系HepG2的ALB对应基因表达水平无影响，而仅实验组C对ALB对应基因表达水平有一定抑制作用。进一步说明了，采用本发明所述的完全培养基，相对于基础培养基而言，在保证肝癌细胞系HepG2生长和细胞存活的前提下，能够显著提升肝癌细胞系HepG2中细胞色素代谢酶、肝氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)的基因表达，能够显著降低肝癌细胞系HepG2中肝细胞白蛋白(ALB)的基因表达，即能够促使肝癌细胞系HepG2产生更多的细胞色素代谢酶、肝氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)，进一步说明肝癌细胞系HepG2的代谢能力得到强化。
值得注意的是，为了实验结果具有可以比较的统计学基础，上述实验采用控制变量法的思想，选用相同的培养对象——肝癌细胞系HepG2，其他实验操作、实验条件也尽可能保持一致，这并不意味着本发明仅仅限于实验所限制的内容。在实际制备和应用本发明所述的完全培养基时，可以根据实验需要和实验目的，在本发明所提供的发明方案中，选取合适的方案，选用合适的制备条件，包括但不限于选择其他肝细胞、其他细胞作为培养对象、选择其他哺乳类动物的门静脉血液制成门静脉血清和完全培养基、选用其他培养基配方以制作基础培养基等制备方案。同时，本方案在用于培养肝癌细胞系HepG2方面具有显著的功效，因此可以应用于培养肝癌细胞系HepG2，同时应用于提升肝癌细胞系HepG2的细胞色素代谢酶的表达。选用所述细胞色素代谢酶、肝氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)、肝细胞白蛋白(ALB)作为研究对象，是因为这些物质能够一定程度上反映细胞的代谢能力且检测技术相对成熟，但是这并不意味着本发明排斥所述完全培养基针对其他肝细胞、其他细胞的应用，也不意味着本发明排斥具有提升其他酶、蛋白质或生物因子等物质对应基因表达的效果。
2.测定培养肝细胞的生长曲线实验：
测定细胞生长曲线的检测方法：
对实验中所有器皿消毒或灭菌处理。将人肝癌细胞系HepG2置于25cm2培养瓶中，以基础培养基5进行复苏培养，并且将所述肝癌细胞系HepG2传代培养3-4代，待细胞恢复稳定状态后，进行后续操作。用含EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液对所述传代培养达3-4代的肝癌细胞系HepG2进行消化计数后，进行96孔板接种。
设置实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D，其中：
实验组A向已经接种肝癌细胞系HepG2的96孔板中加入所述完全培养基1；
实验组B向已经接种肝癌细胞系HepG2的96孔板中加入所述完全培养基2；
实验组E向已经接种肝癌细胞系HepG2的96孔板中加入所述完全培养基4；
控制对照组D向已经接种肝癌细胞系HepG2的96孔板中加入所述基础培养基5。
将实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D对应的96孔板置于适宜条件下培养，连续测定细胞活率5天。
测定细胞活率采用Promega MTS试剂盒测定。MTS比色法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTS还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死亡细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTS结晶形成的量与活细胞数成正比。具体地，将原有的培养基上清液吸去，加入100μL的基础培养基5后，再加入测试盒母液20μL，在37℃下培养2小时。5天内，每日同一时刻，用酶联免疫检测仪测定波长490nm的光所对应的吸光度并记录数据，最后绘制成柱状图——附图1。
结论：利用MTS法测定细胞数量时，吸光度与活细胞数量呈正相关，吸光度越高，活细胞数量越多。从附图11可以看出，实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D所培养的细胞数量趋势基本相同，培养时间越长，细胞的数量越趋于同一水平。另外各实验组和控制对照组之间的数值没有显著差异，说明所述完全培养基中不同比例的猪门静脉血清对细胞的生长没有抑制作用。因此在细胞数量增长与细胞存活的角度考虑，所述实验组A、实验组B、实验组E所代表的所述完全培养基能够满足细胞生长的需求，对细胞的生长与存活没有可测得的负面影响。
3.肝细胞的荧光染色实验：
将肝癌细胞系HepG2以500cell/孔的接种密度，接种于24孔板三维培养琼脂糖中，并采用实验组A、实验组B、实验组E的所述完全培养基和控制对照组D的所述基础培养基。
具体地，用含EDTA和0.25％胰蛋白酶的消化液对所述传代培养达3-4代的肝癌细胞系HepG2进行消化计数后，以500cell/孔的接种密度将肝癌细胞系HepG2接种至24孔板三维培养模具中进行细胞成球实验。
设置实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D，其中：
实验组A向已经接种肝癌细胞系HepG2的24孔板三维培养模具中加入所述完全培养基1；
实验组B向已经接种肝癌细胞系HepG2的24孔板三维培养模具中加入所述完全培养基2；
实验组E向已经接种肝癌细胞系HepG2的24孔板三维培养模具中加入所述完全培养基4；
控制对照组D向已经接种肝癌细胞系HepG2的24孔板三维培养模具中加入所述基础培养基5。
将上述实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D置于合适的条件下培养，培养至第6天后，对细胞进行细胞荧光染色。细胞荧光染色的原理是，对活细胞采用钙黄绿素-AM染色，对凋亡细胞采用碘化丙啶(PI)染色。钙黄绿素针对活细胞染色的机理是，钙黄绿素通过活细胞内酯酶的作用，钙黄绿素-AM脱去AM基团，产生的钙黄绿素能够在波长490nm的光激发下，发出发射波长为515nm的强绿色荧光。碘化丙啶对已凋亡细胞染色的机理是，碘化丙啶不能穿过活细胞细胞膜，只能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并且嵌入细胞核的DNA双螺旋，并在波长535nm的光激发下，发出发射波长为617nm的红色荧光。
肝细胞的荧光染色实验结论：从附图12可以看出，在三维状态下培养6天后，所培养的细胞球中心缺氧坏死，因此死亡细胞被碘化丙啶染色，并在波长535nm的光激发下，发出发射波长为617nm的红色荧光。从附图13可以看出，细胞球外部仍然存在大量活细胞，因此活细胞将钙黄绿素-AM转化为钙黄绿素，钙黄绿素在波长490nm的光激发下，发出发射波长为515nm的强绿色荧光。其中，实验组A和控制对照组D的红色荧光最弱，几乎没有出现红色荧光，说明实验组A不影响细胞生长和存活，实验组B、实验组E的红色荧光略强于实验组A和控制对照组D的红色荧光，说明实验组B、实验组E所培养的细胞受到轻微影响。
结合附图12与附图13以及由附图2和附图3合成的附图4，联系上述原理可以发现，实验组A、实验组B、实验组E和控制对照组D所培养的肝癌细胞系HepG2生长状态相似，说明所述完全培养基中的混合血清对细胞生长的影响较小或近乎没有影响，细胞生长曲线实验的结果得到进一步验证。
综合上述实验结果和实验数据，我们可以发现，实验组A所采用的完全培养基1(即实施例1)对细胞生长和细胞存活的负面影响最小，同时能够提升细胞色素代谢酶、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达量，因此实施例1是较为优选的方案。值得注意的是，实验组B、实验组C、实验组E对应所采用的完全培养基2、完全培养基3、完全培养基5对细胞仅产生轻微的损伤，但是仍然拥有提升细胞色素代谢酶、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)对应基因表达量的优点，即能够达到本发明所称技术目的。本领域技术人员可以依据实验目的等具体考虑，决定是否采用对应实施例所提供的完全培养基，或者在本发明所提供的技术方案内选择其他实施方式。上述实验和结论在证明上述实施例能够满足本发明的技术目的的同时，还证明所述完全培养基1为值得采用的较优技术方案，但并不意味着其他的实施例或本发明的其他技术方案不能达到本发明的技术目的。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种用于培养肝细胞的完全培养基，其特征在于，所述完全培养基组分包括基础培养基和混合血清；所述混合血清由门静脉血清和胎牛血清组成。
2.如权利要求1所述的完全培养基，其特征在于，所述门静脉血清采用至少一种哺乳类动物门静脉血清。
3.如权利要求2所述的完全培养基，其特征在于，所述门静脉血清的制备方法包括以下步骤：
(1)收集新鲜的门静脉血液；
(2)将所述门静脉血液离心，取下层清液；
(3)在50℃-60℃下加热所述下层清液至灭活补体，得灭活清液；
(4)过滤所述灭活清液，收集得门静脉血清。
4.如权利要求3所述的完全培养基，其特征在于，所述门静脉血液离心的时间为12min或以上。
5.如权利要求3所述的完全培养基，其特征在于，将所述门静脉血液以2000xg-5000xg的离心力进行离心。
6.如权利要求3所述的完全培养基，其特征在于，所述加热下层清液的时间为30min或以上。
7.如权利要求3所述的完全培养基，其特征在于，所述加热下层清液的温度为56℃。
8.如权利要求3所述的完全培养基，其特征在于，过滤所述灭活清液，采用滤孔直径为0.22μm的微孔滤膜。
9.如权利要求2所述的完全培养基，其特征在于，所述哺乳类动物门静脉血清采用猪门静脉血清。
10.如权利要求1所述的完全培养基，其特征在于，按照体积比计算，所述混合血清至少占所述完全培养基的10％。
11.如权利要求1所述的完全培养基，其特征在于，按照体积比计算，所述门静脉血清占所述混合血清的比例为30％～80％。
12.如权利要求11所述的完全培养基，其特征在于，按照体积比计算，所述门静脉血清占所述混合血清的比例为30％、50％、70％、80％的任一比例。
13.如权利要求1所述的完全培养基，其特征在于，所述完全培养基还包括1％体积比的抗生素。
14.如权利要求1所述的完全培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM高糖基础培养基。
15.一种用于培养肝细胞的完全培养基，其特征在于，所述完全培养基为权利要求1-14任意一项所述的完全培养基，所述完全培养基用于培养肝癌细胞系HepG2。
16.一种用于培养肝细胞的完全培养基，其特征在于，所述完全培养基为权利要求1-14任意一项所述的完全培养基，所述完全培养基用于提升肝细胞的药物代谢相关的酶的对应基因表达。
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