CN109689066A - 免疫刺激因子产生促进用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明通过含有来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA的免疫刺激因子产生促进用组合物，能够预防及改善病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等多种疾病。

Description

免疫刺激因子产生促进用组合物
技术领域
本发明涉及一种免疫刺激因子产生促进用组合物。
背景技术
对于所有病毒性疾病，并未确立有效的治疗法，通常采用对应于各个病毒性疾病的治疗法。例如，对C型肝炎等进行干扰素疗法，对流行性感冒等特定的病毒性疾病进行抗病毒药(达菲、瑞乐沙等)的给药。但是，从副作用的风险、成本等角度出发，难以以预防为目的而持续利用干扰素疗法。此外，目前的抗病毒药以合成低分子化合物为有效成分，从成本等角度出发，依然难以以预防为目的而持续利用。
对于癌症，进行了以作用于DNA合成等来抑制癌细胞增殖为目的的抗癌剂疗法、以使免疫活化来抑制癌细胞增殖为目的的干扰素疗法等药物疗法。但是，从副作用的风险及成本等角度出发，难以以预防为目的而持续利用干扰素疗法。此外，目前的抗癌剂通常以合成低分子化合物、抗体等为有效成分，从成本等角度出发，依然难以以预防为目的而持续利用。
关于多发性硬化症，也与病毒性疾病、癌症等相同，虽然通过低分子化合物、干扰素等进行治疗，但从副作用的风险、成本等角度出发，难以以预防为目的而持续利用。
如上所述，仍然没有一种可广范围地适用于病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等各种疾病、且可利用于这些疾病的预防(即副作用的风险低、成本低)的治疗法。
另一方面，有报告称内源RNA病毒(endornavirus)存在于植物中，特别是存在于青椒、稻等日常摄取的食用植物中(非专利文献1、非专利文献2等)。也有人指出某种RNA病毒通过经由MDA5、RIG-I等的信号转导途径而诱导干扰素产生，其结果，引起生物体内的免疫刺激。然而，仍不清楚内源RNA病毒与病毒性疾病的关联。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Journal of General Virology(2011),92,2664-2673
非专利文献2：Journal of General Virology(2011),92,2674-2678
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的技术问题在于提供一种对病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等各种疾病的预防及改善方法。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人鉴于上述技术问题进行了认真研究，结果发现，来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA具有促进干扰素等免疫刺激因子产生的作用。进一步发现，根据该双链RNA，能够预防及改善病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等广泛的疾病。本申请的发明人基于上述见解进一步进行研究，其结果完成了本发明。
即，本发明包含下述实施方式：
项1.一种免疫刺激因子产生促进用组合物，其含有来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA。
项2.根据项1所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述植物为辣椒属植物、稻属植物或蚕豆属植物。
项3.根据项1或2所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述基因组双链RNA的长度为8～20kbp。
项4.根据项1～3中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述基因组双链RNA为直链状。
项5.根据项1～4中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为医药组合物。
项6.根据项1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为经鼻制剂形态。
项7.根据项1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为口服制剂形态。
项8.根据项1～4中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为食品组合物.
项9.根据项1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为免疫刺激用组合物。
项10.根据项1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为抗病毒用组合物。
项11.根据项10所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述病毒为RNA病毒。
项12.根据项1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为佐剂。
项13.根据项1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为癌症的预防或改善用组合物。
此外，本发明还包含下述实施方式：
项14.一种免疫刺激因子产生促进方法，其包括将来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA适用于动物或人。
项15.一种来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA，其用于促进免疫刺激因子的产生。
项16.一种来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA的应用，其用于制备免疫刺激因子产生促进用组合物。
项17.一种来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA的应用，其用于促进免疫刺激因子的产生。
发明效果
根据本发明，通过使用来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA，促进了干扰素等免疫刺激因子的产生，由此能够刺激体内的免疫。因此，来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA能够利用于基于免疫刺激因子产生促进作用、免疫刺激作用的各种用途(例如，病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等的预防及改善、佐剂等)。此外，在用于抗病毒用时，也能够适用于广泛种类的病毒。
进一步，由于来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA为包含在植物(特别是食用植物)中的成分，因此认为其安全性较高。此外，根据本发明，还能够从植物中有效地提纯该双链RNA。因此，能够以更安全且更低的成本利用来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA，适宜以预防病毒性疾病、癌症、多发性硬化症等疾病为目的而持续利用。
附图说明
图1表示实施例2的in vitro(体外)免疫刺激因子产生试验1的结果；纵轴表示相对表达量。
图2表示实施例3的in vivo(体内)免疫刺激因子产生试验1的结果；纵轴表示相对表达量。
图3表示实施例4的in vivo免疫刺激因子产生试验2的结果；纵轴表示相对表达量；“京铃RNA”表示实施例1中得到的total RNA(总RNA)。
图4表示实施例5的病毒感染试验1的结果；左侧的图的纵轴表示存活率，右侧的图的纵轴表示体重；横轴表示感染后的经过天数；“Green pepper(青椒)”表示给药实施例1中得到的total RNA的情况。
图5表示实施例6的病毒感染试验2的结果；左侧的图的纵轴表示存活率，右侧的图的纵轴表示体重；横轴表示感染后的经过天数；“Green pepper”表示给药实施例1中得到的total RNA的情况。
图6表示实施例7的病毒感染试验3的结果；纵轴表示存活率；横轴表示感染后的经过天数；“京铃RNA”表示实施例1中得到的total RNA。
图7表示实施例10的in vitro免疫刺激因子产生试验2的结果；纵轴表示相对表达量；“dsRNA(双链RNA)”表示实施例8中得到的total RNA。
图8表示实施例11的in vivo免疫刺激因子产生试验3的结果；纵轴表示相对表达量；横轴表示给药后的经过时间。
图9表示实施例12的病毒感染试验4的结果；纵轴表示存活率；横轴表示感染后的经过天数；“dsRNA treated(经双链RNA处理)”表示给药实施例8的RNA的情况，“PR/8control(PR/8对照)”表示给水以代替实施例8的RNA的情况。
图10表示实施例13的病毒感染试验5的结果；上侧的图的纵轴表示体重，下侧的图的纵轴表示存活率；横轴表示感染后的经过天数；“GP”及“Green pepper”表示给药实施例1中得到的total RNA的情况。
图11表示实施例14的in vivo免疫刺激因子产生试验4的结果；纵轴表示相对表达量；在各图表中，左侧的柱表示野生型小鼠的结果，右侧的柱表示MAD5及TRIF的双敲小鼠的结果。
图12表示实施例15的毒性试验的结果；纵轴表示体重，横轴表示从初次给药开始的经过天数。
图13表示实施例16的癌症治疗/预防效果的评价试验的结果；纵轴表示肿瘤的大小，横轴表示从皮下注射黑素瘤细胞开始的经过天数；“dsRNA(-)”表示给药比较例1的total RNA的情况，“dsRNA(+)”表示给药实施例1的total RNA的情况。
图14表示实施例17的多发性硬化症治疗/预防效果的评价试验的结果；纵轴表示作为多发性硬化症模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的临床评分，横轴表示从髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)给药(day 0)开始的经过天数；“GP”表示给药实施例1中得到的total RNA的情况。
图15表示实施例19的in vivo免疫刺激因子产生试验4的结果；纵轴表示相对表达量；横轴中，“mock(空白对照)”表示给水的情况，“RNA(个体1)”及“RNA(个体2)”分别表示给药实施例1中得到的total RNA的情况下的两头小型迷你猪的结果。
具体实施方式
在本说明书中，“含有”及“包含”的表达包括“含有”、“包含”、“实质上由…形成”及“仅由…形成”的概念。
本发明的一个实施方式涉及一种含有来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA的、免疫刺激因子产生促进用组合物(在本说明书中，有时也表示为“本发明的组合物”)。以下对其进行说明。
1.来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA
以下，对作为本发明的组合物的有效成分的“来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA”进行说明。
来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA只要是植物中含有的内源RNA病毒的基因组双链RNA则没有特别限定。
已知有各种含有内源RNA病毒的植物。作为该植物的例子，可列举出Capsicumannuum(辣椒)、Capsicum frutescens(尖椒)、Capsicum baccatum(黄椒)、Capsicumchinense(黄灯笼辣椒)等辣椒属植物；Oryza sativa(品种例如有Koshihikari等)等稻属植物；蚕豆属植物等。作为含有内源RNA病毒的Capsicum annuum的品种，例如可列举出California Wonder、Yolo Wonder、Kyousuzu、Kyounami、Kyoumidori、Ace、Suigyokunigou、High Green、Jumbo Colour、Marengo、Avelar、Casca Dura、King Arthur、VR-4、Magda、Bonnie’s Green Bell、Red Bell、Chocolate Beauty Sweet、Pimento Sweet、CayenneLong Red Thick、Super Cayenne等。作为含有内源RNA病毒的Capsicum frutescens的品种，例如可列举出Greenleaf、LSU、PI 159239、PI 193470等。作为含有内源RNA病毒的Capsicum baccatum的品种，例如可列举出Monk’s Hat、PI 238061、PI 633752、PI 260549、PI 215699、PI 260590、PI 260543、PI 441589、PI 257135、PI 337524、PI 337522、C00754(AVRDC)、C01218(AVRDC)、C01527(AVRDC)、C01300(AVRDC)等。作为含有内源RNA病毒的Capsicum chinense的品种，例如可列举出PI 159236、PI 315008、PI 315023、PI 315024、PI 273426、C00943(AVRDC)、C00949(AVRDC)等。
植物中含有的内源RNA病毒通常不被衣壳包裹，由作为基因组的双链RNA构成。在本发明中，将该双链RNA用作有效成分。
在本发明中，用作有效成分的基因组双链RNA可以是内源RNA病毒的基因组全长，也可以是其片段。但是，从能够更有效地发挥免疫刺激因子产生促进作用的角度出发，该基因组双链RNA的长度最好更长，例如为8～20kbp，优选为10～18kbp，更优选为12～16kpb。
在本发明中，用作有效成分的基因组双链RNA的形状没有特别限制，但通常为直链状。
在本发明中，用作有效成分的基因组双链RNA的序列没有特别限制。本发明中发现，由两个不同植物中提纯的内源RNA病毒基因组双链RNA、即序列互不相同的基因组双链RNA具有免疫刺激因子产生促进作用。因此，认为该免疫刺激因子产生促进效果不依赖来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA的序列。
2.制备方法
以下，对作为本发明的组合物的有效成分的“来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA”的制备方法进行说明。
作为本发明的组合物的有效成分的“来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA”能够通过由含有内源RNA病毒的植物细胞中提纯核酸(特别是RNA)的方法而获得。例如，能够通过适当组合细胞溶解工序、除蛋白工序、核酸浓缩工序、核酸增溶工序等而进行提纯。
作为材料的植物细胞，只要为含有内源RNA病毒的植物细胞则没有特别限制。从安全性的角度出发，植物细胞优选为食用植物的细胞，更优选为食用植物的食用部位(例如果实、种子或它们一部分)的细胞。此外，从能够以更低成本得到目标物质的角度出发，最好使用食用部位中通常被废弃的部位(例如，稻种子(米)的糠等)的细胞。
只要能够破坏植物细胞的细胞膜，则细胞溶解工序没有特别限制，可采用各种公知的方法。例如可列举出与含有表面活性剂的溶液进行混合的工序。表面活性剂没有特别限制，可使用各种表面活性剂，但优选不破坏核膜的程度的强度的表面活性剂。由此，能够防止细胞的基因组DNA的混入，以更高的纯度得到内源RNA病毒的基因组双链RNA。作为这样的表面活性剂，可优选列举出脱氧胆酸钠。表面活性剂的浓度可根据其种类进行适当调整，例如当表面活性剂为脱氧胆酸钠时，例如可采用0.2～1％左右的浓度，优选采用0.3～0.7％左右的浓度。此外，在为后文所述的方法4时，优选采用0.15～0.35％左右的浓度。混合后，最好通过离心分离等去除不溶成分。
只要能够使蛋白质不溶，则除蛋白工序没有特别限制，可采用各种公知的方法。例如可列举出与苯酚、氯仿、含有苯酚及氯仿的混合溶剂等有机溶剂进行混合的工序。在混合后通常通过离心分离等去除不溶的蛋白质。除蛋白工序可根据需要进行数次(例如2～4次)。
只要能够通过离心分离等使核酸沉淀，则核酸浓缩工序没有特别限制，可采用各种公知的方法。例如可列举出醇沉淀、盐析等。用于醇沉淀的醇没有特别限制，例如可列举出乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。作为用于盐析的盐，例如可列举出氯化锂、氯化钠、乙酸铵、乙酸钠等，优选氯化锂。核酸浓缩工序中，可根据需要将醇沉淀与盐析组合并进行数次(例如2～3次)。
只要能够使通过核酸浓缩工序而得到的沉淀中含有的核酸(特别是双链RNA)增溶，则核酸增溶工序没有特别限制，可采用各种公知的方法。例如可列举出将通过核酸浓缩工序而得到沉淀混悬在含有螯合剂的溶液中的工序。作为螯合剂，例如可列举出柠檬酸钠、乙二胺四乙酸氢三钠等。
除了上述工序以外，也可根据需要组合其他工序，例如清洗工序(例如，利用乙醇水溶液的冲洗等)，还可进一步组合提纯工序(例如凝胶过滤等各种层析等)等。
作为获得本发明的组合物的有效成分“来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA”的具体方法，例如可列举出依次进行除蛋白工序、醇沉淀的方法(方法1)；依次进行细胞溶解工序、除蛋白工序、醇沉淀、盐析的方法(方法2)；依次进行细胞溶解工序、醇沉淀(优选聚乙二醇沉淀)及盐析、除蛋白工序、醇沉淀的方法(方法3)；依次进行细胞溶解工序、醇沉淀、核酸增溶工序、醇沉淀的方法(方法4)等。
其中，方法3能够通过第一次的醇沉淀减少溶液量，由此还能够减少除蛋白工序中使用的有机溶剂的量，因此适合以更大规模进行。
此外，方法4能够获得作为具有粘性的膏状沉淀的、内源RNA病毒的基因组双链RNA。通过冷冻干燥等将该沉淀制成粉末，由此能够长期保存该双链RNA。另外，在方法4中，在两次醇沉淀中，优选第一次醇沉淀中的醇浓度较低(例如，将醇浓度设为10～30％，优选设为15～25％)，第二次醇沉淀中的醇浓度较高(例如，将醇浓度设为50～80％，优选设为60～75％，更优选设为60～70％)。
3.用途
以下，对本发明的组合物的用途进行说明。另外，在下文中，当将本发明的组合物用作医药组合物时，可称“改善”为“治疗”。
由于来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA具有免疫刺激因子产生促进作用，因此能够利用于免疫刺激因子产生促进用的各种组合物(医药组合物、食品组合物、口腔用组合物等)中。来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA能够直接适用于动物及人(例如给药、摄取、接种等)，或者也能够与惯用的成分一并制成各种组合物而适用于动物及人。
本发明的组合物能够促进干扰素(例如IFN-β1、IFNα4等)、干扰素反应因子(例如ISG56、BST2、IFITM3、CXCL1、CXCL2、Pai-1等)、细胞因子(例如IL-1β、IL6、TNFα等)、干扰素诱导基因(例如Cxcl10等)等免疫刺激因子的产生。由此，本发明的组合物能够刺激体内的免疫。因此，本发明的组合物能够用作免疫刺激用组合物。
本发明的组合物也可用作抗病毒用组合物(病毒感染症的预防或改善用组合物)。认为这是基于本发明的组合物的上述作用(免疫刺激因子产生促进作用及免疫刺激作用)，因此认为不论病毒的种类如何，本发明的组合物能够对各种病毒发挥抗病毒作用。
作为对象病毒，没有特别限制，例如可列举出流行性感冒病毒(例如A型、B型等)、风疹病毒、埃博拉病毒、冠状病毒、麻疹病毒、水痘〃带状疱疹病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、虫媒病毒、肠道病毒、腺病毒、RS病毒、诺如病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒、人类细小病毒、脑心肌炎病毒、脊髓灰质炎病毒、SARS病毒、肝炎病毒(例如，A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒等)、黄热病毒、狂犬病病毒、汉坦病毒、登革病毒、尼帕病毒、B病毒、丽沙病毒、鼻病毒等。其中，可优选列举出流行性感冒病毒、脑心肌炎病毒等RNA病毒。
本发明的组合物由于具有免疫刺激因子产生促进作用、免疫刺激作用，因此也能够用作佐剂。
本发明的组合物由于具有免疫刺激因子产生促进作用、免疫刺激作用，因此也能够用于各种疾病的预防或改善用，例如能够用于多发性硬化症(MS)、癌症等的预防或改善用。
作为预防或改善对象的癌症，没有特别限制，例如可列举出皮肤癌、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、胰脏癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、胆道癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、精巢癌、白血病、骨肿瘤、骨肉瘤、软组织肿瘤、恶性淋巴瘤、咽癌、头颈部的癌、小儿癌等。
本发明的组合物的形态没有特别限定，可根据本发明的组合物的用途制成各用途中常用的形态。
当用途为医药组合物、健康增进剂、营养补充剂(补剂等)等时，作为形态，例如可列举出片剂(包括口腔内侧崩解片、可咀嚼片、泡腾片、锭剂、果冻状糖球剂(jelly drops)等)、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液体剂(包括健康饮料、混悬剂、糖浆剂)、果冻剂等适合口服摄取的制剂形态(口服制剂形态)、滴鼻剂、吸入剂、直肠栓剂、插入剂、灌肠剂、凝胶剂、注射剂、贴附剂、洗剂(lotions)、乳霜剂(cream agent)等适合非口服摄取的制剂形态(非口服制剂形态)。非口服制剂形态中优选滴鼻制剂形态。
当用途为食品组合物时，作为形态，可列举出液状、凝胶状或固体状的食品，例如可列举出果汁、清凉饮料、茶、汤、豆乳、色拉油、调味汁、酸奶、果冻、布丁、调味食品(furikake)、育儿用奶粉、蛋糕预拌粉、粉末状或液状的乳制品、面包、饼干等。
当用途为口腔用组合物时，作为形态，例如可列举出液体(溶液、乳液、悬浮液等)、半固体(凝胶、乳霜、膏等)、固体(片剂、颗粒状剂、胶囊剂、膜剂、混炼物、熔融固体、蜡状固体、弹性固体等)等任意的形态，更具体而言，可列举出牙膏剂(牙膏、液体牙膏、液状牙膏、粉状牙膏等)、漱口剂、涂剂、贴附剂、口中清凉剂、食品(例如，口香糖、压片糖果(tabletcandy)、糖果、软糖、膜、糖锭等)等。
本发明的组合物还可根据需要进一步含有其他成分。作为其他成分，只要是能够掺合于医药组合物、食品组合物、口腔用组合物等中的成分，则没有特别限定，例如可列举出基剂、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、保湿剂、着色料、香料、螯合剂等。
本发明的组合物中的有效成分的含量受用途、使用形态、适用对象、适用对象的状态等影响，没有限定，例如可设为0.0001～95重量％，优选设为0.001～50重量％。
本发明的组合物的适用(例如，给药、摄取、接种等)量只要是体现药效的有效量则没有特别限定，通常，作为有效成分的本发明的化合物的重量一般在口服给药时为每天0.1～1000mg/kg体重，优选为每天0.5～50mg/kg体重，在非口服给药时为每天0.01～100mg/kg体重，优选为0.1～10mg/kg体重。优选将上述给药剂量以每天1次或分为2～3次给药，也可根据年龄、病况、症状进行适当增减。
实施例
以下，根据实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例限定。
实施例1：从青椒(Capsicum annuum L.'grossum',Kyosuzu)中提纯total RNA
从已知细胞内含有内源RNA病毒的基因组双链RNA的青椒(品种名：京铃)中提纯total RNA。具体而言，按照以下方式进行。
使用压榨低速榨汁机(鲜活酵素君(イキイキ酵素くん)，Odeo Corporation制造)将青椒栽培品种京铃粉碎。以2,000rpm进行离心，去除上清液。加入RNase free water(无RNA霉水)直至得到的沉淀物全部溶解，向其中加入等量的苯酚〃氯仿溶液(TE饱和酚:氯仿＝1:1)并剧烈搅拌后，进行离心(4℃，2,380g(离心力)，15分钟)并回收上清液。相对于得到的上清液的1/10量加入盐水溶液及2倍量的100％乙醇，进行混合后，在-80℃下静置15分钟。进行离心(4℃，2,380g(离心力)，15分钟)并去除上清液后，使用70％乙醇水溶液清洗沉淀。通过减压干燥去除剩余的溶剂，得到total RNA。以使核酸为1000ng/μL的方式使用Rnase free water溶解该total RNA。对total RNA进行琼脂糖凝胶电泳，确认到含有约14.7kb的双链RNA(内源RNA病毒的基因组双链RNA)。此外，该双链RNA量约为全部核酸的0.058％(w/w)。
比较例1：从青椒(Capsicum annuumL.'grossum',Miogi)中提纯total RNA
以与实施例1相同的方式，从已知细胞内不含内源RNA病毒的基因组双链RNA的青椒(品种名：みおぎ(Miogi))中提纯total RNA。
实施例2：in vitro免疫刺激因子产生试验1
从6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)中采取肺成纤维细胞，按照常规方法在6cm的培养皿上培养3天。然后，以1×105细胞/孔的方式在12孔板上进行播种，向进行了一晚培养的培养基中添加50μL/板的实施例1或比较例1的total RNA水溶液(核酸：1000ng/μL)或水，进行24小时培养。培养后，通过定量RT-PCR测定干扰素反应性基因(ISG56及CXCL10)的mRNA表达量。将结果示于图1。
如图1所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，干扰素反应性基因的表达增加。
实施例3：in vivo免疫刺激因子产生试验1
使用500μL的PBS，对用Rnase free water制备成100mg/ml的15μL戊巴比妥钠进行稀释，并将该稀释液(＝1.5mg/只)腹腔注射至6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝3)中，由此对小鼠进行麻醉。经鼻给药(12.5μL、25μL或50μL/只)实施例1的total RNA水溶液(核酸：1000ng/μL)。在给药后，通过用手指轻弹小鼠的鼻子，将其仰面静置，以使给药样本确实地到达至肺中。在给药24小时后采取肺，通过定量RT-PCR测定肺中的干扰素(IFN-β1)及干扰素反应性基因(ISG56)的mRNA表达量。将结果示于图2。
如图2所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，干扰素及干扰素反应性基因的表达依赖浓度而增加。
实施例4：in vivo免疫刺激因子产生试验2
以与实施例3相同的方式，对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝3)经鼻给药(50μL/只)实施例1的total RNA水溶液。另一方面，除了对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝3)进行口服给药(300μL/只)以外，以与实施例3相同的方式进行实施例1的total RNA水溶液的给药。在给药24小时后采取各个脏器(肺、大肠、小肠、胃、肝脏及脾脏)，通过定量RT-PCR测定各个脏器中的干扰素反应性基因(ISG56)的mRNA表达量。将结果示于图3。
如图3所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，各组织中的干扰素反应性基因的表达增加。
实施例5：病毒感染试验1(经鼻给药)
以与实施例3相同的方式，对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝7)经鼻给药(30μL/只)实施例1的total RNA水溶液。在给药1天后，通过经鼻给药1.3×107pfu/μL×50μL/只的流行性感冒A病毒(H1N1)，使小鼠感染。在感染1天后，以与实施例3相同的方式经鼻给药(30μL/只)实施例1的total RNA水溶液。从感染开始经过一定期间后，测定小鼠的存活率及体重。将结果示于图4。
如图4所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，抑制了因流行性感冒A病毒感染造成的存活率下降及体重减少。
实施例6：病毒感染试验2(经鼻给药)
除了使用强毒性流行性感冒A病毒(H5N1)作为使小鼠感染的病毒以外，以与实施例5相同的方式进行试验。将结果示于图5。
如图5所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，抑制了因强毒性流行性感冒A病毒感染造成的存活率下降及体重减少。
实施例7：病毒感染试验3(口服给药)
在感染病毒的前一天(Day-1)的下午对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)口服给药(300μL/只)实施例1的total RNA水溶液。在次日(Day0)的上午口服给药3.2×107pfu/只(200μL)的脑心肌炎病毒(EMCV)，使小鼠感染。在感染日(Day0)的下午及感染日的次日(Day1)口服给药(300μL/只)实施例1的total RNA水溶液。从感染开始经过一定期间后，测定小鼠的存活率。将结果示于图6。
如图6所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，抑制了因脑心肌炎病毒感染造成的存活率下降。
实施例8：从米糠(Oryza sativa,Koshihikari(品种))中提纯双链RNA
从已知细胞内含有内源RNA病毒的基因组双链RNA的米(越光)的糠中提纯双链RNA。具体而言，按照以下方式进行。
向60g越光(品种)的米糠中添加300mL的0.5％DOC缓冲液(组成：285ml的5M NaCl和3M NaOAc(pH 5.2)+15ml的10％脱氧胆酸钠(DOC))并进行混合后，进行离心(4℃，10000rpm，15分钟)并回收上清液。向上清液中添加等量的苯酚并剧烈搅拌后，进行离心(4℃，8000rpm，10分钟)并回收上清液。重复2次该苯酚提取操作。向上清液中添加等量的苯酚〃氯仿溶液并剧烈搅拌后，进行离心(4℃，3500rpm，3分钟)并回收上清液。向上清液中添加等量的异丙醇并进行搅拌后，进行离心(4℃，10000rpm，30分钟)并去除上清液。使用70％乙醇水溶液清洗沉淀，并溶解于10mM TE缓冲液中。以使最终浓度为2.25M的方式向得到的溶液中添加氯化锂并进行混合后，在冰上静置2小时，然后进行离心(4℃，15000rpm，15分钟)并回收上清液。以使最终浓度为4M的方式向上清液中添加氯化锂并进行混合后，在冰上静置2小时，然后进行离心(4℃，15000rpm，35分钟)。去除上清液，得到RNA。对RNA进行琼脂糖凝胶电泳，确认到含有约14kb的双链RNA(内源RNA病毒的基因组双链RNA)。
实施例9：从米糠(Oryza sativa,koshihikari(品种))中提纯双链RNA
向60g越光(品种)的米糠中添加15mL的0.5％DOC缓冲液并进行混合后，进行离心(4℃，10000rpm，15分钟)并回收上清液。以使最终浓度为1.6M的方式向上清液中加入氯化钠，进一步以使最终浓度为6.5％的方式加入PEG#6000并进行搅拌后，在冰上静置2小时，然后进行离心(4℃，10000rpm，60分钟)并去除上清液。使用70％乙醇水溶液清洗2次沉淀并进行风干后，溶解于5mL TE缓冲液。向得到的溶液中加入等量的苯酚并剧烈搅拌后，进行离心(4℃，8000rpm，10分钟)并回收上清液。重复2次该苯酚提取操作。向上清液中加入等量的氯仿并剧烈搅拌后，进行离心(4℃，3500rpm，3分钟)并回收上清液。向上清液中添加等量的异丙醇并进行搅拌后，进行离心(4℃，10000rpm，30分钟)并去除上清液。将沉淀溶解于1mL的超纯水中，通过凝胶过滤(Sepharose 4B)提纯约14kb的双链RNA。
实施例10：in vitro免疫刺激因子产生试验2
按照常规方法在6孔板培养皿上培养小鼠胚胎成纤维细胞。向培养基中同时添加1μg实施例8的RNA水溶液(含有0.25μg双链RNA)或1μg PolyIC与脂质转染胺(lipofectamine)(/皿)，培养6小时。培养后，通过定量RT-PCR测定干扰素(IFN-β1)及干扰素反应性基因(ISG56)的mRNA表达量。将结果示于图7。
如图7所示，通过来自米糠的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例8)，干扰素及干扰素反应性基因的表达增加。
实施例11：in vivo免疫刺激因子产生试验3
以与实施例3相同的方式，对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)经鼻给药实施例8的RNA水溶液(含有20μg双链RNA)。在给药后0、4、8及24小时后摘出肺，通过定量RT-PCR测定各种mRNA表达量。将结果示于图8。
表明：通过来自米糠的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例8)的经鼻给药，还能够促进肺中的干扰素(例如IFN-β1、IFNα4等)、干扰素反应因子(例如ISG56、BST2、IFITM3、CXCL1、CXCL2、Pai-1等)、细胞因子(例如IL-1β、IL6、TNFα等)的产生(图8)。
实施例12：病毒感染试验4(经鼻给药)
以与实施例3相同的方式，对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝5)经鼻给药实施例8的RNA水溶液(含有20μg双链RNA)。在给药8小时后，以与实施例3相同的方式通过经鼻给药流行性感冒A病毒(H1N1)使小鼠感染，并同时以与实施例3相同的方式经鼻给药实施例8的RNA水溶液(含有20μg双链RNA)。从感染开始经过一定期间后，测定小鼠的存活率及体重。将结果示于图9。
如图9所示，通过来自米糠的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例8)，抑制了因流行性感冒A病毒感染造成的存活率下降。
实施例13：病毒感染试验5(经鼻给药)
除了使用MAD5及TRIF的双敲小鼠(n＝5)作为小鼠以外，以与实施例5相同的方式进行试验。将结果示于图10。
如图10所示，在MAD5及TRIF的双敲小鼠中，因流行性感冒A病毒感染造成的存活率下降未因来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)而恢复。由此，暗示内源RNA病毒的基因组双链RNA的效果是一种通过经由MAD5和/或TRIF的信号转导途径的效果。
实施例14：in vivo免疫刺激因子产生试验4
除了使用MAD5及TRIF的双敲小鼠(n＝5)作为小鼠并在8小时后进行肺的采取以外，以与实施例3相同的方式进行试验。将结果示于图11。
如图11所示，野生型小鼠中出现的由来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)带来的干扰素及干扰素反应性基因的表达上升，并未在MAD5及TRIF的双敲小鼠中出现。由此，暗示内源RNA病毒的基因组双链RNA的效果是一种通过经由MAD5和/或TRIF的信号转导途径的效果。
实施例15：毒性试验
以与实施例3相同的方式，对6周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝5)经鼻给药(30μL/只)实施例1的total RNA水溶液。以2次/周的频率持续该给药，测定小鼠的体重变化。将结果示于图12。
如图12所示，给药来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)时的体重变化与作为代替而给水时的体重变化的程度相同。
实施例16：癌症治疗/预防效果的评价试验
对8周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝各群6，共12)皮下注射1×106个黑素瘤细胞(B16-F110细胞)。从皮下注射开始经过1天后，以2次/周的频率腹腔给药含有250μg双链RNA的实施例1的total RNA水溶液。测定从皮下注射开始第1天至数天的每天的肿瘤的大小。将结果示于图13。
如图13所示，在给药来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)时，基本能够完全地抑制肿瘤的扩大。
实施例17：多发性硬化症治疗/预防效果的评价试验
对8周龄的C57BL/6J小鼠(♀)(n＝17)给药髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG，200μg)及百日咳毒素(p-toxin(p-毒素)，0.5μg)(day 0)。在给药MOG(day 0)2天后(day 2)，给药百日咳毒素(p-toxin，0.5μg)。通过这2次给药，诱发了作为多发性硬化症模型的EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)。在给药MOG(day 0)后第7、8及9天(day 7、8、9)，仅对全体(n＝17)中的9只经鼻给药含有30μg双链RNA的实施例1的total RNA水溶液。在从给药MOG(day 0)开始的第1天至数天的每天，对临床评分进行评价(0:normal(无症状)，1:decreasing muscletonus in tail(尾部肌肉张力下降)，2:complete paralysis in tail(尾部完全麻痹)，3:gait abnormality(步行异常)，4:hind-limb paralysis(后肢完全麻痹))。将结果示于图14。
如图14所示，在给药来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)时，能够抑制EAE的临床评分的恶化。
实施例18：从米糠(Oryza sativa,koshihikari(品种))中提纯双链RNA
向200g越光(品种)的米糠中添加2000mL的0.25％胆酸钠溶液(组成：0.1M NaCl，0.25％胆酸钠)并进行混合后，进行离心(4℃，3500rpm，10分钟)或在4℃下放置。进行离心或放置后，回收上清液(乳白色〃白浊)。向上清液中添加1/4容积的乙醇并进行搅拌，在冰上放置60分钟后，进行离心(4℃，3500rpm，20分钟)并去除上清液。向沉淀中添加200mL的RNA增溶溶液(组成：0.1M NaCl，螯合剂(50mM柠檬酸钠或50mM乙二胺四乙酸氢三钠))，进行混悬。对悬浮液进行离心(4℃，10000rpm，10分钟)并回收上清液。向上清液中添加2倍容积的乙醇并进行搅拌，在冰上放置60分钟后进行离心(4℃，3500rpm，20分钟)并去除上清液。确认到得到的沉淀含有内源RNA病毒的双链RNA。另外，得到的沉淀为具有粘性的膏状，通过冷冻干燥等而将其粉末化，由此能够长期保存内源RNA病毒的双链RNA。
实施例19：in vivo免疫刺激因子产生试验4
麻醉5kg的小型迷你猪，经鼻给药实施例1的total RNA水溶液(含有4mg来自青椒的RNA(总RNA))。在给药24小时后采取肺，通过定量RT-PCR测定肺中的干扰素诱导基因(Cxcl10)的mRNA表达量。将结果示于图15。图15中，“RNA(个体1)”、“RNA(个体2)”分别表示两只小型迷你猪的结果。
如图15所示，通过来自青椒的内源RNA病毒的基因组双链RNA(实施例1)，干扰素诱导基因的表达增加。

Claims (13)

1.一种免疫刺激因子产生促进用组合物，其含有来自植物的内源RNA病毒的基因组双链RNA。
2.根据权利要求1所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述植物为辣椒属植物、稻属植物或蚕豆属植物。
3.根据权利要求1或2所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述基因组双链RNA的长度为8～20kbp。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述基因组双链RNA为直链状。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为医药组合物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为经鼻制剂形态。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为口服制剂形态。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其为食品组合物。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为免疫刺激用组合物。
10.根据权利要求1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为抗病毒用组合物。
11.根据权利要求10所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其中，所述病毒为RNA病毒。
12.根据权利要求1～5中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为佐剂。
13.根据权利要求1～8中任一项所述的免疫刺激因子产生促进用组合物，其被用作为癌症的预防或改善用组合物。
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