CN109682971A - 一种保存液及其制备工艺、应用方法 - Google Patents

一种保存液及其制备工艺、应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种保存液及其制备工艺、应用方法。该保存液包括如下重量份数的组分：二水磷酸二氢钠1.45‑1.6份；七水磷酸氢二钠2.58‑2.7份；EDTA二钠2.36‑2.5份；氯化钠8.1‑9份；二硫苏糖醇3‑4份；NH4Cl为8.1‑9份；去离子水1000mL；pH调节剂；保存液的pH值为6.8‑7.2。本发明中的保存液可有效去除取样过程中在细胞样品中携带的细胞粘液、新鲜血液，从而将有效细胞充分释放，在保存过程中，不易让细胞粘液、新鲜血液对有效细胞造成影响，可使最终获得的检测结果达到较为准确的效果。

Description

一种保存液及其制备工艺、应用方法
技术领域
本发明涉及细胞保存液技术领域，更具体地说，它涉及一种保存液及其制备工艺、应用方法。
背景技术
宫颈癌的防止已经成为全球性的公共问题。在检测宫颈癌时，先要对细胞进行取样，此时，取出的细胞样品中难免会带出一些新鲜的血液、细胞粘液，或者在被取出的细胞样品中混杂一些新鲜的血性细胞。在保存过程中，传统的保存液虽然能保持较为稳定的pH值，但与样品细胞混合的细胞粘液、新鲜血液等，其中存在较高含量的蛋白难以被去除，甚至将部分样品细胞中的有效细胞包覆在内。在保存的过程中，传统的保存液仅通过稳定的pH值，难以去除细胞粘液、新鲜血液，从而难以使那部分被包覆的有效细胞从细胞粘液、新鲜血液中被充分释放出来，即在后续检测时，有效细胞的数量少于实际的有效细胞的数量，最终导致检测效果不准确。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种保存液，不仅具有优异的酸碱稳定性，还可将细胞样品携带的细胞粘液、新鲜血液均去除，从而使细胞样品被充分释放，增加检测的准确性。
本发明的第二个目的在于提供一种保存液的制备工艺，使制备获得的保存液具有较好的稳定性，并且有助于维持细胞的渗透压的稳定的优点。
本发明的第三个目的在于提供一种保存液的应用方法，主要适用于非妇科液基细胞，具有较好的针对性，并且使对待检测的有效细胞具有更优异的保存效果的优点。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种保存液，包括如下重量份数的组分：
二水磷酸二氢钠1.45-1.6份；
七水磷酸氢二钠2.58-2.7份；
EDTA二钠2.36-2.5份；
氯化钠8.1-9份；
二硫苏糖醇3-4份；
NH4Cl为8.1-9份；
去离子水1000mL；
pH调节剂；
所述保存液的pH值为6.8-7.2。
通过采用上述技术方案，二水磷酸二氢钠与七水磷酸氢二钠分别具有缓冲作用，当两者进行相互配合使用时，有助于提高其缓冲效果。
EDTA二钠的加入，可使保存液具有较好的抗凝性，不易使细胞样品中带有的新鲜血液发生凝固。
氯化钠的适量加入，则是使保存液达到合适的浓度，当细胞样品加入后，可维持有效细胞的渗透压，有助于使有效细胞保持原始的状态，不易使细胞形态、细胞核形态发生变化。
本发明中加入的二硫苏糖醇、NH4Cl的量均为适量，其中，二硫苏糖醇的作用在于：打断新鲜血液、细胞粘液中的蛋白中的二硫键，破坏蛋白质的结构，从而破坏其稳定性，使细胞样品中的细胞粘液被裂解，从而将被其包覆的有效细胞释放出，有助于维持有效细胞的生物特性，从而提高检测的准确性。NH4Cl为弱酸性，加入后，可使保存液的pH值略微降低，且其加入后，通过在红细胞的细胞膜进行氢氧根/碳酸氢根和氯离子的交换，从而改变红细胞的渗透压，使红细胞胀大破裂，达到裂解红细胞的作用。
因此，在二硫苏糖醇、NH4Cl的相互配合下，有助于将细胞样品中的细胞粘液、新鲜血液充分裂解，从而将有效细胞充分释放，在保存过程中，不易让细胞粘液、新鲜血液对有效细胞造成影响，可使最终获得的检测结果达到较为准确的效果。
且在二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、pH调节剂的共同作用下，使本发明中的保存液的pH值保持在较为稳定的6.8-7.2的范围内，有助于细胞样品处于合适的pH环境下，还可使二硫苏糖醇、NH4Cl能够发挥最好的去除细胞粘液、新鲜血液的作用，有助于将有效细胞被充分释放出。
进一步优选为：包括如下重量份数的组分：
二水磷酸二氢钠1.55-1.6份；
七水磷酸氢二钠2.65-2.7份；
EDTA二钠2.4-2.5份；
氯化钠8.5-9份；
二硫苏糖醇3.5-3.8份；
NH4Cl为8.1-8.5份；
去离子水1000mL；
pH调节剂；
所述保存液的pH值为6.8-7.2。
通过采用上述技术方案，通过研究(试验一)发现，在该范围的各组分之间相互配合形成的保存液，可更有效地去除细胞样品中的细胞粘液、新鲜血液，使有效细胞能得到充分体现；且保存液使保存后的有效细胞的状态以及细胞核的状态分别与刚取样时有效细胞的状态以及细胞核的状态类似，说明可起到更好的保护作用。
进一步优选为：所述pH调节剂为NaOH、HCl中的至少一种。
通过采用上述技术方案，采用NaOH、HCl对整个液相体系进行pH值的调节，进而使保存液的pH值能稳定在6.8-7.2的范围内。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种保存液的制备工艺，包括如下步骤：
步骤一，量取800-900份去离子水，按照重量份数，将二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl加入去离子水中，充分混合，再加入剩余重量份数的去离子水，再次充分混合，获得初混物；
步骤二，向步骤一中获得的初混物中加入pH调节剂，充分混合，调节pH值至6.8-7.2，获得初成品；
步骤三，将步骤二中获得的初成品通过0.22μm的过滤膜过滤处理，获得保存液。
通过采用上述技术方案，先将二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl溶于水中，再加入剩余部分的去离子水，在混合充分的前提下，还能达到省力的效果。在混合均匀后的初混物中加入pH调节剂，有助于使pH值的检测数据更加准确。经过过滤膜过滤后，有助于使获得的保存液的杂质含量降低到最小，从而不易对细胞样品产生不利的影响。
进一步优选为：所述步骤一、步骤二、步骤三中，制备环境的湿度为40-70RH％，温度为25-30℃。
通过采用上述技术方案，在该湿度、温度范围内进行制备保存液，可使制备获得的保存液具有较好的稳定性。且湿度、温度范围较广，降低了对制备的要求，有利于降低制备保存液的成本。
进一步优选为：当保存液不是现做现用时，将保存液置于4℃的环境下进行避光保存。
通过采用上述技术方案，保存液可在适中的温度下避光保存，可有效维持保存液的稳定性，并维持保存液对细胞粘液、新鲜血液中蛋白的裂解作用。
为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：
一种保存液的应用方法，将细胞样品置于保存液中，置于湿度为40-70RH％、温度为25-30℃的环境下进行保存。
通过采用上述技术方案，在采用本发明中的保存液保存细胞样品时，可在常温下进行保存。不需要冷冻保存，检测细胞样品时，也无需进行解冻，因此，使整个保存、检测过程更加顺利。
进一步优选为：所述细胞样品占保存液的质量百分含量的0.5-2.0％。
通过采用上述技术方案，细胞样品的量在上述范围内，既可使细胞样品得到较好的保存，且细胞样品的量适中，有助于合理利用保存液。
进一步优选为：所述细胞样品为宫颈细胞、胸腹水细胞、尿液细胞、痰液细胞等非妇科液基细胞。
通过采用上述技术方案，本发明中的保存液，主要适用于保存非妇科液基细胞，对该类细胞可起到优异的维持原始状态的作用。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
第一、本发明通过采用二硫苏糖醇和NH4Cl共同配合使用，有利于去除取样过程中在细胞样品中携带的细胞粘液、新鲜血液，从而将有效细胞充分释放，在保存过程中，不易让细胞粘液、新鲜血液对有效细胞造成影响，可使最终获得的检测结果达到较为准确的效果。
第二、本发明采用二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠配合起到更好的缓冲作用，并与pH调节剂相互配合，进而使保存液维持稳定的pH值，有助于细胞样品处于合适的pH环境下，还可使二硫苏糖醇、NH4Cl能够发挥最好的去除细胞粘液、新鲜血液的作用，有助于将有效细胞被充分释放出，提高检测的准确性。
第三、本发明中采用的制备工艺简单，且生产成本较低，有助于大力推广。
第四、本发明中的保存液能在湿度为40-70RH％、温度为25-30℃的环境下保存7天，依旧能达到较好的检测效果，且保存条件容易实现，还便于后续的检测操作。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一种保存液，所包括的组分及其相应的质量如表1所示，且通过如下步骤制备获得：
步骤一，称取900g去离子水，将二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl加入去离子水中，充分混合，再加入剩余重量份数的去离子水，再次充分混合，获得初混物；
步骤二，向步骤一中获得的初混物中加入pH调节剂，充分混合，调节pH值至表1中设定的数值，获得初成品；
步骤三，将步骤二中获得的初成品通过0.22μ m的过滤膜过滤处理，获得保存液。
上述制备过程中，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为65RH％，温度为28℃的温度下进行操作。
保存液为现做现用。
表1实施例1-5中所包括的组分及其相应的质量
实施例6：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一中，称取800g去离子水，与二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl充分混合，再加入200g去离子水进行混合。
实施例7：一种保存液，与实施例l的区别在于，步骤一中，称取850g去离子水，与二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl充分混合，再加入200g去离子水进行混合。
实施例8：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为40RH％，温度为30℃的温度下进行操作。
实施例9：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为70RH％，温度为25℃的温度下进行操作。
实施例10：一种保存液，与实施例1的区别在于，当保存液不是现做现用时，将保存液置于4℃的环境下进行避光保存。
对比例1：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤二中，添加pH调节剂调节pH值为4.6。
对比例2：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤二中，添加pH调节剂调节pH值为7.3。
对比例3：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为30RH％，温度为30℃的温度下进行操作。
对比例4：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为70RH％，温度为20℃的温度下进行操作。
对比例5：一种保存液，与实施例1的区别在于，步骤一、步骤二、步骤三在湿度为75RH％，温度为35℃的温度下进行操作。
对比例6：一种保存液，与实施例10的区别在于，当保存液不是现做现用时，将保存液置于20℃的环境下进行避光保存。
对比例7：一种保存液，与实施例10的区别在于，当保存液不是现做现用时，将保存液置于35℃的环境下进行避光保存。
对比例8-12：一种保存液，与实施例1的区别在于，所包括的组分及其对应的质量以及pH值如表2所示。
表2对比例8-12所包括的组分及其对应的质量以及pH值
试验一
试验样品：选取实施例1-10、对比例1-5，8-12作为试验样品。
试验方法：
S1，取样：在阴道扩张器直视下，用棉签拭去宫颈和阴道表面的分泌物；
S2，然后用宫颈刷沿子宫颈外口插入子宫颈管内，顺时针旋转3圈，取出宫颈刷后，取部分细胞样品置于盛有试验样品(实施例1-10和对比例1-5，8-12)的收集管中，且细胞样品占试验样品的质量百分含量的2.0％，旋紧管盖后贴上标签，在和对应的申请单一起送往病理科检查；S3，由TCT诊断专家在不知道具体试验样品的情况下，对不同液基细胞保存液制作的病理标本进行评估，以达到公正客观的目的。
为降低试验误差，实施例1-10、对比例1-5，8-12同一试验样品各采用20组同步进行试验。
采用评估指标和标准对试验结果进行评估，且评估指标和标准如表3所示。
表3评估指标和标准
试验结果：根据评估指标和标准，实施例1-10、对比例1-5，8-12最终获得的评估结果如表4所示。
表4实施例1-10、对比例1-5，8-12最终获得的评估结果
由表4可知，采用实施例1-10保存细胞样品的效果优于采用对比例1-5，8-12保存细胞样品的效果。
对比实施例1-10与对比例1-2，说明保存液的pH值的控制对宫颈细胞的保存具有重要的影响，若pH值没有在合适的范围内，容易导致背景较乱，且因为保存环境过酸/过碱，造成细胞受损，最后保留的细胞量较少且细胞形态不够完整；
对比实施例1-10与对比例3-7，说明制备保存液的外界条件对最后获得的保存液的保存效果具有较大的影响。
对比实施例1-10与对比例8-12，说明二硫苏糖醇、NH4Cl、二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠之间的相互配合会给宫颈细胞的保存带来重大的影响，当其中有至少一种的用量不在合适的范围内则会导致对宫颈细胞的保存效果变差。虽然对比例8的保存效果相对于对比例9-10、12的保存效果稍好一些，这主要是因为对比例8中虽然缺失了二硫苏糖醇、NH4Cl，但二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠还存在并且添加的用量合适，能使对比例8的pH稳定保持好，但对宫颈细胞的保存依然会有影响；对比例9中，不仅二硫苏糖醇、NH4Cl缺失，还缺少了二水磷酸二氢钠，对比例10中，不仅二硫苏糖醇、NH4Cl缺失，还缺少了七水磷酸氢二钠，因此，对比例9和10对宫颈细胞的保存会比对比例8对宫颈细胞的保存的效果更差；对比例11中，二硫苏糖醇、NH4Cl的使用量在正常的范围内，但二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠的用量均过少，难以使二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠与二硫苏糖醇、NH4Cl形成较好的配合，最终导致对比例11的保存效果与实施例1-10相比有所下降；对比例12中，二硫苏糖醇、NH4Cl、二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠的用量均过少，最终造成了其保存效果差的结果。
试验二
试验样品：采用实施例1-10、对比例1-12作为试验样品。
试验方法：采用试验一中的方法，但将每组样品置于湿度为70RH％、温度为30℃的环境下保存7天后，再对每组进行检测，记录并分析结果。
试验结果：将宫颈细胞保存7天后，采用实施例1-10、对比例1-12进行保存的评估结果如表5所示。
表5将宫颈细胞保存7天后，采用实施例1-10、对比例1-12进行保存的评估结果
由表5可知，宫颈细胞在不同的试验样品中分别存放7天后，采用实施例1-10的保存效果优于采用对比例1-12的保存效果。
说明实施例1-10的稳定性高于对比例1-12的稳定性，在湿度为70RH％、温度为30℃的环境下经过较长时间的保存，依然能使总背景干净，且保留全部几乎全部种类、形态完整的宫颈细胞，有利于提高检测的准确性。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种保存液，其特征在于，包括如下重量份数的组分：
二水磷酸二氢钠1.45-1.6份；
七水磷酸氢二钠2.58-2.7份；
EDTA二钠2.36-2.5份；
氯化钠8.1-9份；
二硫苏糖醇3-4份；
NH4Cl为8.1-9份；
去离子水1000mL；
pH调节剂；
所述保存液的pH值为6.8-7.2。
2.根据权利要求1所述的一种保存液，其特征在于，包括如下重量份数的组分：
二水磷酸二氢钠1.55-1.6份；
七水磷酸氢二钠2.65-2.7份；
EDTA二钠2.4-2.5份；
氯化钠8.5-9份；
二硫苏糖醇3.5-3.8份；
NH4Cl为8.1-8.5份；
去离子水1000mL；
pH调节剂；
所述保存液的pH值为6.8-7.2。
3.根据权利要求1所述的一种保存液，其特征在于，所述pH调节剂为NaOH、HCl中的至少一种。
4.权利要求1-3中任意一项所述的一种保存液的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，量取800-900份去离子水，按照重量份数，将二水磷酸二氢钠、七水磷酸氢二钠、EDTA二钠、氯化钠、二硫苏糖醇、NH4Cl加入去离子水中，充分混合，再加入剩余重量份数的去离子水，再次充分混合，获得初混物；
步骤二，向步骤一中获得的初混物中加入pH调节剂，充分混合，调节pH值至6.8-7.2，获得初成品；
步骤三，将步骤二中获得的初成品通过0.22μm的过滤膜过滤处理，获得保存液。
5.根据权利要求4所述的一种保存液的制备工艺，其特征在于，所述步骤一、步骤二、步骤三中，制备环境的湿度为40-70RH%，温度为25-30℃。
6.根据权利要求4所述的一种保存液的制备工艺，其特征在于，当保存液不是现做现用时，将保存液置于4℃的环境下进行避光保存。
7.权利要求1-3所述的一种保存液的应用方法，其特征在于，将细胞样品置于保存液中，置于湿度为40-70RH%、温度为25-30℃的环境下进行保存。
8.根据权利要求7所述的一种保存液的应用方法，其特征在于，所述细胞样品占保存液的质量百分含量的0.5-2.0%。
9.根据权利要求7所述的一种保存液的应用方法，其特征在于，所述细胞样品为宫颈细胞、胸腹水细胞、尿液细胞、痰液细胞等非妇科液基细胞。
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