CN109666047B - 一种钌荧光探针及其制备方法、应用和应用产物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钌荧光探针及其制备方法、应用和应用产物，该荧光探针的结构式如下为：
其制备步骤如下：1)取2,6‑二乙酰基吡啶和4‑羟基苯甲酰肼，以醇类物质作为溶剂进行反应，收集反应生成的沉淀并洗涤，得到配体2,6‑二乙酰基吡啶缩4‑羟基苯甲酰肼；2)取配体2,6‑二乙酰基吡啶缩4‑羟基苯甲酰肼和RuCl3，以醇类物质作为溶剂进行反应，之后对反应后的溶液静置析晶，收集晶体即得到所述的钌荧光探针。该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂，得到抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。该钌荧光探针具有较好的潜在药用价值和检测价值，有望用于各种抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种钌荧光探针及其制备方法、应用和应用产物，属于医药技术领域。
背景技术
癌症(主要指恶性肿瘤)是危害人类健康最严重的疾病之一，在我国最为常见而且危害严重的恶性肿瘤主要有：乳腺癌、宫颈癌、淋巴癌、白血病、肺癌、肝癌等类型(FarrellN,et al.Cancer Res.,1992),而抗肿瘤药物则随着癌症对人类健康的巨大威胁而逐步发展起来。科研工作者经过几十年的研发工作，不同种类、不同功效特点和不同作用机制的抗肿瘤药物已陆续上市并应用于临床治疗和辅助治疗，其中，1965年Rosenberg等发现顺铂具有显著的抗癌活性(RoSenberg,BL,et al.Nature,1969)，开创了无机抗癌药物的先河，并形成了以顺铂、卡铂、奥沙利铂等为代表的系列铂类抗癌药物。因此，进一步设计合成新型铂类抗肿瘤药物是一个热点研究方向，具有重要意义。
另一方面、缩苯甲酰肼类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗疟疾和抗菌等许多生物活性，已有一些缩氨基硫脉类化合物用在癌症治疗方面，例如异烟肼已经用于临床治疗肺结核。目前还未见有以2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼为配体的钌(III)金属探针的合成及其在肿瘤诊疗中的应用的公开报道。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种钌荧光探针及其制备方法、应用和应用产物，该钌荧光探针以2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼为配体，且该钌荧光探针本身既具有荧光又具有抗肿瘤活性，在不改变药物本身结构的条件下用于肿瘤诊疗。
技术方案：本发明提供了一种钌荧光探针，该钌荧光探针为具有式1结构的化合物：
本发明还提供了一种钌荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)取2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼，以醇类物质作为溶剂进行反应，收集反应生成的沉淀并洗涤，得到配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)取配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3，以醇类物质作为溶剂进行反应，之后对反应后的溶液静置析晶，收集晶体即得到所述的钌荧光探针。
其中：
步骤1)所述的2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼的物质的量之比为化学计量比，比例范围为1:2～1:10。
步骤1)所述溶剂的用量以能溶解参加反应的2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼为宜，通常情况下，1mmol的2,6-二乙酰基吡啶或2mmol的4-羟基苯甲酰肼用2～20mL的溶剂来溶解。
步骤1)所述取2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼，以醇类物质作为溶剂进行反应中，具体步骤为将2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼分别用溶剂溶解，再混合在一起反应，或者将2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼混合后再加溶剂。
所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中，醇类物质为甲醇或乙醇中的一种或者混合物。
所述的醇类物质为甲醇时，甲醇的体积浓度为20～80％；所述的醇类物质为乙醇时，乙醇的体积浓度为20～80％；所述的醇类物质为甲醇和乙醇的混合物时，甲醇和乙醇之间的配比为任意配比。
步骤1)和步骤2)所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中，该反应为常温条件下反应或者加热反应，反应的温度范围为20℃～80℃，反应时间为1～24h。
步骤1)所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中优选的，反应的温度范围优选为50℃～溶剂的回流温度，反应时间为1～24h。
步骤1)所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中更优选的，反应的温度范围为60℃～溶剂的回流温度。
所述的加热反应为常规的加热反应或者加热回流反应，优选采用回流反应。
步骤1)所述的收集反应生成的沉淀并洗涤中，采用甲醇、无水乙醇、乙醚或水中的一种或多种对反应生成的沉淀进行洗涤。
步骤2)所述的配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3的物质的量之比为化学计量比，比例范围为1:1～1:10。
步骤2)所述的对反应后的溶液静置析晶中，为了提高产物纯度，优选是将反应所得的反应物先过滤后再收集滤液，最后将滤液进行静置析晶。
步骤2)所述的对反应后的溶液静置析晶是指在0～8℃条件下静置析晶。
步骤2)所述的对反应后的溶液静置析晶的步骤为：在盛装反应后的溶液的容器开口上罩上一层薄膜，然后在薄膜上开设若干个小孔使溶剂缓慢挥发，以获得更大粒的晶体及更高的晶体收率。
步骤2)所述溶剂的用量以能溶解参加反应的配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3为宜，通常情况下，1mmol的配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼或RuCl3用2～10mL的溶剂来溶解。
步骤2)所述取配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3，以醇类物质作为溶剂进行反应中，具体步骤为将配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3分别用溶剂溶解，再混合在一起反应，或者将配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3混合后再加溶剂。
本发明还提供了一种钌荧光探针的应用，该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
本发明还提供了一种钌荧光探针的应用产物，所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、本发明提供的钌荧光探针为以2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼为配体的Ru(III)金属探针，该探针对HepG-2、MCF-7、NCI-H460、T24、Hela和A549肿瘤细胞株都具有显著的体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备；
2、本发明提供的钌荧光探针能够定位在肿瘤细胞的线粒体中，具有较好的潜在肿瘤检测价值，有望用于各种肿瘤检测剂的制备；
3、本发明提供的钌荧光探针本身既具有荧光又具有抗肿瘤活性，在不改变药物本身结构的条件下用于肿瘤诊疗；
4、本发明提供的钌荧光探针的制备方法只需要两步就可以完成，且处理过程相对简单，目标产物纯度高。
说明书附图
图1为钌荧光探针细胞定位细胞核中的激光共聚焦显微镜图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
以下各实施例及实验例中，涉及的简称代表的意思如下：
[Ru(L)Cl2]Cl探针：表示以2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼为配体的钌荧光探针；
L：表示配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
DMSO：二甲基亚飒。
实施例1：
一种钌荧光探针，该钌荧光探针的化学式为[Ru(L)Cl2]Cl，其结构式如式1所示：
上述钌荧光探针的合成路线如下：
具体制备方法如下：
1)将1mmol的2,6-二乙酰基吡啶溶解于10ml的乙醇(溶剂乙醇的浓度为80v/v％)中，于80℃搅拌15min，制得溶液，将上述溶液逐滴滴入10ml加有2mmol 4-羟基苯甲酰肼的乙醇(溶剂乙醇的浓度为80v/v％)溶液中，于80℃回流搅拌反应1h得淡黄色沉淀物，将上述所得淡黄色沉淀过滤后用无水乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)将含有1mmol RuCl3的10ml甲醇(溶剂甲醇的浓度为80v/v％)溶液,滴加到含有1mmol的2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼配体的10ml乙醇(溶剂乙醇的浓度为80v/v％)溶液中，于80℃回流搅拌1h，将反应后溶液过滤到50ml烧杯中，并用保鲜膜封口，针扎20个孔于0℃挥发数日静置析晶，得到深棕色晶体即钌荧光探针。
将所得的黄色晶体进行元素分析、核磁、质谱分析，具体波谱特性如下：
(1)元素分析：
化学式：C23H21Cl3RuN5O4；
元素分析结果为：
计算值：C,43.24；H,3.31；N,10.96；O,10.02；分析值：C,43.29；H,3.22；N,10.90；O,10.12。
(2)核磁分析：
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.71(d,J＝37.2Hz,2H),8.25(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(dd,J＝8.8,2.2Hz,2H),8.06(t,J＝7.8Hz,1H),7.97(d,J＝7.6Hz,1H),7.80(dd,J＝22.7,8.5Hz,2H),7.01(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝4.1Hz,2H),6.88(d,J＝3.8Hz,2H),2.76(s,3H),2.53(s,3H)。
(3)质谱分析
计算值：[Ru(L)Cl2]Cl，637.97；测试值：[Ru(L)Cl2]+，603.00。
本发明所述钌荧光探针(按实施例1所述方法制得)和配体L等的抗肿瘤活性实验：
1)细胞株与细胞培养
肿瘤细胞株HepG-2、MCF-7、NCI-H460、T24、Hela和A549肿瘤细胞株均来自于theAmerican Type Culture Collection((Rockville MD,USA)，细胞在37℃体积浓度为5％孵箱中，用加有10％胎牛血清和100μgmL-1链霉素，100单位每毫升青霉素的RPM-1640培养基培养；
2)细胞生长抑制实验(MTT法)
注：MTT全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料；
将钌荧光探针以DMSO助溶后，使用完全培养基依次稀释成五个梯度，20倍于终浓度的工作液，各梯度之间除药物浓度不同外，助溶剂DMSO等含量均一致。再用直径为0.22um的微孔滤膜过滤除菌置于4℃保存。将对数期的肿瘤细胞株HepG-2、MCF-7、NCI-H460、T24、Hela和A549，以每孔0.18ml分别接种于96孔板，细胞浓度约为0.4～0.5×105孔，培养12h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的受试化合物，每孔20μl，使终浓度分别为0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM和100μM每个梯度设4个复孔，其中DMSO终浓度小于0.5％，同时设置相应的阴性对照组(培养液中只有细胞和等量DMSO，无药物)，每组也设置4个复孔，药物作用48h后，倾去培养液，加入100ul DMSO，平板震荡器震荡10min，使结晶物充分溶解，空白对照组调零，用酶标仪以550nm/655nm双波长测定去除底光吸收值后的吸光度(A)值，以Bliss法分别计算化合物对肿瘤细胞株HepG-2、MCF-7、NCI-H460、T24、Hela和A549的工IC50值,所有实验重复3次。
实验结果见表1，可以看出钌荧光探针对肿瘤细胞HepG-2、MCF-7、NCI-H460、T24、Hela和A549的细胞活性明显高于对应的配体。
表1配体L和钌荧光探针的抗肿瘤活性
本发明所述钌荧光探针(按实施例1所述方法制得)和配体L等的细胞内定位实验：
1)细胞株与细胞培养
肿瘤细胞株A549肿瘤细胞株来自于the American Type Culture Collection((Rockville MD,USA)，细胞在37℃体积浓度为5％孵箱中，用加有10％胎牛血清和100μgmL-1链霉素，100单位每毫升青霉素的RPM-1640培养基培养；
2)钌荧光探针细胞定位实验(注：DAPI全称为4',6-二脒基-2-苯基吲哚)
去除细胞培养液，加入1μl DAPI和37℃预温育的DAPI染色工作液，与细胞37℃共孵育15-45分钟；去除DAPI染色工作液，加入1μl钌荧光探针和37℃预温育的新鲜细胞培养液，与细胞37℃共孵育15-45分钟，随后用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图1所示，DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，能够准确定位细胞核的位置，钌荧光探针在细胞中的分布被DAPI在细胞中的分布包含，这说明钌荧光探针分布在细胞核中。
一种钌荧光探针的应用，该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
一种钌荧光探针的应用产物，所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
实施例2：
一种钌荧光探针，该钌荧光探针的化学式为[Ru(L)Cl2]Cl，其结构式如式1所示：
上述钌荧光探针的合成路线如下：
具体制备方法如下：
1)将1mmol的2,6-二乙酰基吡啶溶解于10ml的乙醇(溶剂乙醇的浓度为20v/v％)中，于80℃搅拌15min，制得溶液，将上述溶液逐滴滴入10ml加有10mmol 4-羟基苯甲酰肼的乙醇(溶剂乙醇的浓度为20v/v％)溶液中，于80℃回流搅拌反应24h得淡黄色沉淀物，将上述所得淡黄色沉淀过滤后用无水乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)将含有10mmol的RuCl3的2ml甲醇(溶剂甲醇的浓度为20v/v％)溶液,滴加到含有1mmol的2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼配体的10ml乙醇(溶剂乙醇的浓度为20v/v％)溶液中，于80℃回流搅拌24h，将反应后溶液过滤到50ml烧杯中，并用保鲜膜封口，针扎20个孔于8℃挥发数日静置析晶，得到深棕色晶体即钌荧光探针。
一种钌荧光探针的应用，该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
一种钌荧光探针的应用产物，所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
实施例3：
一种钌荧光探针，该钌荧光探针的化学式为[Ru(L)Cl2]Cl，其结构式如式1所示：
上述钌荧光探针的合成路线如下：
具体制备方法如下：
1)将1mmol的2,6-二乙酰基吡啶溶解于10ml的乙醇(溶剂乙醇的浓度为50v/v％)中，于60℃搅拌15min，制得溶液，将上述溶液逐滴滴入10ml加有5mmol 4-羟基苯甲酰肼的乙醇(溶剂乙醇的浓度为50v/v％)溶液中，于60℃回流搅拌反应12h得淡黄色沉淀物，将上述所得淡黄色沉淀过滤后用无水乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)将含有5mmol RuCl3的10ml甲醇(溶剂甲醇的浓度为50v/v％)溶液,滴加到含有1mmol的2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼配体的10ml乙醇(溶剂乙醇的浓度为50v/v％)溶液中，于60℃回流搅拌2h，将反应后溶液过滤到50ml烧杯中，并用保鲜膜封口，针扎20个孔于4℃挥发数日静置析晶，得到深棕色晶体即钌荧光探针。
一种钌荧光探针的应用，该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
一种钌荧光探针的应用产物，所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
实施例4：
一种钌荧光探针，该钌荧光探针的化学式为[Ru(L)Cl2]Cl，其结构式如式1所示：
上述钌荧光探针的合成路线如下：
具体制备方法如下：
1)将1mmol的2,6-二乙酰基吡啶溶解于10ml的乙醇(溶剂乙醇的浓度为70v/v％)中，于40℃搅拌15min，制得溶液，将上述溶液逐滴滴入10ml加有7mmol 4-羟基苯甲酰肼的乙醇(溶剂乙醇的浓度为70v/v％)溶液中，于40℃回流搅拌反应18h得淡黄色沉淀物，将上述所得淡黄色沉淀过滤后用无水乙醇和乙醚各洗3次，干燥后，得配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)将含有7mmol RuCl3的20ml甲醇(溶剂甲醇的浓度为70v/v％)溶液,滴加到含有1mmol的2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼配体的20ml乙醇(溶剂乙醇的浓度为70v/v％)溶液中，于40℃回流搅拌2h，将反应后溶液过滤到50ml烧杯中，并用保鲜膜封口，针扎20个孔于4℃挥发数日静置析晶，得到深棕色晶体即钌荧光探针。
一种钌荧光探针的应用，该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
一种钌荧光探针的应用产物，所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种钌荧光探针，其特征在于：该钌荧光探针为具有式1结构的化合物：
2.一种如权利要求1所述的钌荧光探针的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)取2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼，以醇类物质作为溶剂进行反应，收集反应生成的沉淀并洗涤，得到配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼；
2)取配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3，以醇类物质作为溶剂进行反应，之后对反应后的溶液静置析晶，收集晶体即得到所述的钌荧光探针；
其中步骤1)所述的2,6-二乙酰基吡啶和4-羟基苯甲酰肼的物质的量之比为化学计量比，比例范围为1:2～1:10；步骤2)所述的配体2,6-二乙酰基吡啶缩4-羟基苯甲酰肼和RuCl3的物质的量之比为化学计量比，比例范围为1:1～1:10。
3.如权利要求2所述的一种钌荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中，醇类物质为甲醇或乙醇中的一种或者混合物。
4.如权利要求3所述的一种钌荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的醇类物质为甲醇时，甲醇的体积浓度为20～80％；所述的醇类物质为乙醇时，乙醇的体积浓度为20～80％；所述的醇类物质为甲醇和乙醇的混合物时，甲醇和乙醇之间的配比为任意配比。
5.如权利要求2所述的一种钌荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述的以醇类物质作为溶剂进行反应中，反应温度范围为20℃～80℃，反应时间为1～24h。
6.如权利要求2所述的一种钌荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)所述的收集反应生成的沉淀并洗涤中，采用甲醇、无水乙醇、乙醚或水中的一种或多种对反应生成的沉淀进行洗涤。
7.如权利要求2所述的一种钌荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的对反应后的溶液静置析晶是指在0～8℃条件下静置析晶，具体步骤为：在盛装反应物的容器开口上罩上一层薄膜，然后在薄膜上开设若干个小孔使溶剂缓慢挥发。
8.一种如权利要求1所述的钌荧光探针的应用，其特征在于：该钌荧光探针应用于制备抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
9.一种如权利要求1所述的钌荧光探针的应用产物，其特征在于：所述的应用产物为该钌荧光探针作为活性成分制备得到的抗肿瘤药物或者肿瘤检测剂。
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