CN109644988B - 一种减轻器官移植术后感染的机械灌注系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种机械灌注系统，其特征在于，所述机械灌注系统包含氧化石墨烯和抗菌肽制备的涂层，具体的，所述灌注系统包括器官灌注液存储器和器官存储装置，所述器官灌注液存储器和器官存储装置包含氧化石墨烯和抗菌肽，氧化石墨烯和抗菌肽制备成涂层涂覆于器官灌注液存储器和器官存储装置的内壁。本发明的机械灌注系统能减轻器官移植的术后感染现象，且能够为器官提供稳定的内环境，具有良好的市场前景和社会公益价值。

Description

一种减轻器官移植术后感染的机械灌注系统

技术领域

本发明属于医疗器械设计制造技术领域，具体涉及一种可以抑制移植术后感染的机械灌注系统。

背景技术

器官移植是目前治疗终末期器官功能衰竭的最有效手段。由于免疫抑制剂的不断发展、器官移植保存技术的提高和受、供体之间良好的配型,使移植患者的生活质量得到明显提高。随着大量新型高效免疫抑制剂的临床应用,排斥反应发生率呈逐年下降趋势。随着常温灌注系统的不断改进以及灌注液技术的不断发展，使器官在转移，运输过程中热缺血状况的到改善，从而使移植手术的并发症包括胆道并发症、血管并发症已经较少发生,然而，感染的发生率尤其是严重感染后死亡率并没有得到显著控制,感染是器官移植术后早期最常见的并发症之一,也是主要的致死原因。感染、呼吸功能衰竭、肾功能衰竭已成术后并发症和死亡的主要原因,其中感染的发生率最高,在36％-80％之间,平均每人感染0.5-2.0次。肾脏移植早期感染率高达40％-78％,一年内感染的死亡率高达20％-40％，严重感染是造成近期(术后1年)和远期肾脏移植受者带功死亡的首位原因,分别占60.6％和35％。通常，在器官移植的过程中，各种感染尤其机会致病菌感染的发生率明显增加。目前认为，导致移植患者是否发生感染有两个因素，一是患者机体的净免疫抑制状态水平，二是在移植过程，患者以及移植的供体器官在环境致病原中的暴露程度。器官在移植过程中，供体器官需要进行相应的灌注，保存和运输，供体器官在这个过程中，会与外界环境进行接触，极易感染和携带相应的病原菌，加上移植术后，为了防止排异反应的出现，会大量的使用免疫抑制药物，使患者自身的免疫功能处于较低的水平，从而极易出现严重感染。目前，如何降低器官移植术后的感染，是器官移植技术所面临的技术难题之一。

目前，通过对器官移植术后感染发生病原菌分布的研究发现，术后感染发生感染病原菌以革兰阴性(G^-)菌居多，常见分离菌为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae，KP)、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、嗜麦芽窄食单胞菌，革兰阳性(G⁺)菌中最常见，其次为屎肠球菌。通常对于移植术后感染的治疗采用抗生素的联用使用，例如，轻中度产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科菌感染可结合药敏结果选用哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦等，疗效不佳时可改为碳青霉烯类；重症感染宜首选碳青霉烯类，经治疗临床稳定后可降阶梯为β-内酰胺类抗菌药/β-内酰胺酶抑制剂合剂。然而，随着抗生素的不断使用，感染的细菌出现了严重的耐药性，从而导致术后利用抗生素治疗的手段效果欠佳。

二十世纪九十年代，生物学家在用微生物诱导天蚕蛹时发现天蚕蛹的免疫系统产生了一种多肽类物质，该多肽物质具有杀菌活性。科学家命名此多肽为天蚕素(Ceropins)，天蚕素作为世界上第一个抗菌肽正式被人们所认识。自此，生物体的天然免疫引起了广大学者的研究与关注。在短短的几十年里，人们已经从微生物、动植物、人体等发现了不同种属的天然抗菌肽。目前，经发现的天然抗菌肽的数量已经远远超过了1000种。天然抗菌肽的氨基酸残基数目一般为15-50个，并且具有加热后稳定性高，在水中溶解性较好等优点。抗菌肽广泛分布于自然界中，具有广谱抗菌性，很多抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌具有杀菌作用，而且对某些真菌、原生生物，甚至肿瘤细胞和病毒也具有一定的抑制作用，而且部分天然抗菌肽同时又对真核细胞毒副性较小。由于其独特的抗菌机制，不容易诱发细菌的耐药性，有望成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。

石墨烯是碳原子呈六元环排列而形成的单原子层厚度的二维晶体。2004年，单层石墨烯被Novoselov和Geim成功地从石墨中分离出来，自此之后，石墨烯成为科学界万众瞩目的焦点。石墨烯的光学、电学和热学性能都是非凡的，其在各个科学领域都引起了人们极大的兴趣，现今在很多方面(如：纳米电子器件、透明导电膜)已取得明显的进展[4-5]。对单层石墨烯的研究同时也引起了人们对其他碳基材料的关注，其中最引人瞩目的是氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)。GO是带有含氧官能团的石墨烯衍生物，是石墨在酸性条件下被氧化而得到的，基面和边缘带有羟基、环氧基和羧基。GO具有良好的水分散性，在一些有机溶剂中也可稳定分散，其基面和边缘带有的含氧官能团丰富了石墨烯的表面活性，使其易于被修饰和功能化，加之其巨大的比表面积和良好的生物相容性，GO比其他碳基材料拥有更多潜在的优势，这些富有吸引力的独特性能使GO非常适合应用于生物医学领域，成为当下最具前景的材料之一。

器官在移植过程中，通常利用机械灌注仪器对其进行保存，机械灌注保存仪器的工作原理是应用可控的连续保存液来消除代谢产物，并给器官提供营养和氧分，换而言之，灌注仪内环境的模拟是离体器官成功保存的关键。因此，灌注仪内部的温度稳定性以及灌注仪内部材料的生物相容度、抗菌性对于器官存活与功能的发挥有至关重要的作用。传统灌注仪通常采用树脂作为箱体设计材料。树脂虽然具有较好的隔温效果，减少外界环境温度的影响，但是，灌注液在内部进行灌注的过程也会带来温度的变化，由于树脂的导热效率较差，导致灌注仪的温控系统对内部进行控温时，容易出现大惯性、大时滞和非线性的温度变化，从而影响器官的状态。同时，对于防止细菌感染而言，传统都是在灌注液中加入抗生素，如碳青霉烯类、替加环素、多黏菌素、磷霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、具有抗假单胞菌属的β-内酰胺类、含舒巴坦的制剂等等，但是，常用的抗生素无论是在灌注液中使用，还是在术后施用于患者，都面临着细菌抗药性的问题。

因此，获得一种内部温度稳定且能够在器官灌注过程中防止细菌侵染，从而抑制移植术后感染的机械灌注系统，是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的器官移植手术容易出现术后感染，且感染细菌耐药性强，利用抗生素治疗效果欠佳的问题，以及在机械灌注系统工作过程中内部温度稳定性不高的问题，本发明的发明人通过利用氧化石墨烯和抗菌肽制备的涂层用于制备机械灌注系统，能够很好的解决上述问题，鉴于此，本发明提供了一种机械灌注系统，其特征在于，所述机械灌注系统包含氧化石墨烯和抗菌肽制备的涂层，具体的，所述灌注系统包括器官灌注液存储器和器官存储装置，所述器官灌注液存储器和器官存储装置包含氧化石墨烯和抗菌肽，优选的，氧化石墨烯和抗菌肽制备成涂层涂覆于器官灌注液存储器和器官存储装置的内壁。

在一个实施方式中，所述机械灌注系统包括中央处理器组件，动力组件，器官存储组件，液体循环组件，监测组件和液体收集组件，所述液体循环组件包含器官灌注液存储器，所述器官灌注液存储器中存储有器官灌注液，所述器官灌注液可以是本领域常用的器官灌注液，例如，UW-G，HTK灌注液，Celsior灌注液等，所述灌注液中可以加入相应的活性物质，防止器官的缺血再灌注损伤，例如柚皮素-7-O-乙酸酯，优选的，所述灌注有可以是具有特定成分的灌注液，如柚皮素衍生物常温肝脏灌注液，其成分为柚皮素-7-O-乙酸酯325mg、羟基淀粉2.6g、三磷酸腺苷30g、人工血液36g、卵磷脂4g、半乳糖苷酶1.25mg，乙酰半乳糖胺酶1.25mg，胰岛素43u、复方氨基酸注射液18AA 150ml、抗生素2.5g、葡萄糖28g、生理盐水200ml、10％氯化钾15ml、5％碳酸氢钠25ml、10％氯化钙20ml，维生素B12 4.2mg、维生素E3.6mg、维生素C 2.5mg、地塞米松4.6mg、前列地尔10μg，所述溶剂为水。

在一个实施方式中，所述中央处理器组件与监测组件连接，用于处理监测组件所收集的数据信息。

在一个实施方式中，所述中央处理器组件与动力组件连接和液体循环组件连接，用于控制动力组件输出的功率，以控制灌流的灌注液的灌注方式，灌注压力，灌注流速，灌注的温度以及灌注液氧合效率。

在一个实施方式中，所述中央处理器组件与器官存储组件连接，用于控制灌注过程中的温度。

在一个实施方式中，所述监测组件与液体循环组件和器官存储组件连接，用于监控和收集灌注过程中的温度、灌注液的灌注方式、灌注压力和灌注流速的数据信息。

在一个实施方式中，所述动力组件与液体循环组件连接，用于给灌注液提供动力。

在一个实施方式中，所述液体循环组件与器官存储组件连接，用于将灌注液传输给离体保存器官，并过滤灌注液用于循环使用。

在一个实施方式中，所述动力组件包括灌注动力装置，优选的，所述灌注动力装置为蠕动泵或滚压泵，或是本领域常用的人造血泵，例如，气动式血泵，电液式血泵等。所述灌注动力装置可以提供持续性灌注动力，或脉冲式灌注动力。

在一个实施方式中，所述器官存储组件包括器官存储装置，所述器官存储装置具体为器官存储，其包括内层和外层，内层和外层之间的夹层中包括温度调节装置，优选地的，所述温度调节装置为夹层中的冷热调节管。所述温度调节装置中设置有温度监控装置，所述温度监控装置与中央处理器连接，用于收集器官存储装置温度信息和控制收集器官存储装置中的温度。优选的，所述外层为保温材料制备，所述保温材料优选为树脂，例如ABS树脂。所述内层由导热材料制备，导热材料为导热金属，优选为铝合金，所述导热材料表面覆盖有涂层，所述涂层包含氧化石墨烯和抗菌肽。

在一个实施方式中，所述液体循环组件包括供氧装置，所述供氧装置优选为膜氧合器，人工肺或膜肺，供氧装置的作用在于向灌注液提供氧气，使灌注液成为氧合灌注液，在灌注的过程中为器官细胞提供维持生理功能的氧气。

在一个实施方式中，所述液体循环组件还包括灌注液过滤装置和灌注液输送通道。所述灌注液过滤装置用于过滤灌注液中的杂质和器官产生的代谢废物，所述灌注液经过滤后循环使用。

在一个实施方式中，所述液体循环组件还包括灌注液输送通道。所述灌注输送通道包括输入导管和输出导管，用于向离体保存器官输入新鲜的器官灌注液和从离体保存器官中输出灌注液。优选的，所述液体循环组件中的器官灌注液存储器通过输入导管与器官存储组件中的器官存储装置连接。

在一个实施方式中，所述监测组件包括温度传感器、压力传感器、流速传感器，用于监控灌注过程中的温度、灌注液的灌注压力、灌注流速。

在一个实施方式中，所述中央处理器组件包括控制组件和数据处理组件，用于处理监测组件的所监测的各项数据以及控制灌注过程中的温度、灌注液的灌注压力、灌注流速和氧合效率。进一步，所述的中央处理器还包括信息传输装置，可以将所述监测组件监测到的数据参数，无线的传递给外部对应的接收装置。

在一个实施例方式中，所述液体循环组件还包括器官灌注液存储器，所述器官灌注液存储器包括温度调节装置，优选地的，所述器官灌注液存储器包括内层和外层，内层和外层之间的夹层中包括温度调节装置，优选地的，所述温度调节装置为夹层中的冷热调节管。优选的，所述外层为保温材料制备，所述保温材料优选为树脂，例如ABS树脂。所述内层由导热材料制备，导热材料为导热金属，优选为铝合金，所述导热材料表面覆盖有涂层，所述涂层包含氧化石墨烯和抗菌肽。

在一个实施方式中，所述氧化石墨烯为还原型氧化石墨烯，其通过氧化石墨烯与一水合肼反应获得。

在一个实施方式中，所述抗菌肽为融合多肽，优选为天蚕素A和死亡素的融合多肽。天蚕素A(cecropin A)来自于家蚕，为阳离子型抗菌肽，其蛋白结构为双亲α螺旋结构，具有广谱的杀菌能力，热稳定性好且对正常细胞无杀灭作用。有研究发现，天蚕素A的N端序列对于其抗菌活性具有重要作用。天蚕素A的序列为rwkifkkiek mgrnirdgiv kagpaievlgsakai。死亡素(Thanatin)是在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculi ventris)中发现的小分子抗菌肽，结构简单，对革兰阳性菌、革兰阴性菌和某些真菌都有抑制作用。所述死亡素的序列为gskkpvpiiy cnrrtgkcqr m。将天蚕素A的第1-7个氨基酸残基及死亡素的第4-19个氨基酸残基进行融合，制备成融合多肽，其序列为rwkifkkkpvpiiycnrrtgkcq。所述融合多肽对于鲍曼不动杆菌、产酸克雷伯菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍德菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等细菌具有良好的抑制效果(“复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究”，杨桂茂等，国际检验医学杂志，2018年6月，第39卷第12期，1439-1442)。

在一个实施方式中，所述融合多肽为天蚕素A和死亡素的融合多肽(rwkifkkkpvpiiycnrrtgkcq)的衍生序列，优选为与所述融合多肽具有60％、70％、80％、90％、95％、99％同一性的序列，或是具有一个或多个，例如，2个，3个，4个，5个，氨基酸突变的序列。

通常，含有精氨酸的抗菌肽相比含有赖氨酸的抗菌肽有更高的抗菌活性，含有色氨酸的抗菌肽比含有苯丙氨酸的抗菌肽更能有效的与细菌细胞膜结合。这可能是因为精氨酸相比于赖氨酸,氨基上的正电荷离域程度更大，有可能会增强与带负电荷的细菌膜的静电吸引作用。因此，在一个实施方式中，将天蚕素A和死亡素融合多肽(rwkifkkkpvpiiycnrrtgkcq)序列的第3位、第7位，第8位的赖氨酸(k)替换为精氨酸(r)，将第5位的苯丙氨酸(f)替换为色氨酸(w)，从而获得抗菌肽：rwriwkrrpvpiiycnrrtgrcq。

在一个实施方式中，所述抗菌肽的通过多肽合成的方式进行制备，例如，液相合成法，固相合成法，Fmoc法，tBoc法等，或采用多肽合成仪，例如，美国ABI公司的ABI336型多肽合成仪。还可以采用本领域常规基因工程操作，在宿主细胞内进行重组表达，例如，在酵母表达体系中进行制备，如文献“复合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其活性研究”，杨桂茂等，国际检验医学杂志，2018年6月，第39卷第12期，1439-1442，所公开的方法。

在一个实施方式中，所述涂层的制备方法为：

1)、将导热材料浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，pH值到8-8.5，常温下反应16小时后，用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层；

2)、将步骤1)制备的材料，浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应3-6小时，用蒸馏水清洗，干燥，得到多聚赖氨涂层；

3)、将氧化石墨烯与一水合肼反应，获得还原型氧化石墨烯，将还原型氧化石墨烯制备成0.1mg/ml的溶液，加入的浓度为2.5mg/ml的抗菌肽溶液中，还原型氧化石墨烯和抗菌肽的体积比为1:1-1:4；充分混合2-4h后，离心重新分散，获得负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯溶液；

4)、将步骤2)制备的材料浸没于步骤3)制备的溶液中，吸附15-45min，蒸馏水清洗，获得单层载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层；重复步骤4)4-6次，优选为5次，获得导热材料上覆盖多层负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层。

优选的，所述还原型氧化石墨烯和抗菌肽的体积比为1:2.5。

在一个实施方式中，所述机械灌注系统可以用于保存离体器官，优选的，器官选自心脏，肝脏，肾脏，胰腺，骨髓，所述机械灌注系统可以减轻器官移植的术后感染。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：本发明的机械灌注系统的器官灌注液存储器和器官存储装置的外层为保温材料制备，能够很好隔绝外部环境对系统内部的影响，内层为导热材料制备并覆盖氧化石墨烯负载抗菌肽的涂层，石墨烯具有良好的导热性，能够使温控系统迅速的对内部温度进行控制，减少温度的波动，为器官提供良好的温度环境。氧化石墨烯生物相容性高，对细胞无毒无害，其负载的抗菌肽对病原菌具有良好的抑制作用且不存在耐药性问题，防止器官在灌注过程中受到病原菌的侵染。本发明的机械灌注系统能减轻器官移植的术后感染现象，且能够为器官提供稳定的内环境，具有良好的市场前景和社会公益价值。

附图说明

图1：氧化石墨烯负载抗菌涂层表面形貌和断口组织的形貌SEM图，其中图1a为表面形貌，图1b为断口组织的形貌；

图2：细菌在GO-CT-1-C涂层表面和对照组表面培养后的平板菌落图，其中，图2a为铜绿假单胞菌对照组表面培养后的平板菌落图；图2b为铜绿假单胞菌在GO-CT-1-C涂层表面培养后的平板菌落图；图2c为肺炎克雷伯菌对照组表面培养后的平板菌落图；图2d为肺炎克雷伯菌在GO-CT-1-C涂层表面培养后的平板菌落图；图2e为金黄色葡萄球菌对照组表面培养后的平板菌落图；图2f为金黄色葡萄球菌在GO-CT-1-C涂层表面培养后的平板菌落图；

图3：内皮细胞在GO-CT-1-C涂层表面培养后的荧光染色图；

图4：本发明用于器官保存的机械灌注系统的示意图，其中1:中央处理器组件，2：蠕动泵，3：器官灌注液存储器，4：输入导管C，5：膜氧合器，6：输入导管A，7：输入导管B，8：器官存储装置，9：输出导管A，10：灌注液过滤装置，11：输出导管B；12：液体收集装置，13：液体计量器，14：器官常温机械灌注系统，15：监控数据收集装置，16：温度传感器，17：压力传感器，18：流速传感器，19：数据处理装置，20：控制组件，21：信息传输装置；

图5：肝脏灌注液存储器或肝脏存储装置结果示意图，其中，22：冷热调节管，23：ABS树脂，24：铝合金，25：涂层GO-CT-1-C。

具体实施方式

以下通过本发明的最佳实施方式对本发明的用于器官保存的机械灌注系统的构成和效果进行详细说明，但是，以下内容不应理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1复合抗菌肽的制备

采用多肽合成法对突变的复合抗菌肽进行合成，合成的多肽命名为CT-1。多肽合成的采用F-moc全自动固相合成法，具体方法如下：

1.1多肽的合成

使用433A自动合成器(ABI,Foster City,CA)的模型在树脂上组装受保护的多肽。室温下，肽树脂在悬浮液中孵育2.5小时，脱保护基。悬浮液体系是由10毫升TFA、0.75克苯酚、0.25毫升的1,2-乙二硫醇、0.5毫升的苯甲硫醚和0.5毫升的水组成的。通过过滤，从多肽去保护基混合物中分离树脂。粗多肽在150ml预冷的乙醚溶液中沉淀，并以10％冰醋酸作为洗脱剂在葡聚糖凝胶G-25柱中进行层析纯化。随后，含有多肽的组分被汇集并冻干，并使用高效液相色谱法测得粗多肽的纯度为80％左右。

1.2多肽纯化和表征

将滤液直接上样至Zorba的C18液相色谱柱，其中使用的是制备高效液相色谱泵(Waters 2000series,Milford,MA)。C18柱先使用缓冲液A(0.1％TFA的水溶液)预清洗柱，随后采用10-40％缓冲液B(0.1％TFA的乙氰溶液)，以8mL/min的速度进行40分钟线性梯度洗脱。得到的馏分是含90％的CT-1的浓缩液，随后采用装上9.4×250mm Zorbax C18液相色谱柱的半制备的反相高效液相色谱进行进一步纯化。最后，在葡聚糖凝胶G-25层析柱中以20％乙酸溶液为洗脱液，将终产物从TFA盐溶液中转换至乙酸盐溶液中。多肽的纯度是由分析型的反相高效液相色谱进行评估的，得到的终产物-多肽的纯度为98％。

用Ultraflex III TOF/TOF质谱仪对多肽的序列组成进行确定。制备获得的多肽序列如表1所示，

表1：制备获得的多肽序列

名称	序列
		CT-1	rwriwkrrpvpiiycnrrtgrcq

实施例2覆盖氧化石墨烯负载抗菌肽涂层的导热材料的制备

本实施中先制备还原型氧化石墨烯负载抗菌肽涂层，在利用自组装方式，将涂层涂覆至导热材料表面，其中，导热材料选用铝合金，获得覆盖氧化石墨烯负载抗菌肽涂层的铝合金材料，具体制备方法如下：

2.1导热材料的表面修饰

将清洗干燥后的铝合金，首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到-8.5，常温下反应过夜后用，蒸馏水充分清洗后，室温干燥，干燥，上述步骤重复三次，使铝合金表面修饰有聚多巴胺，然后将表面修饰有聚多巴胺的铝合金材料浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应5小时，取出后用蒸馏水充分清洗，室温干燥，获得表面修饰有多聚赖氨酸的铝合金材料。

2.2负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯溶液的制备

首先配置0.1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取100ml氧化石墨烯溶液加入1mg一水合肼，80℃充分搅拌反应2小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.2mg/ml的溶液；

将实施例1中制备的复合抗菌肽配制成2.5mg/ml的复合抗菌肽溶液中，将还原氧化石墨烯溶液加入到复合抗菌肽溶液，其中还原型氧化石墨烯和抗菌肽的体积比为1:1-1:4；充分混合3.5h后，离心重新分散，获得负载复合抗菌肽的还原型氧化石墨烯溶液。

2.3覆盖氧化石墨烯负载抗菌肽涂层的导热材料的制备

将2.1)制备的面修饰有多聚赖氨酸的铝合金材浸没于步骤2.2)制备的溶液中，室温吸附30min，蒸馏水清洗，干燥，获得单层载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层；重复该步骤5次，获得表面覆盖多层负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层的铝合金材料。

2.4扫描电子显微镜(SEM)分析

采用JSM-6010PLUS/LV扫描电子显微镜观察氧化石墨烯片和未经处理的硅橡胶基体形貌，加速电压分别为10kV和20kV。采用JSM-6700F场发射扫描电子显微镜观察2.3中制备的氧化石墨烯涂层表面形貌和断口组织的形貌结构(加速电压为10kV)。测试前，样品表面先喷金处理。

如图1所示，铝合金材料形成的表面覆盖多层负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层，可观察到氧化石墨烯的特征褶皱结构，具有锋利的边缘；从断口组织形态可以看出，铝合金材料表面形成了一定厚度的涂层。

实施例3不同比例的复合抗菌肽和氧化石墨烯制备的涂层的抗菌效果比较

在本实施例中，为了探究不同比例的复合抗菌肽和氧化石墨烯制备的涂层的抗菌效，摸索出复合抗菌肽和氧化石墨烯的最佳浓度配比，分别以复合抗菌肽和还原型氧化石墨烯体积比为1：1，1:2，1:2.5，1:3的浓度，实施例2的方法制备相应的涂覆涂层的铝合金材料GO-CT-1-A、GO-CT-1-B、GO-CT-1-C、GO-CT-1-D，实验设置对照组为未涂覆涂层的铝合金材料，具体如表2所示表2：不同抗菌肽和石墨烯配比的涂层制备

3.1抗菌性测定

通过平板计数法对GO-CT-1-A、GO-CT-1-B、GO-CT-1-C、GO-CT-1-D、对照组的抗菌性进行测定，具体步骤为：

将铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌(S.aureus)分别作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的典型菌种来测试样品的抗菌性。每次抗菌实验之前，所有的玻璃器皿、磷酸缓冲溶液(PBS)都要在120℃下进行高压蒸汽灭菌。

将200μL浓度为10⁶cfu/mL的细菌溶液分别滴在GO-CT-1-A、GO-CT-1-B、GO-CT-1-C、GO-CT-1-D，使细菌溶液铺展在样品表面，随后在37℃下超声震荡培养3h。

用10mL PBS将超声震荡培养后样品表面的细菌冲洗下来，取100μL冲洗下来的细菌溶液均匀地涂在固体培养基表面，并将其置于37℃恒温培养箱，培养18～24h后，观察培养基表面菌落的生长情况，对同抗菌肽和石墨烯配比的涂层抗菌性能评价。

具体实验结果如表3和图2所示

表3：不同配比的涂层抑菌率比较

从表3的结果可以看出，相比于对照组，涂覆有抗菌肽和氧化石墨烯涂层的导热材料对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果，特别是抗菌肽和氧化石墨烯的质量比为1:62.5所制备的抗菌涂层，对于革兰氏阴性菌均有90％以上的抗菌率，对于革兰氏阳性菌也能达到70％左右的抑菌率，取得了较好的效果。

实施例4GO-CT-1-C的生物相容性检测

本实施例中，为了检测抗菌肽和氧化石墨烯涂层的生物相容性，以涂覆有抗菌肽和氧化石墨烯的质量比为1:62.5所制备的抗菌涂层的导热材料作为基板，对内皮细胞进行培养，进一步利用活死细胞染色试剂观察内皮细胞的生长情形，具体实验操作如下。

4.1细胞毒性检测

将细胞以2ⅹ10⁴的密度接种到覆盖有涂层的导热材料表面，培养3天，培养结束后用PBS漂洗三次，用活死染色剂在37℃恒温培养箱中避光染色1小时，1小时后用PBS漂洗2次，然后用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞，拍照。

4.2实验结果

如图3所示，可以看到内皮细胞在涂层表面生长情况更为良好，且没有观察到死细胞，表明涂层对内皮细胞的正常生长繁殖没有明显影响，初步判断涂层对内皮细胞没有表现出明显的细胞毒性作用。

实施例5利用涂覆GO-CT-1-C的导热材料制备器官灌注系统

在本实施例中，利用涂覆GO-CT-1-C的导热材料制备器官灌注系统，该灌注系统可以适用于肝脏的离体常温机械灌注，具体构造如下：

如图4、5所示，在灌注系统14中，中央处理器组件1与蠕动泵2连接，通过中央处理器组件1中的控制组件20控制蠕动泵的输出功率，所述蠕动泵2通过输出功率的变化控制灌注液的灌注压力和流速，进一步，蠕动泵2与肝脏灌注液存储器3连接，所述肝脏灌注液存储器3为内外两层，夹层设置有冷热调节管22。所述外层为ABS树脂23制备。所述内层由铝合金24制备，内层面向腔体一侧涂覆有实施例3中制备的涂层GO-CT-1-C 25，具体构造如图5所示。所述冷热调节管22由控制组件20控制，用于调节灌注液的温度；肝脏灌注液存储器3中设置有温度传感器16，用于监控肝脏灌注液的温度；肝脏灌注液存储器3通过输入导管C4与膜氧合器5连接，肝脏灌注液存储器3与膜氧合器5之间设置有流速传感器18，用于监控肝脏灌注液的总流速，所述膜氧合器5的氧合效率通过中央处理器组件1中的控制组件20进行控制；膜氧合器5通过输入导管A 6和输入导管B 7与肝脏存储装置8连接，所述输入导管A 6为肝动脉灌注导管，其上设置有流速传感器18和压力传感器17，用于监控肝动脉灌注的流速和灌注液压力；所述输入导管B 7为门静脉输入导管，其上同样设置有流速传感器18和压力传感器17，用于监控门静脉灌注的流速和灌注液压力；肝脏存储装置8中设置有开口，输入导管A 6和输入导管B 7可以进入肝脏存储装置8内部与离体保存的肝脏连接。所述肝脏存储装置8为内外两层，夹层设置有冷热调节管22。所述外层为ABS树脂23制备。所述内层由铝合金24制备，内层面向腔体一侧涂覆有实施例3中制备的涂层GO-CT-1-C 25，具体构造如图5所示。所述冷热调节管22由控制组件20控制，用于调节肝脏存储装置8的内环境温度；肝脏存储装置8中设置有温度传感器16，用于监控内环境温度。

所述肝脏存储装置8通过输出导管A 9与灌注液过滤装置10连接，肝脏存储装置8中设置有开口，输出导管A 9可以进入肝脏存储装置内部与离体保存的肝脏连接；所述灌注液过滤装置10与肝脏灌注液存储器3连接，将过滤完成的灌注液回送至肝脏灌注液存储器3；所述肝脏存储装置8通过输出导管B 11与液体收集装置12连接，用于收集肝脏在灌注过程中分泌的胆汁；所述液体收集装置12中设置有液体计量器13，用于计量肝脏在灌注过程中分泌的胆汁量。

进一步，灌注系统14设置有监控数据收集装置15，所述监控数据收集装置15收集温度传感器16、压力传感器17和流速传感器18和液体计量器12所产生的监控数据，并将收集的数据传输至中央处理器组件1。所述的中央处理器组件1设置有数据处理装置19，用于处理监控数据收集装置15所收集的监控数据，中央处理器组件1还包括信息传输装置21，可以将所述数据处理装置19处理数据参数结果，传递给外部对应的接收装置。

实施例6器官灌注系统的温度稳定性检测

本实施例中，为了检验实施例5中，采用涂覆铝合金材料制备的器官灌注系统内部温度的稳定性情况，对灌注过程中肝脏存储装置和肝脏灌注液存储器的内部温度进行监控，比较灌注过程中温度的波动情况，具体如下：

6.1实验方法

利用柚皮素衍生物常温肝脏灌注液作为测试灌注液，灌注系统的设定温度为：4℃，20℃，36.5℃，环境温度为室内环境温度，约为23-26℃，灌注总流速为450ml/min。

灌注系统启动10min后，对肝脏存储装置和肝脏灌注液存储器的内部温度进行监控，每个10min检测温度一次，灌注时间为1h。

设置对照组，对照组的灌注系统采用不含涂层的铝合金材料制备，其他结构设置与实施例5相同。

6.2实验结果

肝脏存储装置和肝脏灌注液存储器的测定的最大温度和最小温度如表4和表5所示。

表4肝脏存储装置的最大温度和最小温度

表5肝脏灌注液存储器的最大温度和最小温度

从表4，表5显示的结果可以看出，相对于对照组，涂覆有GO-CT-1-C涂层的灌注系统，其肝脏存储装置和肝脏灌注液存储器的内部温度更为稳定，温度差约为±0.1℃，可见，石墨烯本身具有良好的导热性，GO-CT-1-C涂层有利于热量快速稳定的传导，对于系统内部温度的稳定起到了良好的作用。

实施例7利用含有GO-CT-1-C涂层的灌注系统对肝脏进行体外保存

1实验动物

雄性中华小型猪20头，体重30±3Kg。分成两组，实验组和对照组，每组各10头。所有的实验动物均受到人道主义对待,符合美国国立卫生院颁布的《实验动物管理和使用指南》。

2.方法

(1)实验动物术前禁食禁水8小时。肌肉注射戊巴比妥钠进行诱导麻醉，称取体重并记录。取仰卧位四肢固定于手术台，高流量吸氧，备皮，连接胸前导联心电监护，猪尾末端连接血氧饱和度探头。头皮针经耳缘静脉建立外周静脉通路并充分固定，气管插管前，氯化琥珀胆碱注射液(1mg/kg)麻醉诱导，判断插入正确位置后连接麻醉机通气，保持吸呼比1:2。经外周静脉通路间断维库溴铵维持肌肉松弛、给予丙泊酚维持麻醉。

(2)肝脏获取：“十”字切口逐层进腹腔，解剖肝十二指肠韧带，游离出胆总管后予以结扎，近端插导尿管，离出肝动脉，门静脉并予以悬吊，肝动脉整段完全游离。并开始游离脾静脉，脾静脉游离完成后开始游离出肝下腔静脉，继而游离出肝上腔静脉。游离成功后从脾静脉插管至门静脉完成，开始游离腹主动脉，腹主动脉游离完成后并插管，静脉注射肝素12500单位全身肝素化，肝素化完成后，行肝脏灌注，使用UW液经门静脉灌注量约500ml,腹主动脉灌注量约1000ml，胆道冲洗约150ml。灌注过程中肝脏表面不断覆无菌冰屑以助肝脏降温灌注完成后切除肝脏，置于盛有4℃保护液无菌盆中修整。

(3)机械灌注系统的预热：开启系统，使灌注液温度和肝脏存储室的温度维持在36.5℃，使灌注保存系统运转等待接入供肝。

(4)离体肝脏接入灌注系统，其中，实验组接入实施例5所制备的机械灌注系统，对照组的灌注系统采用不含涂层的铝合金材料制备，其他结构设置与实施例5相同。

(5)灌注保存：待连接完成后，调整肝动脉压力80～120mm Hg，门静脉压力10～20mm Hg，灌注总流量保持在400-500ml/min，氧流量/氧分压保持在2-3L/min，并保持灌注液温度为36.5℃。实时通过压力传感器和流速传感器分别监测门静脉、肝动脉流量及压力，调节蠕动泵的输出功率维持设定的灌注压力和流速，维持门静脉及动脉血流在设计范围内。每3h采取等量置换的方法放出400ml灌注液并添加400ml新鲜灌注液，采用的灌注液为柚皮素衍生物常温肝脏灌注液，灌注时间为4h。

实施例8离体保存器官的移植与术后感染情况

为了进一步检测实施例7中离体肝脏移植的术后感染情况，将灌注4h后的肝脏进行移植，具体实验如下：

8.1实验动物

雄性中华小型猪20头，体重30±3Kg。随机分组两组，每组10只，作为肝脏移植的受体，其中，A组：接收实验组肝脏移植；B组：接收对照组肝脏移植。

8.2移植方法

固定受体猪，麻醉，备皮，消毒，铺巾，“人”字形切口逐层进腹腔，解剖胆总管、肝动脉及门静脉，解剖完成后予以悬吊，并开始解剖肝上下腔静脉，游离出肝动脉，并依次阻断切断肝动脉(进入无肝期)，门静脉，肝下下腔静脉及肝上下腔静脉，摘除器官后，迅速开始植入供肝；立即开始吻合肝上下腔静脉，吻合完成后，开始冲洗门静脉并予以吻合，开放门静脉及半开放肝上下腔静脉，监测生命体征相对平稳后全开放肝上下腔静脉(结束无肝期)，接下来依次吻合后再开放肝下下腔静脉，肝动脉，吻合完成以上血管后，观察器官分泌出胆汁(新肝功能恢复)，并开始吻合胆总管，留置T型管引流出胆汁，逐层关腹，关腹完成，T型管引流出胆汁，生命体征相对平稳，手术完成，监测生命体征，期间予以适量抗生素、激素及补充相应能量治疗，逐渐进食并排便，未出现明显排斥反应后，撤除心电监护仪。

8.3移植后器官状态的检测方法

移植后，对实验组和对照组均进行常规的抗生素抗感染治疗(罗氏芬)和普复可乐、骁悉和强的松的三联免疫抑制治疗，移植7的后，分别抽取移植器官实验组和对照组的全血，痰、胆汁、腹水、气管分泌物进行病原菌培养分离，药敏测试。细菌培养仪器购自美国BiotonMerieux公司,细菌鉴定应用购自美国BectonDinson公司的半自动分析仪和法国生物梅里埃公司的API系统。凡连续出现≥2次阳性并为相同菌株时即可诊断为肝移植术后合并细菌感染。

8.4实验结果

从实验组肝移植猪的送检标本中分离出15株细菌,具体如表6所示。

表6实验组猪肝移植阳性标本细菌检测情况

从对照组肝移植猪的送检标本中分离出29株细菌,具体如表7所示。

表7对照组猪肝移植阳性标本细菌检测情况

从表6-7的结果可以看出，含有GO-CT-1-C涂层的灌注系统无论是在感染菌的种类上，还是在感染菌的数量上，均少于对照组，特别是对于革兰氏阴性菌中的铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌有明显的抑制作用，这说明，GO-CT-1-C涂层有利于防止器官移植的术后感染。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 嘉兴莱普晟医疗科技有限公司

<120> 一种减轻器官移植术后感染的机械灌注系统

<130> CP11902068C

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> 天蚕素A

<400> 1

Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Glu Val Leu Gly Ser Ala

20 25 30

Lys Ala Ile

35

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 死亡素

<400> 2

Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly

1 5 10 15

Lys Cys Gln Arg Met

20

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 融合多肽

<400> 3

Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn

1 5 10 15

Arg Arg Thr Gly Lys Cys Gln

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 抗菌肽

<400> 4

Arg Trp Arg Ile Trp Lys Arg Arg Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn

1 5 10 15

Arg Arg Thr Gly Arg Cys Gln

20

Claims (6)

1.一种用于器官保存的机械灌注系统，其特征在于，所述机械灌注系统包括器官灌注液存储器和器官存储装置，所述器官灌注液存储器和器官存储装置包含氧化石墨烯和抗菌肽；

所述器官灌注液存储器为内外两层，内外两层间的夹层设置有温控调节装置，所述外层由保温材料制备，所述内层为导热材料制备；

所述器官存储装置为内外两层，内外两层间的夹层设置有温控调节装置，所述外层由保温材料制备，所述内层由导热材料制备；

所述导热材料为铝合金，所述导热材料表面覆盖有涂层，所述涂层包含氧化石墨烯和抗菌肽；所述保温材料为树脂；所述抗菌肽为天蚕素A和死亡素的融合多肽，所述融合多肽的序列为rwriwkrrpvpiiycnrrtgrcq；

所述涂层的制备方法为：

1)、将导热材料浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，pH值到8-8.5，常温下反应16小时后，用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层；

2)、将步骤1)制备的材料，浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应3-6小时，用蒸馏水清洗，干燥，得到多聚赖氨涂层；

3)、将氧化石墨烯与一水合肼反应，获得还原型氧化石墨烯，将还原型氧化石墨烯制备成0.2mg/ml的溶液，加入到浓度为2.5mg/ml的抗菌肽溶液中；充分混合2-4h后，离心重新分散，获得负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯溶液，所述还原型氧化石墨烯和抗菌肽的体积比为1:2.5；

4)、将步骤2)制备的材料浸没于步骤3)制备的溶液中，吸附15-45min，蒸馏水清洗，获得单层载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层；重复步骤4) 4-6次，获得导热材料上覆盖多层负载抗菌肽的还原型氧化石墨烯涂层。

2.权利要求1所述的用于器官保存的机械灌注系统，其特征在于，所述树脂为ABS树脂。

3.权利要求1-2任意一项所述的用于器官保存的机械灌注系统，其特征在于，所述机械灌注系统还包括中央处理器组件，蠕动泵，器官灌注液存储器，膜氧合器，器官存储装置，液体收集装置，监控数据收集装置，温度传感器、压力传感器、流速传感器，所述中央处理器组件还包括控制组件，数据处理装置和信息传输装置。

4.权利要求3所述的用于器官保存的机械灌注系统，其特征在于，中央处理器组件与蠕动泵连接，蠕动泵与器官灌注液存储器连接，器官灌注液存储器通过输入导管与膜氧合器连接，膜氧合器通过输入导管和输入导管与器官存储装置连接，器官存储装置通过输出导管与灌注液过滤装置连接，灌注液过滤装置与器官灌注液存储器连接，所述监控数据收集装置、收集温度传感器、压力传感器和流速传感器和液体计量器所产生的监控数据，并将收集的数据传输至中央处理器组件。

5.权利要求1-4任意一项所述的用于器官保存的机械灌注系统的用途，其特征在于，所述机械灌注系统可以用于保存离体器官。

6.权利要求5所述的用于器官保存的机械灌注系统的用途，其特征在于，所述器官选自心脏，肾脏，胰腺，骨髓。

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