CN109125708B - 一种抗菌肽复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗菌肽复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽复合材料及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。本发明以天然抗菌肽和小尺寸石墨烯材料为原料，采用化学修饰或物理吸附的方法，制备了一种抗菌肽‑石墨烯复合材料，这一材料具有良好的抗菌能力，并且在活性浓度范围内具有较低的溶血毒性。尤其制备得到的蜂毒肽/氧化石墨烯复合材料，其抗菌效率比原始的蜂毒肽或氧化石墨烯高20倍以上。本发明利用抗菌肽与石墨烯材料具有相似的、破坏细胞膜的机制，两者发生协同作用，实现对细胞膜的快速高效的插入和成孔，进而导致细菌内容物的泄漏，实现在极低药物浓度的情况下有效杀灭细菌。

Description

一种抗菌肽复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种抗菌肽复合材料及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
细菌感染一直是威胁人类健康的致命问题。自1928年青霉素被发现以来，人们主要利用抗生素来抑制细菌。然而抗生素的滥用导致了细菌抗药性的出现。近年来，细菌抗药性已经成为威胁人类公共卫生安全最严重的问题之一。世界卫生组织统计全球范围内每年约700,000人死于细菌抗药性，并且这一情况在未来将会更严重。因此，采用全新的思路来开发新型抗菌药物已经迫在眉睫。
抗菌肽有望能从根本上解决细菌抗药性问题。作为生物体内抵御细菌感染的第一道防线，抗菌肽对包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌在内的各类微生物具有广谱的活性；并且，这种短肽通过直接破坏细菌的细胞膜完整性来杀灭细菌，因此不会发生抗药性。然而，由于其较低的破膜和杀菌效率(即需要较高的作用浓度)，由于高浓度导致的较高的细胞毒性和昂贵的成本，以及多肽分子在体内稳定性不足、容易被酶降解等原因，从而限制了天然抗菌肽在实际中的应用。例如蜂毒肽，作为一类典型的抗菌肽，它由26个氨基酸残基组成，带有6个正电荷，具有很强的抗菌活性，甚至对癌细胞和HIV都有破坏能力。在达到一定临界浓度以后，蜂毒肽会直接插入细胞膜，在膜上形成孔洞，使得细菌胞内物质泄露，从而导致细菌的死亡。然而，蜂毒肽实现插入细胞膜过程存在很大的能垒，这也就决定了蜂毒肽需要在高浓度下通过相互协作才能克服这一能垒(>0.35μM或多肽:脂分子比例P:L≥1:50)，而高浓度的同时也就增大了生物体所受到的细胞毒性。总之，天然抗菌肽的临床应用还需要进行重要的改进。
为了解决天然抗菌肽的这些缺点，最近一二十年科研工作者们做了大量的尝试。例如，人们曾尝试将天然抗菌肽修饰到金、银纳米颗粒的表面，以提高其抗菌效率，并取得了一定的效果。然而这一方法主要是通过提高多肽的局部浓度来发挥作用，因此提高效率的程度有限。也有一些研究是模仿天然抗菌肽的结构来人工设计制备聚合物分子，以完成抗菌功能，也取得了一定的效果。然而相关材料需要复杂精巧的制备和提纯过程。
发明内容
本发明将从一个新的角度来解决上述问题。本发明将天然抗菌肽分子与一类自身具备细胞膜活性的纳米材料-石墨烯或氧化石墨烯相结合，制备‘抗菌肽-(氧化)石墨烯’复合结构。实验及模拟的结果发现，该复合材料具有极高的抗菌效率，比原本的天然抗菌肽分子高20倍以上。本发明利用抗菌肽与石墨烯材料具有相似的、破坏细胞膜的机制，两者发生协同作用，实现对细胞膜的快速高效的插入和成孔，进而导致细菌容物的泄漏，从而实现在极低的药物浓度的情况下有效杀灭细菌。
本发明的第一个目的是提供一种抗菌肽复合材料，包括石墨烯纳米材料，和以化学键或物理吸附的方式修饰在石墨烯纳米材料表面或边缘的抗菌肽。
在本发明的一种实施方式中，所述的石墨烯纳米材料为石墨烯或氧化石墨烯的纳米点、纳米晶、纳米颗粒。
在本发明的一种实施方式中，所述的石墨烯纳米材料的粒径小于500nm。
在本发明的一种实施方式中，所述抗菌肽为蜂毒肽、蛙皮素、防御素、或它们的变体多肽。
在本发明的一种实施方式中，所述的抗菌肽复合材料通过化学合成的方法或者通过物理吸附的方法制备得到。
本发明的第二个目的是提供所述的抗菌肽复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)溶解抗菌肽：将抗菌肽溶解于缓冲溶液中，得溶液A；
(2)活化抗菌肽的氨基：在溶液A加入氨基活化剂对抗菌肽进行活化，得到溶液B；
(3)配置石墨烯纳米材料的分散液：将石墨烯纳米材料粉末均匀分散在水中，得到溶液C；
(4)物理吸附：将溶液A与溶液C进行混合反应，得到所述的抗菌肽复合材料；或化学修饰：将溶液B与溶液C进行混合反应，得到所述的抗菌肽复合材料。
在本发明的一种实施方式中，石墨烯纳米材料与抗菌肽的质量比为1:1～1:20。
在本发明的一种实施方式中，所述的活化剂为TEPA、EDC、NHS。
在本发明的一种实施方式中，所述的缓冲液为PBS缓冲液。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，活化是在20～25℃温度中、在150～300rpm转速下旋转反应8～12h。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(4)中，混合反应是在20～25℃温度中、在150～300rpm转速下旋转反应1～3h。
本发明的第三个目的是提供所述抗菌肽复合材料在制备抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明以天然抗菌肽和小尺寸石墨烯(包括氧化石墨烯)为原料，采用化学修饰或物理吸附的方法，制备了一种抗菌肽-石墨烯复合材料，这一材料具有良好的抗菌能力，并且在活性浓度范围内具有较低的溶血毒性。尤其制备得到的蜂毒肽/石墨烯复合材料，其抗菌效率比天然蜂毒肽高20倍以上。本发明利用抗菌肽与石墨烯材料具有相似的、破坏细胞膜的机制，两者发生协同作用，实现对细胞膜的快速高效的插入和成孔，进而导致细菌容物的泄漏，实现在极低药物浓度的情况下有效杀灭细菌。这一提高机制与之前的“抗菌肽-纳米金颗粒”等材料，有着根本的区别。
附图说明
图1是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶薄膜的X射线衍射曲线；
图2是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶与蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体、蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体的动态光散射图；
图3是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶与蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体、蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体的原子力显微镜图；
图4是蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体和蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体的结构示意图；
图5是不同材料的最低抑菌浓度MIC检测；
图6是不同材料溶血毒性检测结果；
图7是不同材料处理过的细菌的扫描电镜图；其中A为原始菌株，B为蜂毒肽作用，C为天然氧化石墨烯作用，D为蜂毒肽/氧化石墨烯复合材料作用；
图8是天然蜂毒肽分子和蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合材料作用后小尺寸单层囊泡的冷冻电子显微镜图像；其中A为天然蜂毒肽分子作用，B为蜂毒肽/氧化石墨烯复合材料作用。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：化学修饰法制备蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合材料
1.活化蜂毒肽的氨基
将蜂毒肽溶于PBS缓冲液，配制成2mg/mL的溶液。取该溶液400μL(包含蜂毒肽800μg)，将75mM浓度的TEPA稀释25倍并取1mL加入蜂毒肽溶液中，再加入10μL浓度为50mM的EDC，10μL浓度为100mM的NHS，将以上溶液在22摄氏度下以250rpm的转速旋转和反应10小时。得溶液A。
2.配制氧化石墨烯纳米点的水分散液
将氧化石墨烯纳米点(GO NDs，尺寸39±10nm，约含有4-5层氧化石墨烯单层)粉末分散在水中，配制0.5mg/mL的水分散液，超声2小时以上令其分散均匀。得溶液B。
3.化学修饰
将A溶液与200μL的B溶液混合，继续放入摇床以250rpm的转速反应2h。反应完的液体根据对melittin/GO的浓度需要，冷冻干燥配成合适的浓度使用。
实施例2：化学修饰法制备蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合材料
1.活化蜂毒肽的氨基
将蜂毒肽溶于PBS缓冲液，配制成2mg/mL的溶液。取该溶液400μL(包含蜂毒肽800μg)，将75mM浓度的TEPA稀释25倍并取1mL加入蜂毒肽溶液中，再加入10μL浓度为50mM的EDC，10μL浓度为100mM的NHS，将以上溶液在22摄氏度下以250rpm的转速旋转和反应10小时。得溶液A。
2.配制氧化石墨烯纳米晶的水分散液
将氧化石墨烯纳米晶(GO NCs，尺寸90±10nm，约含有2-3层氧化石墨烯单层)粉末分散在水中，配制0.5mg/mL的水分散液，超声2小时以上令其分散均匀。得溶液B。
3.化学修饰
将A溶液与200μL的B溶液混合，继续放入摇床以250rpm的转速反应2h。反应完的液体根据对melittin/GO的浓度需要，冷冻干燥配成合适的浓度使用。
实施例3：物理吸附法制备蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合材料
1.配制蜂毒肽溶液
将蜂毒肽溶于PBS缓冲液，配制成2mg/mL的溶液A。
2.配制氧化石墨烯纳米点的水分散液
将氧化石墨烯纳米点(GO NDs，尺寸39±10nm，约含有4-5层氧化石墨烯单层)粉末分散在水中，配制0.5mg/mL的水分散液，超声2小时以上令其分散均匀。得溶液B。
3.物理吸附
将A溶液与200μL的B溶液混合，继续放入摇床以250rpm的转速反应2h。反应完的液体根据对melittin/GO的浓度需要，冷冻干燥配成合适的浓度使用。
实施例4：物理吸附法制备蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合材料
1.配制蜂毒肽溶液
将蜂毒肽溶于PBS缓冲液，配制成2mg/mL的溶液A。
2.配制氧化石墨烯纳米晶的水分散液
将氧化石墨烯纳米晶(GO NCs，尺寸90±10nm，约含有2-3层氧化石墨烯单层)粉末分散在水中，配制0.5mg/mL的水分散液，超声2小时以上令其分散均匀。得溶液B。
3.物理吸附
将A溶液与200μL的B溶液混合，继续放入摇床以250rpm的转速反应2h。反应完的液体根据对melittin/GO的浓度需要，冷冻干燥配成合适的浓度使用。
实施例5：抗菌材料结构分析
分别采用X射线衍射、动态光散射和原子力显微镜对氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶、实施例1制备得到的蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合材料和实施例2制备得到的氧化石墨烯纳米晶复合材料的结构进行分析，结果如图1、图2和图3所示。图1是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶薄膜的X射线衍射曲线。由曲线中衍射峰可计算得知两种氧化石墨烯材料的纳米层间距皆为0.85±0.05nm。图2是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶与蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体、蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体的动态光散射图。由图中可以获知四种材料的尺寸。图3是氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶与蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体、蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体的原子力显微镜图。由图中可以获知四种材料的尺寸及厚度，根据厚度可推算出材料中纳米片的层数。
图4为实施例1～4制备得到的两类复合材料的结构示意图，以氧化石墨烯纳米点和氧化石墨烯纳米晶为基础、制备出的两类复合材料，其尺寸和层数不同，多肽和纳米片之间通过化学键进行连接。
实施例6：抗菌材料抑菌效果检测
通过‘最低抑菌浓度’即MIC检测来验证新材料的抗菌能力。MIC是指，能够将细菌数目降低至原始数目10％所需的最少药物浓度，因此该值愈低、说明该药物的抗菌能力越强。革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌(S.aureus)被同时用于实验。两种复合材料(蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体、蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体)被分别检验；作为负参照，天然的蜂毒肽(Melittin)和原始的氧化石墨烯材料(氧化石墨烯纳米点、氧化石墨烯纳米晶)也被用于实验，两种传统的抗生素多粘菌素(polymyxin，用于大肠杆菌)和梭链孢酸(Fusidic acid，用于金黄葡萄球菌)被作为正参照使用，结果见图5。
图5结果显示，复合材料的MIC值远低于参照样，也就是说，其抗菌能力获得了极大的提高。例如，蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体材料对于两种细菌的MIC值分别为1.2μg/mL和5.0μg/mL；而对于天然蜂毒肽melittin，它对于两种细菌的MIC值分别为25μg/mL和45μg/mL；对于原始的氧化石墨烯材料氧化石墨烯纳米点GO NDs和氧化石墨烯纳米晶GO NCs，该值皆高于100μg/mL。这意味着，与原始的蜂毒肽相比，复合材料的抗菌能力有超过20倍的提高。另一种复合材料蜂毒肽/氧化石墨烯纳米晶复合体，尽管它的纳米片尺寸比要大，但仍然表现出8倍以上的效率提高。更重要的是，复合材料蜂毒肽/氧化石墨烯纳米点复合体的抑菌能力甚至和抗生素匹敌、甚至比抗生素还要高，例如多粘菌素的MIC值是12.5μg/mL，高于复合材料的数值。
实施例7：抗菌材料溶血毒性检测
为了检验材料的毒性，我们开展了材料的溶血实验，结果如图6所示。溶血毒性检测结果显示，在浓度为20μg/mL以下，几种材料基本皆不表现出明显的溶血毒性。考虑到我们的复合材料其活性MIC已经被大大降低到了1.2μg/mL和5.0μg/mL的级别，这意味着复合材料在其活性作用浓度范围内具有较小的生物毒性；与之相对应，原始的蜂毒肽分子在其MIC值范围，即25μg/mL和45μg/mL，则表现出明显的毒性。
实施例8：抑菌效果扫描电镜表征
我们将经过几种药物处理过的细菌，包括革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌(S.aureus)，置于扫描电子显微镜下观察，结果见图7，可以发现药物的处理确实对细菌表面造成了明显的破坏。尤其是经我们的复合材料处理过的细菌，它们大都失去了原本的形状，表面出现了严重的损坏和坍塌。
实施例9：以细胞膜模型验证复合材料的抗菌机制
以小尺寸单层囊泡(SUV)为细胞膜模型来检验材料的细胞膜破坏效率。结果如图8所示，实验结果显示，在相同多肽浓度(多肽:脂分子＝1:30)的情况下，原始蜂毒肽会导致囊泡发生形变，由原本规则的球形变成哑铃型等，而复合材料则会导致囊泡发生极其严重的聚集和破坏，完全失去了原本的球形结构。这表明复合材料具有比天然抗菌肽更高的细胞膜破坏效果。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.一种抗菌肽复合材料，其特征在于，包括石墨烯纳米材料，和以化学键或物理吸附的方式修饰在石墨烯纳米材料表面或边缘的抗菌肽；
所述的石墨烯纳米材料为氧化石墨烯的纳米点、纳米晶；
所述抗菌肽为蜂毒肽；
所述的抗菌肽复合材料的制备方法，包括如下步骤：
（1）溶解抗菌肽：将抗菌肽溶解于缓冲溶液中，得溶液A；
（2）活化抗菌肽的氨基：在溶液A加入氨基活化剂对抗菌肽进行活化，得到溶液B；
（3）配制石墨烯纳米材料的分散液：将石墨烯纳米材料粉末均匀分散在水中，得到溶液C；
（4）物理吸附：将溶液A与溶液C进行混合反应，得到所述的抗菌肽复合材料；或化学修饰：将溶液B与溶液C进行混合反应，得到所述的抗菌肽复合材料。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽复合材料，其特征在于，所述的石墨烯纳米材料的粒径小于500 nm。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽复合材料，其特征在于，石墨烯纳米材料与抗菌肽的质量比为1:1～1:20。
4.根据权利要求1所述的抗菌肽复合材料，其特征在于，所述的氨基活化剂为膦酰基乙酸三乙酯、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺或1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺。
5.根据权利要求1所述的抗菌肽复合材料，其特征在于，在步骤（2）中，活化是在20～25℃温度中、在150～300rpm转速下旋转反应8～12h。
6.根据权利要求1所述的抗菌肽复合材料，其特征在于，在步骤（4）中，混合反应是在20～25℃温度中、在150～300rpm转速下旋转反应1～3h。
7.权利要求1～6任一项所述的抗菌肽复合材料在制备抗菌药物中的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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