CN109642248A - 液体样品中细胞的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种计数液体样品例如乳制品优选原料乳中的细胞例如细菌和/或体细胞的方法。公开的方法包括应用通常不穿透细胞的二聚核酸染料(=不渗透细胞的染料)的步骤的组合,所述二聚核酸染料通过使用pH、缓冲液和温度的正确组合而被赋予细胞渗透性。
Description
发明领域
本发明涉及用于快速定量液体样品(例如生物流体)中的细胞(例如体细胞和/或微生物)的方法和装置。更具体地,本发明涉及通过应用荧光染料计数原料乳(raw milk)中的细菌的方法和装置。
背景技术
在食品、饮料、制药、环境、制造和临床工业中持续需要检测和量化微生物(尤其是活细菌细胞)的能力。在农业中,金黄色葡萄球菌等细菌的存在可能导致奶牛的乳腺炎,并且当存在于乳中时可能对消费者有害。乳腺炎检测本身通常基于在乳腺炎期间迁移到乳汁中的体细胞(白细胞:白血球和上皮细胞)的计数。通常可接受的是在正常乳中每cc含0至500,000个体细胞(与乳腺炎的存在无关),而每cc超过100万个体细胞的数量肯定是乳腺炎的指示。本领域教导了多种方法来确定乳中体细胞的数量,这进而显然是乳是否不适合人类食用的指示。
除了能够确定体细胞的数量以检测乳是否来自患有乳腺炎的奶牛的事实之外,还不言而喻的是监测生物液体如(未加工和/或加工过的)乳中的任何类型的细菌的数量以确保它对人类食用是安全的是非常重要的。本领域教导了许多不同的方法来检测液体样品例如乳制品如牛奶中的细菌。
检测和计算原料乳中细菌的传统方法是通过标准平板计数法,约需要48小时。该程序导致每单位体积的菌落形成单位(CFU)的数量。显然,与标准平板计数法相比,使用同样可靠但更快速的方法来计算和计算乳中的微生物是明智的。
EP0750678B1公开了一种通过使用包含离子螯合剂、蛋白水解酶、去污剂和细菌学特异性荧光染料的混合物的组合物来检测液体样品中的细菌的方法。该混合物引起细胞裂解,降解和溶解蛋白质颗粒和细胞碎片并使样品中的细菌染色。通过使用随后的流式细胞术步骤计数数量。该方法的缺点在于所用试剂的数量(包括离子螯合剂和洗涤剂)。在该方法中,使用已知渗透细胞的荧光染料,例如溴化乙锭,它是一种毒剂。使用有毒物质导致繁琐的废物处理和每个样品的更高成本。通常希望使用无毒试剂。
WO02/08454公开了一种通过使用可被活细胞(例如荧光素二乙酸酯或OregonGreen TM)的酶活性可检测地改变的染料来确定液体样品中包含的活细胞百分比的方法,从而比较活菌的数量。到无活力细胞的数量。该方法的缺点在于它耗时,因为它需要离心并且使用依赖于细胞活力的染料,因此不能检测所有细胞,包括某些活细胞。
WO00/12750公开了一种通过将乳与培养基一起培养来评估乳中细菌的存在的方法,所述培养基包含荧光底物,所述荧光底物在与细菌相互作用时形成可检测的荧光产物。该方法的缺点是细菌和荧光底物之间的孵育时间至少需要7小时,这对于乳制品的快速加工来说太长了。
其他人已经使用了基于聚合酶链式反应(PCR)或环介导等温扩增(LAMP)技术的系统,以确定含有蛋白质的液体样品(如乳)中细菌的存在。许多这些核酸扩增/检测程序是耗时的并且有时需要细菌的分解和遗传物质的提取和/或沉淀,这使得这些程序通常复杂和麻烦。
WO2013/083754公开了一种用于检测乳中细菌的方法,其中使用(特异性)抗体与细菌相互作用,然后可以用染色程序检测其。使用该方法的缺点是染色程序和针对特定细菌的特异性抗体的使用(可能遗漏未与这种抗体结合的细菌)。换句话说,人们希望计算乳中存在的所有细菌,而抗体总是对一种抗原具有某种特异性,但对另一种抗原则不然。此外,使用(重组)抗体带来的相对高的成本是该方法的另一个缺点。
JP2013081424公开了一种方法,其中样品需要通过等电沉淀去蛋白化,并且还需要过滤,之后可以使用荧光试剂检测(活)细菌。该特定方法的缺点在于需要耗时的复杂的去蛋白化和纯化方法。
EP1918385B1公开了一种通过流式细胞术检测液体样品中的细菌的方法,其中样品最初用脂解酶和蛋白酶处理,然后进行用拓扑异构酶毒物和/或DNA旋转酶毒物处理样品的步骤,之后用核染色剂染色DNA。这种方法的缺点是使用多种昂贵的染料和耗时:不同的步骤加起来将持续1到48小时。
Gunasekera等(A flow cytometry method for rapid detection andenumeration of total bacteria in milk.2000.Appl Environ Microbiol66(3):1228-1232)公开了使用BC作为荧光核酸染色剂,用蛋白酶处理以清除乳中的蛋白质小球,随后进行流式细胞仪检测和计算UHT和原料乳样品中的细菌。这种方法的缺点是Gunasekera等人公开了另外的离心步骤,该步骤耗时并且在快速检测系统中是麻烦的。事实上,Gunasekera等人公开的方法在最终分析之前约需要60分钟。这仍然是一个相对较长的过程。
US 2015/0056625A1公开了用于澄清乳液(水/脂肪混合物)的试剂,以使得能够随后测量这种乳液中的细胞。
CN101050416描述了一种用于检测乳中细菌的显微镜检查方法,其具有涂抹装置、染色装置、洗涤/干燥装置和使用载玻片的显微检测装置。
本领域中已知的上述方法都没有教导快速的、仅需要几个步骤、可靠、昂贵且安全的方法。尽管本领域可获得和如上所列的方法和装置,仍然需要一种高通量、安全、快速和可靠的方法来检测生物流体如(未加工)乳中的细菌材料。许多列出的方法是耗时的、使用有毒试剂、麻烦和/或昂贵,这使得它们不太适合用于大规模生产过程和高通量筛选。
发明内容
本发明涉及一种计数液体样品中的细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将包含二聚核酸染料和缓冲剂的染色组合物与所述样品混合;
b)任选地超声处理步骤a)的混合物;
c)将混合物在约45℃至约95℃的温度下孵育少于10分钟;
d)任选地对步骤c)的孵育混合物进行超声处理;和
e)计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞,
其中核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸染料部分,BRIDGE连接Q1和Q2。该方法的优点在于它快速、可靠并且使用安全的核酸染料,其是不渗透细胞的和非诱变的,因此其使用安全。通过本发明解决了使这些染料穿过完整细胞的细胞膜以便能够计数这些细胞的问题。
在优选的实施方案中,二聚核酸染料能够通过按需释放机制与DNA结合。
涉及染色组合物的优选组合物、BRIDGE、Q1和Q2的优选化学性质、孵育步骤c)在温度和pH方面的优选条件和计数细胞的优选方式的进一步优选的实施方案在权利要求中定义。
在优选的实施方案中,所述细胞是体细胞和/或细菌细胞。在另一个优选的实施方案中,所述液体样品是选自乳(milk),血液,尿液,唾液,粪便和脊髓液的生物样品。特别地,动物乳样品,例如原料乳样品,优选用于确定该原料乳中的细菌和/或体细胞的数量,以确定奶牛是否患有乳腺炎和/或乳样品是否适合人类食用。在本发明的另一方面,所述液体样品是环境样品,例如废水。
在又一方面,本发明涉及如权利要求中限定的装置。
附图的简要说明
图1显示了染色的大肠杆菌的流式细胞仪数据。流式细胞仪中的三个荧光检测器具有以下滤光器;527nm带通(FL1),590nm带通(FL2)和630nm长通(FL3)。FL1和FL2荧光通道用于鉴定染色的细菌(分别为C和A)。在FL1与FL2二维相关图中鉴定为染色的大肠杆菌细胞的阳性染色细胞周围定义了矩形区域(B)。
图2显示了使用GelGreenTM的流式细胞仪细菌计数的对数与来自PetrifilmTM计数的对数CFU计数之间的图中的清晰线性关系。
图3显示在(A)Tris缓冲盐水(pH8.5)、(B)未加入细菌但根据本发明的方案处理的原料乳和(C)加标大肠杆菌的原料乳样品中用GelGreenTM染色的大肠杆菌的流式细胞术数据。在加标原料乳中鉴定出明显的大肠杆菌群,与FL1FL2计数区重叠。
图4显示了加标不同类型细菌的原料乳(RM)样品的对数流式细胞仪(FCM)计数/毫升与对数PetrifilmTM CFU/毫升计数的图。细菌的缩写如实施例3中所公开。
图5是显示使用三种不同染料和两种不同加热方案在不同染色组合物中染色大肠杆菌的能力的条形图。这三种染料是GelGreenTM,-1和Safe。对于GelGreenTM,从左到右的条是1)在50℃的Tris缓冲盐水(pH8.5),2)在23℃的Tris缓冲盐水(pH8.5),3)在50℃的盐水溶液(0.9%)和4)在23℃的盐水溶液(0.9%)。对于-1和Safe,从左到右的条是1)在50℃的Tris缓冲盐水(pH8.5)和2)在23℃的Tris缓冲盐水(pH8.5)。图6显示加标大肠杆菌并与本发明的方案(上面的三个图)分别在60℃(左)、40℃(中)和23℃(右)一起孵育的原料乳样品的流式细胞术点图。下面的三个图显示了通过用大肠杆菌加标和分别在60℃(左)、35℃(中)和25℃(右)孵育具有0.9%盐的水(盐水)获得的流式细胞仪点图。
图7示意性地显示了用于计数液体样品中的细胞的装置。
图8A示意性地示出了用于对液体样品中的细胞进行计数的装置的混合单元的三维视图。图8B示意性地示出了图8A的混合单元的横截面视图。
图9示意性地显示了用于计数液体样品中的细胞的另一装置。
图10显示了根据本发明的方案测量的两种不同原料乳样品的流式细胞术点图。左图显示了高体细胞计数和高细菌计数样品的点图,而右图显示的是低体细胞计数和低细菌计数样品的点图。图中的矩形FL1、FL2区域显示细菌可见的区域(左下区域)和体细胞可见的区域(右上图)。
图11是通过根据本发明的方法测定的29个乳样品中的体细胞计数(y轴)与通过使用已建立的参考方法的计数(x轴)之间的相关图。该相关性的R2为0.9684。
图12是通过根据本发明的方法和本领域中使用的传统平板计数方法在相同的29个样品中的细菌细胞计数之间的相关图。该相关性的R2为0.8247。
图13显示了每种测试样品的四种测试染料的条形图。对于每个样品,从左到右的条是1)参考方法(GelGreenTM),2)3)Green和4)碘化丙啶。“Blanc”是纯净水,“鲜乳”是从当地农民获得的少于24小时的生鲜乳,“24h旧乳”是从牛奶厂获得的24小时乳,“48h旧乳”是从牛奶厂获得的48小时乳,“加标乳”是加入活大肠杆菌的生鲜乳,“加标和经蒸煮的乳”是加标经蒸煮(死)的大肠杆菌的生鲜乳。IBC数量以每毫升百万计数给出。
图14显示了每种测试样品的四种测试缓冲剂的条形图。对于每个样品,从左到右的条是1)参考方法(Tris缓冲盐水),2)不含NaCl的Tris溶液(此处称为“不含NaCl的TN”,3)CAPS和4)碳酸氢钠。“Blanc”是纯净水,“鲜乳”是从当地农民获得的少于24小时的生鲜乳,“24h旧乳”是从牛奶厂获得的24小时乳和“48h旧乳”是从牛奶厂获得的48小时乳。IBC数量以每毫升百万计数给出。
图15显示了每个测试样品的三个测试温度的条形图。对于每个样品,从左到右的条是1)参考方法(68℃),2)55℃和3)40℃。“Blanc”是纯净水,“鲜乳”是从当地农民获得的少于24小时的生鲜乳,“加标鲜乳”是加入活大肠杆菌的生鲜乳,“加标和经蒸煮的乳”是加标经蒸煮(死)的大肠杆菌的生鲜乳和“24h旧脏乳”是从牛奶厂获得的24小时乳,其细菌数量高于正常值。IBC数量以每毫升百万计数给出。
图16显示了每个测试样品的两个测试温度的条形图。对于每个样品,从左到右的条是1)参考方法(68℃)和2)90℃。“Blanc”是纯净水,“鲜乳”是从当地农民获得的少于24小时的生鲜乳,“24h旧乳”是从牛奶厂获得的24小时乳,和“加标乳”是加入活大肠杆菌的生鲜乳。IBC数量以每毫升百万计数给出。
图17显示了每种测试样品的三种测试染料的条形图。对于每个样品,从左到右的条是1)参考方法(pH=10.6),2)pH=8.7和3)pH=7.0。“Blanc”是纯净水,“鲜乳”是从当地农民获得的少于24小时的生鲜乳,“加标乳”是加入活大肠杆菌的生鲜乳,“加标和经蒸煮的乳”是加标经蒸煮(死)的大肠杆菌的生鲜乳和“24h旧脏乳”是从牛奶厂获得的24小时乳,其细菌数量高于正常值。IBC数量以每毫升百万计数给出。
图18显示了用于本发明方法的二聚核酸染料的按需释放机制的示意图。
图19显示AOAO-12的化学结构,其是二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是具有本文所述的结构I的基于吖啶的核酸染料,并且使用具有下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—。
图20显示AOAO-13的化学结构,其是二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是具有本文所述的结构I的基于吖啶的核酸染料,并且使用具有下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—。
图21显示了TOTO-13的化学结构,其是二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是具有本文所述的结构II的基于非对称花青的核酸染料,并且使用具有下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—。
图22显示了ET-27的化学结构,其是二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是具有本文所述的结构III的基于菲啶鎓(phenanthridinium)的核酸染料,并且使用具有下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—。
详细描述
通常在乳中发现多种微生物,包括革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,需氧菌,厌氧菌和微需氧菌,它们以不同的细胞排列生长并且具有直径约0.5至8微米的大小。原料乳中精确的成分和细菌数量可能因地理位置和季节而异。鉴于此,以及如上所述的本领域中使用的(标准)方法的已知缺点,需要相对简单、安全和快速的方法来检测乳中发现的大量细菌而不受通常存在于原料乳中的其他材料的干扰。然而,生物流体尤其是原料乳的复杂性使得其中包含的细菌的快速检测、计数和枚举变得困难,尤其是当使用荧光染料时。由于存在某些组分如核黄素和β-胡萝卜素,乳具有显示固有背景荧光的性质。当荧光染料用于染色乳样品中的细菌时,这些染料还可以非特异性地结合具有相关外蛋白膜的乳脂肪球。这显然可能导致背景荧光信号的增加而妨碍正确的读出。
特别相关的是细菌的小基因组尺寸,与哺乳动物细胞中约3十亿碱基对相比,其可以在约2至8兆碱基对(Mbp)的范围内。
本发明涉及一种快速、可靠和安全的方法,用于使用染料对液体样品中的细胞进行计数,该染料是安全的因为该染料不能渗透人体细胞。本发明的方法使待计数的细胞仅在包含待计数细胞的反应容器(也称为混合杯)中对染料可渗透。本发明适用于快速和可靠地计数细胞,甚至在生物液体样品(例如可能含有脂肪、细胞、蛋白质和矿物质的(未加工)乳)中也如此。根据本发明的液体样品中的细胞计数的方法包括以下步骤:
a)将包含二聚核酸染料和缓冲剂的染色组合物与所述样品混合;
b)任选地超声处理步骤a)的混合物;
c)将混合物在约45℃至约95℃的温度下孵育少于10分钟;
d)任选地对步骤c)的孵育混合物进行超声处理;和
e)计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞,
其中核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸染料部分,BRIDGE连接Q1和Q2。
在初始工作期间,将原料乳在缓冲溶液中稀释,并使用细胞渗透性核酸染色剂9来染色乳中所含的细菌。使用流式细胞仪(配备488nm激光器作为光源、前向和右角散射检测器以及三个荧光检测器)用于检测来自标记细菌的荧光。在该初始实验中,流式细胞仪中的三个荧光检测器具有以下滤光器;527nm带通(FL1),590nm带通(FL2)和630nm长通(FL3)。流式细胞仪利用提供所分析样品的体积测量并产生每单位体积的计数的系统。当加标细菌的原料乳在盐水缓冲液中稀释并用9染色时,流式细胞仪检测到的荧光信号与未加标细菌的原料乳中检测到的荧光相同。结论是来自原料乳中各种组分的背景荧光信号以及染料与这些组分的非特异性结合主导了信号,使得不可能检测到任何与细菌相关的荧光。另外,在流式细胞术中从乳脂肪球、酪蛋白胶束和乳中的其他组分中检测到的大散射信号阻止了在检测细菌中使用前向和右角散射。为了防止背景信号,本发明的发明人试图使这种干扰最小化。这包括探索原料乳的各种化学和物理处理以及各种核酸染料以染色细菌。研究了各种酶分解乳中蛋白质同时保持细菌DNA足够完整以保留在细胞结构内的能力。研究了各种温度、缓冲剂和pH范围,以优化原本不渗透细胞的核酸染料的渗透,从而改善核酸染料的细菌染色。还研究了样品的超声处理,以帮助酶促消化原料乳中的各种组分并改善细菌染色。
染色组合物
用于本发明方法的染色组合物包含缓冲剂和二聚核酸染料,其中二聚核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸染料部分,BRIDGE连接Q1和Q2。在一个实施方案中,染色组合物还包含蛋白酶,例如丝氨酸内肽酶。染色组合物的不同组分在下面更详细地描述。
二聚核酸染料
已发现对于本发明重要的是,所用的染色组合物包含特定类型的核酸染料,因为本发明人已发现在本文测试的核酸染料中只有具有式Q1-BRIDGE-Q2(其中Q1和Q2是核酸染料部分,BRIDGE连接Q1和Q2)的核酸染料在用于本发明方法时表现出良好的性能。用于本发明的染色组合物的二聚核酸染料可包含一对相同的荧光单体核酸染料部分。当Q1和Q2相同时,所得的核酸染料是同二聚体。当Q1和Q2不同时,得到的二聚体是异二聚体。优选地,用于本发明的染色组合物中的二聚核酸染料是同二聚体。商业上可获得的核酸染料GelGreenTM、EvaGreen和GelRedTM涵盖在美国专利7,601,498和7,803,943中,其通过引用并入本文。
开发这些染料用于通过替换细胞渗透性和诱变性已知的染料如溴化乙锭以安全方式染色琼脂糖凝胶中的双链DNA和单链DNA或RNA,但不用于染色和/或计数(活)细胞。此外,它们具有低毒性,优异的灵敏度和出色的稳定性。已经开发出用于以安全方式染色分离的DNA的这些染料,根据这些产品的安全性表,已被选择为在37℃下确实对人体细胞是不可渗透细胞的。这些产品的安全性表中描述的测试包括以下步骤:
-将HeLa细胞与所讨论的核酸染料在37℃下以染料浓度孵育30分钟,该染料浓度适合于在琼脂糖凝胶中染色DNA,
-使用适合于所述染料的滤光器组进行荧光显微镜检查以检测细胞的染色。
因此,如本文所用,核酸染料如果不穿透HeLa细胞则是“不可渗透细胞”,如通过在37℃和中性pH下孵育30分钟后接着通过使用适用于所述染料的滤光片组的荧光显微镜未观察到HeLa细胞的可检测染色所确定的。
值得注意的是,这些二聚核酸染料(如GelGreenTM)的化学结构经过特殊设计,使得染料在生理环境下不能穿过细胞膜,从而使它们成为“不可渗透细胞”,因而不可用于染色完整细胞。因此,本发明的发明人最初选择GelGreenTM作为乳样品中的复染剂,假设它会染色样品中的其他组分,而不是(细菌)细胞。令人惊讶的是,在约50至60℃的温度下在Tris缓冲盐水(pH8.5)中稀释的原料乳样品中实际使用染料导致细菌细胞被染色。进一步的研究表明,GelGreenTM在室温(23℃)下既不在盐溶液中也不在Tris缓冲盐水中染色细菌细胞。此外,在NaCl溶液(=盐水)中,仅在50℃下出现GelGreenTM对细菌的最小染色(图5)。这些结果表明,温度、染料、染色溶液的组成和可能pH的组合对于获得原料乳中细菌的适当染色是重要的。
用于本发明的核酸染料包含两个通过本文称为“BRIDGE”的接头连接的核酸染料部分,从而形成二聚核酸染料。此外,存在两个核酸染料部分形成分子内二聚体的趋势,主要是H-二聚体,这是产生的核酸染料中特别有用的性质。通过比较水溶液中二聚染料的吸收光谱和相关单体染料在水溶液中的吸收光谱,可以证实分子内二聚体的形成。任何分子内二聚体的形成都应使二聚染料中组分单体染料的光谱相对于相关单体染料的光谱显著偏移。在这方面,作为示例,显著的偏移可以是约10nm或更大。
由于这种分子内二聚体的形成,本发明方法中使用的二聚核酸染料在溶液中呈现主要的发夹状构象。该发夹样构象或染料状态相对于核酸是无活性的,或者不能与核酸相互作用或沟槽结合。据信,当在溶液中和在核酸存在下,染料还设想呈现打开随机构象或状态,其以少量存在并且与发夹构象基本平衡。染料的打开随机构象或状态对于核酸是活性的,或者能够与核酸相互作用或结合。据信,当染料处于存在增加量的核酸的情况下时,发生从发夹状态向中间打开随机状态或DNA结合状态的平衡转变。据信这种机制,有时被称为“按需释放DNA结合机制”,减少了背景荧光,有时也可能降低染料的毒性。用于本发明的二聚核酸染料能够形成分子内二聚体,或形成发夹结构。此外,本发明中使用的二聚核酸染料能够通过按需释放机制与DNA结合,如例如在美国专利号7,601,498中描述的。按需释放机制如图18所示。
与某些染料有关的H-二聚体形成现象已在West等人,J.Phys.Chem.(1965);Rohatgi等人,J.Phys.Chem.(1966);Rohatgi等人,Chem.Phys.Lett.(1971);和Khairutdinov等人,J.Phys.Chem.(1997)中描述。当BRIDGE是柔性和中性或基本上中性的烃接头时,可以促进分子内H-二聚体的形成,任选地包含一个或多个中性核酸结合增强基团NABEG。二聚染料中的H-二聚体形成可能与两个主要益处相关。主要益处之一是背景荧光的减少,有时是显著的,伴随着DNA结合时荧光的显著增加,如荧光信号中的大增益所证明的。另一个主要益处是二聚染料中的H-二聚体形成可以显著降低染料的毒性,特别是诱变性。在这方面,使用Ames试验或等效试验测量,诱变性的显著降低可以为相对于EB至少约20%。据信降低的诱变性可至少部分地归因于细胞膜渗透性的降低和染料的有效浓度。此外,二聚核酸染料的分子量通常比已知核酸凝胶染料的分子量基本上或显著更大,例如为约两倍。通常,具有较大分子量的分子比具有较小分子量的分子更难以穿透细胞膜。实际上,用于本发明方法的二聚核酸染料是不可渗透细胞的。
在本发明方法中使用的具有式Q1-BRIDGE-Q2的二聚核酸染料中,BRIDGE与Q1和Q2共价连接。用于本发明方法的核酸染料的BRIDGE组分基本上为脂族的,包含约8至约150个非氢原子,例如约10至约100,约15至约80或约20至约50个非氢原子。BRIDGE可以在相对有限的程度上带正电或基本上是中性的,并且是促进分子内二聚体形成以产生二聚染料的基本上柔性的成分。可以选择BRIDGE的成分以提供这种有限的正电荷或基本上中性。基本上中性的属性(包括实际中性)将在下面进一步讨论。基本上柔性的性质通常与BRIDGE的基本上脂族性质(包括实际脂族性质)有关。这种基本上脂族性质通常是指BRIDGE的非芳香性,或BRIDGE的非刚性。
BRIDGE可以掺入至少一个独立的核酸结合增强基团(NABEG)。NABEG是能够以静电、疏水或氢键相互作用的形式结合核酸的部分。仅举例来说,NABEG可以选自伯胺;仲胺;叔胺;铵;脒;任选地包含选自N、O,S及其任意组合的杂原子的芳基;具有包含高电负性杂原子的键的部分;及其任何组合。伯、仲和叔胺和脒是碱性基团,因此在生理pH下带正电或至少部分带正电。铵基团或季铵化氮基团是永久带正电的。一般而言,带正电荷或部分带正电的基团通过静电相互作用增强染料的核酸结合,静电相互作用可以用于开发高度敏感的荧光核酸染色。通常不希望使用具有过量正电荷的BRIDGE来产生二聚染料。合适的二聚染料BRIDGE可包含不超过一个正电荷。BRIDGE可以是基本上柔性和中性或基本上中性的接头。在这种情况下,基本上中性是指轻微的电荷。举例来说,BRIDGE可以包含弱碱性成分,例如吡啶基团或吡嗪基团,使得当它在水溶液中时,可以存在非常少量的正电荷。进一步举例来说,在BRIDGE包含至少一个中性NABEG的情况下,正电荷的确切量通常与NABEG的pKa相关。通常,NABEG的pKa越高,NABEG质子化的可能性越大,因此带正电。举例来说,合适的弱碱性NABEG基团可具有约11或更低的pKa,例如约8或更低,或约7或更低。
在一个实施方案中,BRIDGE具有下面直接列出的式(式1):
-L-[A1-(CH2)α-]a[A2-(CH2)β-]b[A3-(CH2)γ-]c[A4-(CH2)δ-]d[A5-(CH2)ε-]e[A6-(CH2)ζ-]f[A7-(CH2)η-]g[A8-(CH2)θ-]h[A9-(CH2)ι-]i-A10-L-
在式2中,每个L是BRIDGE的一部分并且与Q1或Q2共价连接。每个L独立地是包含单键的部分;具有1个碳至约12个碳的多亚甲基单元,任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子;或任选包含至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基。与(CH2)亚甲基单元相关的下标,即α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι,可以相同或不同,各自独立地表示相关亚甲基单元的大小,并且独立地为0或1至约20或1至约12的整数,包括端点。与式2的下括号部分相关的下标,即a、b、c、d、e、f、g、h和i可以相同或不同,各自独立地表示公式的相关括号部分的大小,并且独立地为零或1至约20的整数,例如1至约10,或1至约5。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以相同或不同,各自独立地为核酸结合增强基团(NABEG);任选包含至少一个选自N、O和S的杂原子的支链烷基;或至少一个饱和的5-或6-元环,其任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以使得BRIDGE包括至多一个正电荷,或者基本上是中性的,并且在后一种情况下,这些组分中的每一个独立地本身可以是基本上中性的,其包括实际中性。NABEG可选自包含至少一个键连接的部分,所述键连接包含至少一个高电负性的杂原子或S;和任选包含至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。包含含有至少一个高电负性的杂原子或S的至少一个键连接的部分的实例包括但不限于包含至少一个酰胺键、氨基甲酸酯键、脲键、硫脲键、醚键或硫醚键的部分。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以相同或不同,可以独立地是选自以下的NABEG:包含含有至少一个高电负性的杂原子或S的至少一个键连接的部分;任选包含至少一个选自卤素、N、O和S的杂原子的芳基。包含含有至少一个高电负性的杂原子或S的至少一个键连接的部分的实例包括但不限于包含至少一个酰胺键、氨基甲酸酯键、脲键、硫脲键、醚键或硫醚键的部分。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10可以使得BRIDGE包含至多一个正电荷,或者基本上是中性的,并且在后一种情况下,这些成分中的每一个本身可以是基本上中性的,包括实际中性。BRIDGE可包含任何合适数量的非氢原子,如前所述,例如,约10至约100个非氢原子。
因此,在一个实施方案中,BRIDGE具有下面直接列出的式(式1):
-L-[A1-(CH2)α-]a[A2-(CH2)β-]b[A3-(CH2)γ-]c[A4-(CH2)δ-]d[A5-(CH2)ε-]e[A6-(CH2)ζ-]f[A7-(CH2)η-]g[A8-(CH2)θ-]h[A9-(CH2)ι-]i-A10-L-,其中
-每个L是BRIDGE的一部分并且与Q1或Q2共价连接,并且独立地是包含单键的部分;具有1个碳原子至约12个碳原子并且任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的多亚甲基单元,,或任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基,
-α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι独立地为0或1至约20的整数,
-a、b、c、d、e、f、g、h和i独立地为0或1至约20的整数,
-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10独立地选自核酸结合增强基团、任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的支链烷基和任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的至少一个饱和的5-或6-元环。。
优选地,BRIDGE可具有下面直接列出的式(式2):
—(CH2)x—C(═O)NH—(CH2)α—[O—(CH2)β]b—[O—(CH2)γ]c—N H(O═C)—(CH2)x—,其中:
-BRIDGE的每个L的是—(CH2)x—,其中每个x独立地是选自1到11的整数,
-α可以是选自2至约20的整数,
-β和γ独立地为0、2或3,
-b为0或选自1至约20的整数,和
-c为0、1或2。
更优选地,BRIDGE可具有下面直接列出的式(式3):
—(CH2)x—C(═O)NH—(CH2)α—[O—(CH2)β]b—[O—(CH2)γ]c—N H(O═C)—(CH2)x—,
其中,
-BRIDGE的每个L是—(CH2)x—,其中每个x是5,
-α是2或3,
-β是2,
-b是1或2
-c为0、1或2,和
-当c为1或2时,γ为3。
在一个非常优选的实施方案中,BRIDGE具有选自下组的配方:
式:
a)—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—N H(O═C)—(CH2)5—,和
b)—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—。
在本发明方法中使用的具有式Q1-BRIDGE-Q2的二聚核酸染料中,Q1是核酸染料部分,Q2是核酸染料部分,Q1和Q2可以相同或不同。优选地,Q1和Q2是相同的。如本文所用,术语“染料”是指能够吸收光谱范围为约250nm至约1,200nm的光的芳族分子。通常,术语“染料”可以指荧光染料、非荧光染料或两者。通常,术语“荧光染料”是指当被另一种适当波长的光激发时能够发光的染料。如本文所用,术语“核酸染料”是指能够结合核酸以形成染料-核酸复合物的染料。如本文所用,术语“核酸染料部分”是指分子中核酸染料的官能团,在本发明的二聚核酸染料的情况下,该分子具有式Q1-BRIDGE-Q2。在优选的实施方案中,核酸染料部分是荧光的。“荧光核酸染料”是指能够结合核酸以形成荧光染料-核酸复合物的染料。荧光核酸染料本身通常是非荧光的或弱荧光的,但在核酸结合时变得高度荧光。
在优选的实施方案中,用于本发明的染色组合物中的二聚核酸染料包含荧光核酸染料部分Q1和荧光核酸染料Q2,其中Q1和Q2可以相同或不同。根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中Q1和/或Q2是荧光核酸染料部分。Q1和Q2可以独立地为荧光核酸染料部分,每个荧光核酸染料部分来源于选自下组的核酸染料:基于吖啶的核酸染料,基于非对称花青的核酸染料,基于菲啶鎓的核酸染料,基于对称性花青的核酸染料,派洛宁核酸染料,苯乙烯基核酸染料,DAPI的衍生物和Hoechst染料的衍生物。DAPI和Hoechst染料通常不能直接连接至BRIDGE,因为它们不具有形成键的反应基团。在本文中,衍生物是指基础染料,例如DAPI或Hoechst染料,其被充分修饰以用于形成键,例如通过添加反应性基团。优选地,荧光核酸染料部分来源于核酸染料,所述核酸染料选自基于吖啶的核酸染料,基于非对称花青的核酸染料和基于菲啶鎓的核酸染料。优选地,Q1和Q2是相同的荧光核酸染料部分。
用于本发明方法的二聚核酸染料可以与平衡与染料相关的正电荷的阴离子缔合。这种阴离子可以是生物相容的。合适的阴离子的实例包括但不限于卤化物,硫酸盐,磷酸盐,高氯酸盐,四氟硼酸盐和六氟磷酸盐。仅举例来说,阴离子可以是氯离子或碘离子。
当荧光核酸染料部分是基于吖啶的核酸染料时,它优选具有下面直接列出的结构(结构I):
其中,
-每个R1独立地选自H、C1-C2基团和烷基,
-BRIDGE连接至R2或R3,
-当BRIDGE连接至R2时,R3选自H或-CH3,
-当BRIDGE连接至R3时,R2选自H、-CH3、-NH2、-NHCH3、-CN和-C(═O)NH2,
-R6和R7各自独立地选自H、C1-C2基团和烷基,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
当荧光核酸染料部分是基于非对称花青的核酸染料时,它优选具有下面直接列出的结构(结构II):
其中,
-BRIDGE连接至R7,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
当荧光核酸染料部分是基于菲啶鎓的核酸染料时,它优选具有下面直接列出的结构(结构III):
其中,
-BRIDGE连接至R1,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
在本发明的一个高度优选的实施方案中,二聚核酸染料选自:
a)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求13所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,
b)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求13所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—,
c)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求14所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,和
d)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求15所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—。
在另一个高度优选的实施方案中,用于本发明染色组合物中的二聚核酸染料具有选自分别在图19、20、21和22中所示的结构IV、V、VI和VII的化学结构。虽然图19、20、21和22中所示的结构显示出两个碘阴离子,但是可以使用任何其他合适的阴离子(例如本文所述的那些)代替所示的碘阴离子。
二聚核酸染料是不渗透细胞的并且通过按需释放机制与DNA结合并且具有根据以上描述的式Q1-BRIDGE-Q2,其可以从Biotium商购获得,如GelGreenTM、和GelRedTM。此外,它们可以如美国专利7,601,498和7,803,943的相关实施例中所述制备,这些实施例在此引入作为参考。
基于本发明的教导,技术人员将认识到染色组合物中二聚核酸染料的合适浓度可以根据使用的染料和待计数的细胞而变化。作为一般规则,当以与用于琼脂糖凝胶中DNA染色的相同染料的浓度相同的浓度范围(例如与用于琼脂糖凝胶中DNA染色的相同染料的浓度大致相同)使用包含二聚核酸染料的染色组合物时,本发明可以很好地起作用。。
缓冲剂
还发现,对于本发明重要的是,所用的染色组合物还包含缓冲剂。缓冲剂优选为有机缓冲剂,更优选缓冲剂包含胺,例如伯胺或仲胺。在优选的实施方案中,缓冲剂选自三(三(羟甲基)氨基甲烷)和CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)。在一个高度优选的实施方案中,缓冲剂是Tris。在优选的实施方案中,缓冲剂在染色组合物中的浓度为约10至约500mM,例如约20至约400mM,约40至约300mM,约60至约400mM,约80至约300mM或约100至约200mM。
用于本发明方法的染色组合物优选在室温下具有约8至约11.5,例如约8至约11,约8至约10.6,约8.5至约10.6的pH,即在任选的预热染色组合物期间或在与样品一起孵育期间升高温度之前。已知pH取决于温度。每当提及pH设定时(如本文中常用的pH范围为8至10.6),除非另有说明,否则在室温(~25℃)下制备具有这种pH的缓冲液。当进行染色反应的最终温度增加(转诊至)时,pH可降低。然而,通常,当Tris用作缓冲剂并且染色组合物在室温(RT)下具有约9.5的初始pH时,当在高于60℃的温度下保持时,pH将降低至8至8.5的范围。这意味着即使染色组合物或包含染色组合物的混合物被加热,pH通常也在本文所述的8至10.6的范围内。由于加热时pH值降低,本发明人发现不必调节包含二聚核酸染料和Tris的染色组合物的pH,在这种情况下,室温下pH约为10.6。如本文所用,术语“Tris-NaCl缓冲液”,“Tris-盐水缓冲液”和“Tris缓冲盐水”可互换使用,并且是指包含Tris作为缓冲剂和150mM NaCl的缓冲液,其中pH通过以下方式调节:用HCl滴定。如本文所用,术语“Tris-NaCl溶液”和“Tris-盐溶液”可互换使用,并且是指包含作为缓冲剂的Tris和150mM NaCl的溶液,但其中pH未调节但是约为10.6。如本文所用,术语“盐溶液”和“NaCl溶液”可互换使用,指150mM NaCl溶液。150mM NaCl对应于0.9%NaCl溶液。
已知使细菌受热会改变其渗透性(参见US5410030)。然而,本领域普遍接受的是,细菌必须经受非常高的温度(90℃或更高)以充分损害膜以允许完全透化和不渗透细胞的染料的进入。实际上,不渗透细胞的染料-1在含有细菌的Tris缓冲盐水中加热到50℃时,细菌染色极少(图5)。与-1相比,GelGreenTM在50℃的Tris缓冲盐水中出乎意料地表现出明显不同的染色行为(图5),当温度从约62℃升高至约68℃时,性能甚至更好。当比较不渗透细胞的GelGreenTM和与不渗透细胞的Green的染色行为时,得出了相同的结论(图13)。因此,当染色组合物包含GelGreenTM或时,本发明的方法起作用,所述GelGreenTM或均为具有式Q1-BRIDGE-Q2的不渗透细胞的二聚核酸染料,与染色组合物包含-1或Green时相反。基于此,可以得出结论,对于本发明重要的是使用具有式Q1-BRIDGE-Q2的二聚核酸染料,如GelGreenTM和EvaGreen在染色组合物中所例示的。尽管优选使用包含Tris的染色组合物作为使用GelGreenTM染色细菌的缓冲剂,但是其他缓冲剂也起作用。用于染色组合物的合适缓冲剂选自有机生物缓冲剂,特别是包含胺的有机缓冲剂,例如优选Tris或CAPS,最优选Tris。此外,除GelGreenTM之外的其他不渗透细胞的二聚核酸染料可能在另一种缓冲液中表现更好。基于当前的教导,找到用特定染料获得最佳染色的正确缓冲液是本领域普通技术人员因此可以容易地执行的事情。
细胞和样品
通过本发明的方法在液体样品中计数的细胞可以是所有种类的细胞。在优选的实施方案中,所述细胞是体细胞和/或细菌细胞。优选地,细胞是如本文示例的体细胞和/或细菌。体细胞可以例如包括存在于乳中的上皮细胞,多形核白细胞(PMN),巨噬细胞和淋巴细胞。细菌细胞可包括革兰氏阳性细胞和革兰氏阴性细胞。革兰氏阳性细菌可以选自单核细胞增生李斯特菌(Lm),金黄色葡萄球菌(Sa)和蜡状芽孢杆菌(Bc)。革兰氏阴性细菌可以选自铜绿假单胞菌(Pa)和大肠杆菌(Ec)。
在优选的实施方案中,液体样品是选自乳,血液,尿液,唾液,粪便和脊髓液的生物样品。特别优选的样品是(牛)乳样品,例如从牛获得的原料乳样品。从消费者和健康组织的角度来看,测量乳样品中细菌细胞的数量以确定乳是否适合食用是有益的。从农民或乳生产者的角度来看,为了类似目的而测量细菌细胞也是有益的,但也可以测量体细胞,这将指示乳腺炎。
在另一个优选的实施方案中,液体样品是环境样品,例如废水,湖水和土壤。液体样品也可以是希望知道细菌计数以确定其是否清洁或需要进一步纯化的其他含水样品。
当样品是固体或半固体材料时,例如,在粪便或土壤的情况下,将固体或半固体材料分散或溶解在水或缓冲液中,然后将其稀释到染色组合物中或将其直接分散或溶解在染色组合物中。无论哪种方式,固体或半固体样品变成液体样品,其中可以根据本发明的方法计数细胞。
蛋白酶
在本发明的一个优选实施方案中,染色组合物还包含蛋白酶,其优选为非特异性蛋白酶,更优选为丝氨酸内肽酶,例如枯草杆菌蛋白酶A(EC3.4.21.62),例如市售蛋白酶和酶和是用于本发明方法的优选的非特异性蛋白酶,因为它们的蛋白水解活性能够在合理的短时间内(在加热、适当的pH和优选超声处理下小于10分钟)分解除了细菌之外的原料乳样品中的物质。然而,可以使用具有与或类似的酶活性的其他非特异性蛋白酶。当待计数的细胞是生物样品中的细菌细胞以减少来自生物样品中其他组分的噪音时,染色组合物包含蛋白酶是特别有用的。当染色组合物包含蛋白酶时,选择染色组合物的pH和孵育步骤c)的温度,以便为酶的活性提供合适的环境,并且可以使用本领域已知的普通措施根据使用的蛋白水解酶的类型进行调整。使用的蛋白酶的量取决于蛋白酶的类型及其比活性。基于本公开内容,技术人员可以调节染色组合物中存在的蛋白酶的量,以便减少样品中不是要计数的细胞的其他材料的噪音。举例来说,用于本发明方法的染色组合物可适当地包含约0.1AU/ml至约2x103酶AU/ml(Anson单位/ml),例如约0.12AU/ml至约1.92x103AU/ml。AU/ml,其中AU定义为在pH7.5、37℃下每分钟从酪蛋白释放1.0μmol(181μg)酪氨酸的酶的量。
超声处理
可任选地对步骤a)中获得的混合物和/或步骤c)中获得的混合物进行超声处理,以增加核酸染料的细胞渗透性。在一个实施方案中,进行任选的超声处理步骤b)或d)中的至少一个。当进行时,重要的是足够温和地进行超声处理以保存待计数的细胞,从而避免所述细胞的裂解。这意味着待计数的细胞应保持足够完整,以使DNA保留在细胞结构中,从而可以对DNA染色的细胞进行计数。超声处理可能有助于细菌细胞壁变得可渗透,并且还确保在流式细胞计数期间细菌不会混在一起。在一个实施方案中,同时计数体细胞和细菌细胞,并将步骤a)中获得的混合物和/或步骤c)中获得的混合物在约15至约50kHz,例如约20至约45kHz或在约22.5kHz至约40kHz下超声处理约1至约10秒,例如约2至约9,约3至约8,约4至约7,约5至约6秒。通过将超声波探头直接放入样品中,或通过将适当的超声波探头放置在其中保持样品的杯子上,间接地将具有染色组合物的样品超声处理约1至10秒;将具有染色组合物的样品在约45至约95℃(例如在约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,61至约69℃,或优选约62至约68℃)的温度下孵育(优选在混合杯中)最多1至2分钟;然后,再次直接或间接地将样品超声处理约1至10秒;在进行步骤e)中的细胞计数之前进行上述步骤。
孵育
将染色组合物和样品的混合物在步骤c)中在使细胞可透过核酸染料的条件下孵育。在一个优选的实施方案中,孵育在约45至约95℃的温度下进行,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,约61至约69℃或约62至约68℃。如上所述,孵育步骤期间的pH将受到升高的温度的影响,因此将不同于染色组合物中的pH。优选地,孵育步骤c)期间的pH为约8至约11.5,例如约8至约11,约8至约10.6,约8.5至约10.6。步骤c)中的孵育适合进行少于10分钟,例如少于9分钟,例如少于8、7、6、4、3或2分钟,优选约1分钟。步骤c)中所需的短孵育时间而同时仍获得可靠的细胞计数,是本发明的主要优点。
细胞计数
在孵育步骤c)和任选的超声步骤d)之后,通过使用荧光检测仪器对染色的细胞进行计数,以检测所用二聚核酸染料的荧光。技术人员知道计算溶液中染色细胞的不同方法。在本发明的一个优选方面,通过使用荧光检测仪器,例如流式细胞仪,荧光显微镜或荧光成像系统,荧光计或荧光板读数器,对染色的细胞进行计数。检测来自标记细胞(例如细菌)的荧光优选使用流式细胞仪(也称为FCM)进行。
在一个实施方案中,同时计数体细胞和细菌细胞。
在本发明的一个高度优选的实施方案中,对原料乳中的细菌进行染色(和计数)的方法如下进行:将(或)和GelGreenTM加入到Tris-盐水溶液(pH10.6)中,还被称为染色组合物;将该染色组合物预热至约45至约95℃的温度,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,61至约69℃,或优选约62至约68℃;将少量原料乳样品预热足够长的时间,使样品达至约45至约95℃的温度,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57℃至约75℃,约60℃至约70℃,61℃至约69℃,或优选约62℃至约68℃;预热的样品优选在预热的染色组合物中稀释约1:10;通过将超声波探头直接放入样品中,或通过将适当的超声波探头放置在其中保持样品的杯子上,间接地将样品与染色组合物的混合物超声处理约5至10秒;将具有染色组合物的样品在约45至约95℃(例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57℃至约75℃,约60℃至约70℃,61℃至约69℃,或优选约62℃至约68℃)的温度下孵育(优选在混合杯中)最多1至2分钟;然后,任选再次直接或间接地超声处理样品约5至10秒;最后,在流式细胞仪上分析混合物(或其代表性部分),检测来自体细胞和/或细菌的荧光信号,并测定每单位体积的计数。从取样到读出的整个过程花费少于10分钟,优选少于9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。在另一种方法中,乳样品本身在混合之前不进行预热,但在与预热的染色组合物混合时变得加热到允许染料最佳进入细胞/微生物的温度。
在一个优选的方面,所述蛋白酶和所述二聚核酸染料在Tris缓冲盐水中混合以形成所述染色组合物。在本发明的另一个优选实施方案中,提供了根据本发明的方法,其中在与所述样品混合之前将所述染色组合物加热至约45至约95℃,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,61至约69℃或优选约62至约68℃。与此同时,当与所述染色组合物混合时,优选将所述样品加热至约45至约95℃,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,61至约69℃,或优选约62至约68℃。也可以在与染色组合物混合之前直接预热样品。取决于样品的类型,技术人员能够在混合之前决定是否预热或在其原始温度下使用样品(乳通常储存在寒冷的地方,或者在直接来自来源例如奶牛时,乳的温度可能高于储存温度,但低于孵育温度)。当样品和染色组合物混合时,孵育在优选和最佳温度下进行,以实现染料最有效地进入细胞。或者,样品未预热(并且例如具有冷藏温度),但当其与预热的染色组合物混合时达到染料进入的最佳温度。
在一个高度优选的实施方案中,本发明涉及计数细胞(例如乳中的体细胞和/或细菌细胞)的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将包含二聚核酸染料、蛋白酶和缓冲剂的染色组合物与所述乳混合;
b)任选地将步骤a)的混合物在约15至约50kHz下超声处理约1至约10秒,例如约5秒;
c)将混合物在约62℃至约68℃的温度下孵育约1分钟至约5分钟;
d)任选地将步骤c)的孵育混合物在约15至约50kHz下超声处理约1至约10秒,例如约5秒,和
e)使用流式细胞仪计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞:
其中,
-核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是由BRIDGE连接的核酸染料部分,
-Q1和Q2相同并且选自具有结构I、结构II和结构III的核酸染料部分,
-其中BRIDGE具有选自下组的式:
—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,和
—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—,和
-所述缓冲剂是Tris.
在该实施方案中,优选进行任选的超声处理步骤b)或d)中的至少一个,甚至更优选进行两个超声处理步骤。蛋白酶优选是丝氨酸内肽酶(EC3.4.21.62)。优选地,蛋白酶的用量为约0.1AU/ml至约2×103酶AU/ml(Anson单位/ml),例如约0.12AU/ml至约1.92×103AU/ml。还优选染色组合物包含浓度为约10至约500mM,例如约20至约400mM,约40至约300mM,约60至约400mM,约80至约300mM或约100至约200mM的Tris。
本发明还涉及制备包含二聚核酸染料的染色组合物的方法,所述方法包括以下步骤:将所述染料在8-11的pH保持在合适的缓冲液中,并将所述染料在所述缓冲液中加热至约45至约95℃,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,61℃至约69℃或优选约62℃至约68℃。
本发明方法的一个优点是它不需要使用离子螯合剂,洗涤剂或离心步骤来处理液体样品,例如乳。相反,它使用热、酶处理和超声处理在适当的缓冲液中与核酸染色的组合,以减少液体样品中材料的干扰荧光信号,同时特异性地染色体细胞和/或细菌,使其成为相对简单快速的方法,每个样品从取样到读数少于10分钟,如少于9、8、7、6、5、4、3或2分钟。此外,如所使用的用于执行分析的装置所解释的,可以在机器内顺序地测量多个样品。该方法应用某些pH和温度范围,以及任选的超声处理和蛋白水解酶来分解样品中的干扰物质,同时保留和标记(染色)细菌。不需要离心或使用有毒化合物。而且,也不需要洗涤剂或离子螯合剂。
另一个优点是本发明的方法使用二聚核酸染料,其在正常情况下是安全的,因为它不能在37℃下穿透真核或原核细胞,因此也不能在室温下穿透。换句话说,本发明提供了一种使用不渗透细胞的非诱变核酸染料的方法,所述核酸染料通常不穿过活细胞膜,例如GelGreenTM或GelRedTM,以染色体细胞和/或细菌,从而提供一种新颖的染色方法和环境上更安全的染色材料。
本发明的又一个优点是它涉及一种快速且仅需要几个步骤的方法。本发明特别适用于高通量测量。
图7示意性地示出了用于对液体样品中的细胞进行计数的装置700。装置700用于执行先前讨论的计数液体样品中的细胞的方法。装置700包括混合杯710,电动机720,加热元件760,可选的超声波仪750,样品入口730,染色组合物入口732,出口742,测量模块740和可选的控制器770。任选地,提供了轴722,清洁液入口734,以及液体泵或阀731、733、735、744。混合杯710、电动机720、加热元件760、可选的超声波仪750、样品入口730、染色组合物入口732、出口742、轴722、清洁液入口734形成混合单元。混合单元的横截面视图示于图8中。
混合杯710用于将液体样品与染色组合物混合并形成容器以在混合液体被超声处理和/或孵育时保持混合液体。混合杯710布置成可绕虚轴旋转。混合杯710可以通过轴722连接至电动机720,但是电动机还可以通过其他装置(例如磁性装置)向混合杯710提供旋转力。在这种磁性布置中,电动机旋转永磁体,并且混合杯710的底部还具有永磁体,并且旋转的永磁体将旋转力施加到混合杯710的永磁体。如果从液体样品入口732接收液体样品和从染色组合物入口730接收染色组合物,可以缓慢旋转混合杯710以混合液体样品和染色组合物以获得混合样品712。混合杯710也可以在相对高的速度下旋转,离心力使混合杯710中的液体712移出混合杯710。
混合杯710可具有倾斜壁,使得混合杯710的直径在更靠近混合杯710的开口/顶侧的位置处增加。在实际实施例中,混合杯710的内壁的3d形状是截头圆锥的形状。此外,图7示出了混合杯710的壁相对较薄。这可能是有利的,因为热量可以容易地通过壁从杯子的外部朝向杯子的内部传递。混合杯710的实施例不限于具有薄壁的实施例。出于机械和/或热稳定性的原因,可能混合杯710的壁相对较厚或者混合杯的内部形成为实心圆盘,导致在混合杯710底部附近较厚的壁。
混合杯710可以由不锈钢材料制成。这导致高导热性,高抗氧化性并结合适当的后处理步骤例如光滑抛光,因此导致易于清洁的表面。也可使用的替代材料是本领域已知的具有良好导热性能的材料。
液体样品入口730例如是管,液体样品通过该管分配到混合杯710中。装置700内的其他装置可以将液体提供给液体样品入口730。为了清楚起见,绘制了能够控制液体样品流入混合杯710的可选的泵或阀731。在实际实施例中,装置700包括摄取和样品模块,其从例如容纳必须获得细胞计数的液体的容器中获得液体样品。这样的摄取和样品模块也可以从连续过程获得液体样品。
染色组合物入口732是例如管,通过该管将染色组合物分配到混合杯710中。染色组合物包含二聚核酸染料和缓冲剂。二聚核酸染料具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸染料部分,BRIDGE连接Q1和Q2。装置700内的其他装置可以提供或制备染色组合物。例如,染色组合物可以用来自含有染色组合物的盒的泵获得。例如,如果染色组合物不能作为混合物获得而是只有染色组合物的原料可用,则在装置700内的制备模块中制备染色组合物。同样为了清楚起见,已经绘制可包括用于控制将染色组合物分配到混合杯710中的任选的泵或阀733的染色组合物入口732。
绘制了可选的清洁液入口734,其在必须清洁混合杯710的时刻向混合杯710的内部提供清洁液。清洁液体入口734可包括泵或阀735,其控制清洁液体分配到混合杯710中。例如,在清空混合杯710之后,在混合杯710的底部表面的约中心处提供清洁液体,并且混合杯710相对快速地旋转,使得清洁液沿着混合杯710的底表面和一个或多个壁移出混合杯710。使用的清洁液例如是水+Triton X-100,Decon 90,NaClO 0.1-1.0%或SurfonicJL80x。可用于本发明方法的Triton的替代物是磷酸三丁酯,环氧乙烷,具有环氧乙烷的2-甲基聚合物,脱水山梨糖醇,单-(9Z)-9-十八碳烯酸酯,聚(氧-1,2-乙二基)单十二烷酸酯,聚(氧-1,2-乙二基)衍生物,醇,C9-11,D-葡萄糖-吡喃糖,低聚癸基辛基糖苷,D-葡萄糖-吡喃糖,低聚,C9-11烷基糖苷,聚(氧-1,2-乙烷基)α(2-丙基-庚基)-ω-羟基,环氧乙烷,2-甲基-,与环氧乙烷的聚合物,单(2-乙基己基)醚。
靠近混合杯710的壁设置有加热元件760,加热元件760还包括加热器和传感器。热加热元件760布置在不妨碍混合杯710旋转的位置,并且加热元件760中产生的热量很好地传递到混合杯710的壁上。在实际实施例中,加热元件760和混合杯710之间存在约1mm的间隙。如果加热元件760接收到指示必须产生热量的加热器控制信号,则加热元件760向混合杯提供热量。可以在加热元件760中在尽可能靠近混合杯710的位置处设置传感器(未单独示出),并测量加热元件和/或混合杯710的温度。传感器也可以设置在另一个靠近混合杯710的位置,用于测量混合杯710中混合物的温度。测量的温度用于控制加热器,以获得混合杯710内的液体712的特定温度。加热器和传感器可选地耦合到控制器770以形成控制回路。加热器的控制和靠近混合杯710布置的传感器的使用还能够很好地控制液体712随时间的温度变化。在图7中,加热元件760仅在混合杯710的一侧被绘出,然而,加热元件可具有相对于混合杯布置在若干相对位置的若干元件,或者加热元件可包围整个加热元件。混合杯710使得可以更好地控制混合杯710中的液体712的温度并且可以更快地加热液体712。在所提出的装置700的实施例中,加热元件760不直接与混合杯710接触,并且在加热元件760和混合杯710之间存在间隙。装置700的实施例不限于所呈现的实施例。在替代实施例中,加热元件760集成在混合杯中,使得产生的热量尽可能接近液体712并且使得传感器可以更精确地测量混合杯710内的液体712的温度。如果加热元件760集成在混合杯710中,必须提供装置以将功率传递到加热元件760并将控制信号和测量信号从控制器770传送到加热元件760,反之亦然。
将液体样品和染色组合物混合到混合杯710中的混合物中,超声波仪750至少在混合杯710中延伸预定距离进入液体712。可选地,在明确定义的时刻,当混合物在混合杯710中时,超声波仪通过超声波为混合物提供能量。超声波仪750例如以20至40千赫的频率操作,并且在例如5至10秒的时间段内向混合物提供例如1至5瓦特。在一个实施例中,超声波仪750可通过致动器移动,并且在必须以超声波形式向液体712提供能量的时刻部分地移动到混合杯710中的液体712中。“超声波仪”的另一个术语是“超声探头”。
出口742例如是插入液体712中的管,该液体712在液体712准备好被分析的时刻存在于混合杯710中。出口742可以具有永久位置,使得当液体样品和染色组合物在混合杯710中混合时,出口742总是在液体712中,或者出口742可以通过致动器移动,使得尖端可以移动。当必须泵送一部分液体712时,出口742在液体712中。出口742可以具有泵744,用于泵送液体712的样品并用于将样品提供给测量模块740。当出口742从液体712取样并提供给测量模块740时,混合可以通过先前描述的混合杯710的相对快速旋转来清空杯710。
任选地,所有入口730、732和出口742也可以耦合到在样品或染色组合物通过相应的入口730、732和出口742时清洁入口730、732和出口742的内部的系统。
出口742耦合到测量模块740。测量模块740被配置为对由出口提供给测量模块740的样品中的染色细胞进行计数。在一个实施例中,测量模块740是流式细胞仪,荧光显微镜,荧光计或荧光板读数器。
装置700可选地具有控制器770,用于控制装置700的不同部件。例如,控制器770连接至电动机720、加热元件760、可选的超声波仪750、泵/阀731、733、735、744和测量模块740。控制器770还可以耦合到未绘制的装置700的其他组件。控制器770和装置700的组件之间的耦合可以借助于例如CAN(控制器区域网络)总线来实现。通过CAN总线,信号和/或消息可以从控制器770传送到组件,反之亦然。例如,加热元件760通过连接772接收指示加热器是否必须产生热量的信号,并且通过连接772,温度传感器的测量值可以提供给控制器770。控制器770与上述所讨论的装置700的可控元件之间的连接可以通过有线连接形成,也可以通过无线连接形成,或者也可以由通过光纤引导的光通信信号形成。
测量模块740还可以由控制器770控制,至少在目前它涉及开始和停止测量。在实际实施例中,测量模块740还耦合到数据处理单元,该数据处理单元接收测量数据并处理该数据以供进一步使用,例如,在显示器上呈现测量结果。
在液体样品中计数细胞(例如细菌)的过程是明确定义的一系列步骤,并且步骤的定时也可以很好地定义。在某些步骤中,时间可能是关键的。控制器770是知道明确定义的一系列步骤和所需时序的单元。控制器770相应地控制几个部件。
具体地,在本文献的上下文中,控制器770配置成:a)控制样品入口730和染色组合物入口732以将液体样品和染色组合物分配到混合杯中;b)控制混合杯以将液体样品和染色组合物混合在混合杯中以获得混合物-可以通过控制电动机720来执行混合杯的控制;c)任选地控制任选的超声波仪750以超声处理混合物;d)控制加热元件760以将混合物加热到一定温度以孵育混合物,在孵育期间,混合物的温度和/或pH使得核酸染料细胞渗透;e)任选地控制任选的超声波仪750以使孵育的混合物超声处理;f)控制出口742以将混合物或其部分提供给测量模块740;g)控制测量模块740以计数在混合物或其部分内被所述染料染色的细胞。控制样品入口730、控制染色组合物入口732和控制出口742可涉及控制阀或泵731、733、744。
控制器770还可以配置成控制电动机720以高速旋转混合杯710并控制清洁液入口734以将清洁液分配到混合杯710中,同时混合杯710仍然以相对高的速度旋转。当清洁混合杯710时,控制器770可以控制随后的混合、声波处理、孵育和测量过程的开始。本段描述装置700顺序地执行步骤,但是必须注意,装置700也可以并行地执行若干步骤。例如,如果将样品提供给测量模块740并且同时测量模块740仍在计数样品中的染色细胞,尽可能快地开始另一个混合步骤。装置700的实施例不限于仅具有一个混合杯710和/或一个测量模块740的装置700。装置700还可以具有用于并行执行若干活动的装置的所有上述元件的若干实例,使得该装置可以每小时分析更多的液体样品。
基本上,控制器770的任务是以使得装置700执行先前讨论的方法的实施例的方式操作装置700。因此,控制器770被配置为控制装置700以执行先前讨论的方法的实施例。在实际实施例中,控制器770包括计算机程序,该计算机程序包括允许控制器770控制装置700执行先前讨论的方法的实施例的指令。控制器770还可以基于专用硬件,该专用硬件被配置为控制装置700以执行先前讨论的方法的实施例。
图8A示意性地示出了用于对液体样品中的细胞(例如细菌)进行计数的装置的混合单元800的三维视图。混合单元800类似于图7的混合单元700。所示元件的实施例和所示元件的功能已在图7的上下文中讨论。图8A的三维视图示出了元件:混合杯810,超声波仪850,样品入口830,染色组合物入口832和出口842。
图8B示意性地示出了图8A的混合单元800的横截面视图。图8B示意性地示出了元件:混合杯810,超声波仪850,轴822和样品入口830。混合杯810由热块862包围,其中嵌入有类似于加热元件860的加热元件。热块862被加热,并且因为热块862和混合杯810之间的距离相对较小,所以混合杯810也被加热。在热块862中,靠近混合杯810,提供感测混合杯810的温度的温度传感器。热块862由例如金属(例如,不锈钢)制成。
图9示意性地示出了用于计数液体样品中的细胞的另外的装置900。用于液体样品中的细胞的另外的装置900包括摄取和样品单元980,混合单元910,测量单元940,控制器970和用户界面单元990。前面已经在图7、图8A和图8B的上下文中讨论了混合单元910、测量单元940和控制器970的实施例和功能,其中只有三位数参考数字的第一个数字根据图而不同。
样品和摄取单元980是对其中必须对细胞进行计数的液体进行采样并将样品提供给混合单元910的单元。样品和摄取单元980还接收必须提供至混合单元910的其他液体和/或其他材料。例如,前面讨论的染色组合物和前面讨论的清洁液。在一个实施方案中,染色组合物的原料由样品和摄取单元980摄取并提供给混合单元910和/或在提供给混合单元910之前混合。在一个实施方案中,样品和摄取单元980摄取水和与水混合或溶解在水中的清洁材料,以获得前面讨论的清洁液。样品和摄取单元980可以包括隔室,在该隔室中放置具有待采样液体和其他液体的瓶子。例如,自动移液器从瓶子中吸取液体。在另一个例子中,样品和摄取单元980包括用于通过管道或管道将样品和摄取单元980连接至外部容器的联接器,外部容器包括待取样和待取样的液体。
如前所述,必须对细胞进行计数的液体样品和染色组合物在混合单元910中混合,超声处理并孵育。如前所述,混合单元910与测量单元940连接并将混合、超声处理和孵育的样品提供给测量单元940。测量单元940对接收的样品中的细胞进行计数。测量单元的实例是:流式细胞仪,荧光显微镜,荧光计或荧光板读数器。
测量单元940耦合到用户界面单元990。测量单元940将测量结果提供给用户界面单元990。用户界面单元990可以包括存储测量结果的数据存储器。用户界面单元990还可以包括处理单元,用于处理测量结果并以适当的格式准备结果以呈现给用户。用户界面单元990可以包括例如用于向用户呈现测量和处理结果的显示器。用户界面单元990还可以包括用于从用户接收用户命令的键盘。例如,用户可以通过提供特定的用户命令来调整在显示器上呈现的信息。在另一实施例中,显示器是触敏显示器,其也适用于接收用户命令。
另外的装置900包括用于控制另外的装置900的操作的控制器970。控制器970耦合到先前讨论的单元并向这些单元提供操作命令并且可以从这些单元接收信息。这种接收的信息例如是传感器信息,与不同单元执行的活动的进度有关的信息和/或在不同单元中生成的错误消息。如前所述,控制器970还控制由不同单元执行的活动和/或任务的定时。控制器970还耦合到用户界面单元990,使得用户界面单元990能够呈现关于待采样液体的分析进度的信息。用户界面单元990还可以用于接收用户命令,该用户命令例如开始另外的装置900的操作和/或在紧急情况下中断另外的装置的操作。
应当注意,上述实施例举例说明而不是限制本发明,并且本领域技术人员将能够设计许多替代实施例。
在权利要求中,括号内的任何参考符号不应解释为限制权利要求。动词“包括”及其变形的使用不排除权利要求中所述之外的元件或步骤的存在。元件前面的冠词“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。本发明可以借助于包括若干不同元件的硬件以及借助于适当编程的计算机来实现。在列举了若干装置的装置权利要求中,这些装置中的若干个可以由同一个硬件项来体现。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的仅有事实并不表示这些措施的组合不能用于获益。
实施例
实施例1.细菌的GelGreenTM染色的验证
首先,进行实验以确认使用GelGreenTM在流式细胞仪上获得的细菌计数确实与传统平板计数相关。为此,选择Petrifilm方法(Standard Methods for Examination ofDairy Products 17th Edition2004.Edited by H.M.Wehr and J.R.Frank.AmericanPublic Health Association,800I Street,NW,Washington DC 200001.Chapter6.040),而不是浇注琼脂平板法,因为易于使用。将大肠杆菌(E.coli)培养物在36℃下在Trypticase Soy Broth(TSB)中在培养管中培养。如下制备染色组合物:将核酸染料GelGreenTM(来自Biotium)在Tris缓冲盐水(100mM Trizma碱,100mM Trizma HCl,150mMNaCl,pH8.5)中从10,000x市售原液稀释至1x,预热到50℃。使用1:10,000的GelGreenTM稀释液符合制造商关于将GelGreenTM用于其预期目的的建议,即即在琼脂糖凝胶中染色DNA。这是本文所有实施例中使用的GelGreenTM的稀释液。从36℃培养箱中取出大肠杆菌培养物,以小体积1:100稀释到预热的染色组合物中,并在50℃下孵育约4.5分钟。在流式细胞仪上分析染色的大肠杆菌,并使用FL1(带通531nm(519-551))和FL2(长通>550nm)荧光通道鉴定染色的细菌(图1A和1C)。在FL1与FL2 2维相关图中鉴定为活细胞的阳性染色细胞周围定义了矩形区域(图1B)。从流式细胞术分析获得每mL大肠杆菌的计数。然后将大肠杆菌培养物在TSB中稀释以获得3种不同浓度(分别为1:10,1:100和1:1000)。将大肠杆菌培养物保持在4℃以使进一步的生长最小化直至用于分析。将每种稀释的大肠杆菌用GelGreenTM试剂染色,在流式细胞仪上分析并获得每种稀释度的计数。每种大肠杆菌培养物也在Butterfield'sPBS中适当稀释,并将1mL适当稀释的培养物一式两份涂布在Petrifilm上。将Petrifilm置于30℃培养箱中,48小时后取出,并使用自动菌落计数器计数每个Petrifilm上的菌落。获得每种大肠杆菌稀释液的平均CFU/mL。将使用GelGreenTM的流式细胞仪细菌计数的对数相对于来自Petrifilm的对数CFU计数作图(图2)。两种方法之间存在明显的线性关系,表明染料在所述条件下进入细菌细胞膜,并且还染色这些细菌的DNA/RNA。
实施例2.用GelGreenTM处理的原料乳中的大肠杆菌的染色
为了显示FL1和FL2信号图中细菌的位置,可以首先在染色组合物中计数细菌而不添加任何乳。将大肠杆菌培养物在36℃下在Trypticase Soy Broth(TSB)培养管中培养。将核酸染料GelGreenTM稀释到pH约为8.5的Tris缓冲盐水中,将其预热至50℃。从36℃培养箱中取出大肠杆菌培养物,将小体积1:100稀释到预热的染色组合物中,并在50℃下孵育约4.5分钟。在流式细胞仪上分析染色的大肠杆菌,并使用FL1和FL2荧光通道鉴定染色的细菌(图3A)。
为了显示未加标的原料乳中FL1、FL2信号的情况,分析了低细菌数原料乳。当地获得的原料乳(通常来自农场)具有非常低的细菌数,范围为1000至50,000CFU/mL。包含GelGreenTM作为核酸染料的染色组合物以与实施例1相同的方式制备,除了蛋白酶16L(来自Novozymes)以1.92×103NPU/ml的量加入,其中NPU是“NovoProtease Unit”,其是与Anson(AU)相同的单位。将染色组合物预热至约50℃;将少量原料乳样品预热足够长的时间使样品达至约50℃;将预热的样品在预热的染色组合物中稀释约1:10;将具有染色组合物的样品在22.5kHz下超声处理约5秒。这优选通过将超声波探头直接放置到样品中来完成,但也可以通过将适当的超声波探头放置在样品管上来间接进行。将具有染色组合物的样品在约50℃下孵育约4至5分钟;将样品再次超声处理约5秒钟,最后在流式细胞仪上分析样品,检测来自细菌的荧光信号,并测定每单位体积的计数。进行了进一步的研究,表明在稍高的温度(56℃,更优选62℃)下实现了更好的染色。
按照GelGreenTM原料乳处理染色方法方案处理并分析少量原料乳(图3B)。为了显示加标原料乳的FL1和FL2信号,将已知数量的大肠杆菌放入已知体积的相同原料乳中并保持在4℃直至处理、染色和在流式细胞仪上分析。使用相同的GelGreenTM原料乳处理染色方法方案处理和分析具有大肠杆菌的原料乳。在原料乳中鉴定出明显的大肠杆菌群,落入FL1FL2计数区域(图3C)。FL1FL2计数区域由图3A、B和C中的方形门控示出,并且还基于图3A、B和C的结果来识别。这清楚地表明,如本文所公开的方法提供了追踪可以在原料乳样品中追踪的细菌的快速方式。
实施例3.原料乳中细菌流式细胞术计数的验证。
选择革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,将其置于原料乳中,按照实施例2中公开的GelGreenTM原料乳处理染色方案进行处理和分析。结果如图4所示。选择的革兰氏阳性菌是单核细胞增生李斯特菌。(Lm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和蜡状芽孢杆菌(Bc)。选择的革兰氏阴性生物是铜绿假单胞菌(Pa)和大肠杆菌(Ec)。将不同浓度的每种培养物放入原料乳样品中并保持在4℃直至处理。如实施例2中所述,按照GelGreenTM方案处理和分析具有个体细菌培养物的每种原料乳样品。将具有个体细菌培养物的每种原料乳样品在Butterfield's PBS中适当稀释,并将1mL一式两份地涂布在Petrifilms上并获得CFU/mL。将得到的每mL的对数FCM计数相对于对数Petrifilm CFU/mL作图。这显示提供这种新方法的验证的整体线性关系(有一些异常值)。
实施例4.用不同的核酸染料染色大肠杆菌。
将大肠杆菌培养物在36℃下在Trypticase Soy Broth(TSB)中培养,用GelGreenTM染色,并如实施例2中所述在流式细胞仪上计数(图5)。然后将大肠杆菌培养物保持在4℃直至用其他核酸染料染色。选择核酸染料-1和Safe(均来自ThermoFisher Scientific)作为替代品。-1是非对称花青染料噻唑橙的二聚体,其是不可渗透细胞的。Safe是一种DNA凝胶染色剂,专门用于降低诱变性,但与GelGreenTM不同,它可以轻易穿过细胞膜。两种染料都具有与GelGreenTM相似的光谱性质,并使用与GelGreenTM相同的稀释系数在Tris缓冲盐水中稀释。大肠杆菌的染色在室温(~23℃)或50℃下进行约4.5分钟,在流式细胞仪上进行分析,并使用FL1FL2计数区域获得计数。此外,将GelGreenTM在150mM NaCl溶液中稀释并用于在23℃和50℃下染色大肠杆菌,在流式细胞仪上分析并获得荧光标记的细菌计数(四个条,左)。图2显示了使用流式细胞仪从两种温度和pH=8.5的Tris缓冲盐水和盐水溶液中获得的细菌计数数据。该条形图清楚地显示-1即使在50℃的Tris缓冲盐水中也不会染色大肠杆菌。它还表明Safe是细胞渗透性的,不需要加热来染色大肠杆菌。GelGreenTM在室温下不会在NaCl溶液和Tris缓冲盐水中染色大肠杆菌。这是预料之中的,因为GelGreenTM专门设计为不穿过细胞膜。然而,非常令人惊讶的是,在NaCl溶液中,GelGreenTM在50℃时对大肠杆菌的染色极少,但在Tris缓冲盐水中,在50℃时基本上染色了所有细菌细胞。
实施例5.使用GelGreenTM在原料乳和盐水中使用不同温度染色大肠杆菌
为了表明本发明的方法也适用于除原料乳之外的其他液体样品,制备了两种不同的加标溶液:一种基于原料乳,另一种是水+0.9%盐(=150mM NaCl也称为盐水)。通过向45ml溶液中加入200μl细菌培养物,向两种溶液中加标大肠杆菌。如实施例1所述,用相同稀释度的GelGreenTM(来自Biotium)制备染色组合物,但这次在进一步包含0.12AU/ml液体2.4L FG(来自Novozymes)的Tris-盐水溶液(200mM Trizma碱,150mM NaCl,pH10.6)中进行。孵育如前面的实施例中所述,除了加标的原料乳样品在60、40和23℃孵育,加标的盐水样品在60、35和25℃孵育1分钟。图6中提供的结果清楚地表明,当使用约60℃的温度时,可以计数比使用较低温度时更多的细菌细胞。每个图包含四个象限:Q1,Q2,Q3和Q4。Q4中提供的计数表示这四个象限中每个象限给出的细胞数。很明显,在左侧图(上排和下排)中,Q2中的计数明显更高,并且绘图比中间和右侧图更强烈。其他数据(未显示)表明,当温度在60℃左右进一步微调时,该染料和此pH值的最佳温度似乎约为62℃。该非常特定的温度不限制本发明的范围,因为原始不可渗透细胞的核酸染料变成细胞可渗透的任何温度都是合适的。本文公开的最佳范围是40至70℃,进一步优选的范围是60至68℃,非常优选的温度点是62℃。
实施例6.液体样品中体细胞和细菌细胞之间的分化
还研究了在单一液体样品中是否可以区分体细胞和细菌细胞。为此,在荷兰北部的不同农场收集了29个散装罐装乳样品。用与实施例5相同的染色组合物处理所有这些样品。用1800μl染色组合物稀释200μl未加热的原料乳,并在约62℃孵育1分钟;在孵育开始和结束时将样品在40kHz下超声处理5秒并在流式细胞仪上分析。对(增益)设置进行了微调,以便同时计算体细胞和细菌的最佳结果。基于FL1和FL2荧光信号的模式定义矩形体细胞计数门控。图10中的右上方矩形门控显示了门控。在该图中,左侧显示了高细菌数和高体细胞计数的乳样品。在右侧显示低细菌和低体细胞计数的乳样品。左下方的矩形门控定义了细菌计数区域,而右上方的门控定义了体细胞计数区域。
通过计数右上方体细胞计数区域中的点来确定所有29个样品的体细胞计数。作为参考,通过符合ISO13366-2的SomaScope SMART(Delta Instruments,荷兰)分析相同的散装罐乳样品,以获得参考体细胞计数(MBC)。两个结果都绘制在图11中的相关图中。该相关性的R2为0.9684。
对于每个散装罐乳样品,通过计算左下方矩形门控中的点来确定细菌计数。使用传统Petrifilm好氧计数板(AOAC官方方法986.33)获得所有29个散装罐乳样品的细菌参考计数。在图12中,显示了细菌计数的相关性结果。该相关性的R2为0.8247。
这些(R2)结果清楚地显示了通过使用相同的荧光信号FL1和FL2同时计数体细胞和细菌的能力。
为了用验证这种方法,收集了来自乳品厂的当地获得的原料散装罐装乳。24小时的原料乳没有很高的细菌数,因此大肠杆菌在32℃的TSB中生长过夜(约15小时)。将量为200μl的细菌培养物加入到45ml体积的24小时原料散装乳中并保持在4℃直至分析。
除了用0.12KNPU/ml16L蛋白酶(来自Novozymes)代替蛋白酶以外,以实施例5中的相同方式制备包含GelGreenTM作为核酸染料的染色组合物。用1800μl染色组合物稀释200μl未加热的原料乳,并在约68℃孵育1分钟;在孵育步骤之前和之后,将样品在40kHz下超声处理5秒,并在流式细胞仪上分析;检测来自细菌的荧光信号并确定每单位体积的计数。传统平板计数用于获得细菌参考计数。如本文所用,术语“传统平板计数”是指Petrifilm好氧计数板(AOAC官方方法986.33)。流式细胞仪中24h原料乳的个体细菌计数(IBC)/ml的对数(LOG)为5.61,CFU/ml petrifilm的对数为4.83。在流式细胞仪中加标大肠杆菌的24小时原料乳的IBC的对数为6.48。CFU/ml petrifilm的对数为6.69。该实验显示了如图12所示的IBC/ml和CFU/ml之间相同的良好相关性(数据未显示)。
实施例7.研究不同的不渗透细胞的染料
核酸染料 Green和碘化丙锭针对GelGreenTM(参考方法)进行测试。在本实施例中,实施例6中概述的后一种条件和发现导致IBC/ml和CFU/ml之间良好相关性的条件被用作“参考方法”,即i)使用包含如实施例1中所述的GelGreenTM(来自Biotium)在Tris-盐溶液(200mM碱,150mM NaCl,pH 10.6)和0.12KNPU/ml16L蛋白酶(来自Novozymes)中相同稀释度的染色组合物,ii)使用的孵育温度为约68℃持续1分钟,和iii)在孵育之前和之后在40kHz下进行5秒的超声处理。使用与参考方法相同的染色和孵育条件测试核酸染料 Green和碘化丙锭,不同之处在于染色组合物中包含的染料类型不同。在染色组合物中使用浓度为1.25μM的在染色组合物中使用浓度为5μM的Green和碘化丙锭。使用了三种不同类型的乳:当地农民收集的来自农场和乳品厂的当地获得的原料散装罐装乳。这种乳被称为新鲜原料乳并且不超过24小时。从乳品厂获得24小时和48小时的乳。由于新鲜原料乳的细菌数不高,因此分别加标活的或死的大肠杆菌细胞。为此目的,将大肠杆菌在TSB中于32℃生长过夜(约15小时)。通过在110℃下加热生长的大肠杆菌10分钟获得死细菌。将量为200μl的大肠杆菌(活的或死的/损坏的)加入到45ml新鲜的原料散装乳中。活体和死体均来自同一培养管,并且在45ml新鲜原料乳中加入完全相同的量。将所有乳样品保持在4℃直至分析。如下进行乳样品中细菌染色(和计数)的方法:用1800μl染色组合物稀释200μl未加热的乳,并在约68℃孵育1分钟;在孵育之前和之后,将样品在40kHz下超声处理5秒。最后,在流式细胞仪上分析样品,检测来自细菌的荧光信号,并测定每单位体积的计数。纯化水用作阴性对照(此处称为空白样品(blanc样品))。
从图13中可以看出,对于blanc样品,新鲜散装罐乳样品和24小时散装罐乳样品与使用GelGreenTM的标准参考方法显示出良好匹配(参见图13)。对于48小时的散装罐装乳、加标大肠杆菌的乳和加标大肠杆菌并蒸煮10分钟的乳,显示略低于使用GelGreenTM的标准参考方法的IBC。然而,这些结果仍然足以用于量化散装罐装乳中的IBC,因为高(>100万/ml)IBC数量的准确度规格低于低IBC数量。此外,由于与标准参考方法相比,在高IBC数量下结果较低,因此可以通过数学校正功能轻松补偿这些结果。因此,从这些实验结果可以得出结论,是GelGreenTM的良好的不可渗透细胞的替代染料。
与基于标准参考方法的GelGreenTM相比,对于鲜乳、24小时乳、48小时乳和加标和蒸煮的乳,Green显示(显著)更高的IBC数量。然而,对于加标乳,与基于标准参考方法的GelGreenTM相比,IBC显著降低。这证明Sytox green不会染色细菌(与GelGreen参考方法相比,基于Sytox的加标乳计数太低)并且使用Sytox Green的背景噪音太高(未加标样品的计数太高)。这些结论得到了这些实验的原始(点图)数据(此处未显示)的支持。因此可以得出结论,Sytox green不起作用,因此不能用作Gelgreen的替代品。
在测试条件下,碘化丙啶显然不起作用。除了加标大肠杆菌并蒸煮10分钟的散装罐装乳外,几乎没有看到乳样品的IBC计数。这与碘化丙锭的性质一致,因为该染料仅穿透死细胞的细胞膜。最有可能的是,其他乳样品中的细菌细胞膜没有受到足够的损害以使得碘化丙锭可以通过。
实施例8.研究不同的缓冲液
为了研究pH值约为10.6但含有除实施例5-9中使用的Tris-盐水溶液之外的其它缓冲液或溶液的染色组合物的有用性,将不含NaCl的Tris缓冲液(=Tris溶液)、CAPS缓冲液和碳酸氢钠缓冲液针对“参照缓冲液”Tris-盐水缓冲液(200mM碱,150mMNaCl,pH10.6)进行测试。除了缓冲液/溶液之外,使用的染色组合物和染色方法与实施例7中的相同。为了比较,制备不同的染色组合物来用无NaCl的200mM碱、用NaOH滴定至pH 10.6(约100mM NaOH)的100mM CAPS或用NaOH滴定至pH 10.6(约100mM NaOH)的200mM碳酸氢钠代替200mM碱、150mM NaCl。从乳品厂和农民收集当地获得的原料散装罐装乳。用1800μL染色组合物稀释200μL未加热的原料乳,并在约68℃下孵育1分钟;在孵育之前和之后将样品超声处理5秒。最后,在流式细胞仪上分析样品,检测来自细菌的荧光信号,并测定每单位体积的计数。纯化水用作阴性对照(此处称为blanc样品)。
从图14中可以清楚地看出,不含NaCl的Tris溶液是Tris-盐溶液的良好替代品。IBC结果与参考方法中使用的标准Tris-盐水溶液不具有统计学显著性差异。CAPS(CAPS=N-环己基-3-氨基丙磺酸)缓冲液在高IBC样品中显示出更高的IBC数。由于高IBC样品的准确度与低IBC样品相比不那么重要,并且高IBC数量的这种差异可以通过数学校正函数轻松校正,因此可以得出结论,CAPS缓冲液也是标准Tris-盐水的良好替代品。
在测试条件下,碳酸氢钠缓冲液显然不起作用。低IBC样品的IBC数量太高。而且,碳酸氢钠的2个重复之间的变化太高,导致重复性差,因此结果不准确。这可能是由使用这种碳酸氢钠缓冲液的高噪声信号引起的。
实施例9.用原料乳样品研究不同的温度设置
在实施例5中,讨论了通过使用不同温度设置和加标大肠杆菌的盐水液体进行本发明方法的实验结果。在构建第一个严重的原型后,最终设置已经略微调整到优选68℃的温度。
从实施例5可以清楚地看出,低于最佳设置的温度导致减少的DNA染色和细菌计数性能。由于这些实验是用盐水液体而不是用乳进行的,因此已经进行了对原料乳样品的额外实验。如实施例7中所述获得鲜乳和24小时乳,并且如实施例7中所述,将鲜乳加标活大肠杆菌。将乳样品保持在4℃直至分析。通过如实施例7中所述的参考方法进行原料乳中的细菌染色(和计数)的方法。
从图15中所示的结果可以得到与实施例5相同的结论。降低温度设置会降低细菌计数性能。例如,对于40℃的温度设置,可以看出,与基于标准68℃的参考方法相比,新鲜加标乳的IBC数量太低。
在图16中,显示了在90℃温度下的原料乳实验结果。与基于68℃的参考方法相比,所有样品的IBC结果略高。由于空白样品的IBC结果也(显著)更高,因此这些较高IBC数的原因可能是由于90℃时较高的噪声信号水平。然而,这些结果的一致性很好,从而可以得出结论,90℃的温度仍然可以正常工作。最有可能的是,温度高达100℃也可以正常工作,尽管在这些高温下可能会出现一些实际限制。
实施例10.用原料乳样品研究不同的pH设置
如实施例7中所述获得新鲜原料乳和24小时乳,并且如实施例7中所述分别向鲜乳中加标活的和死的大肠杆菌。将乳样品保持在4℃直至分析。使用包含pH=10.6的Tris-盐水溶液的染色组合物对原料乳中的细菌进行染色、孵育和计数的参考方法如实施例7中所述进行。对于测试的其他pH值,染色组合物与参考方法的染色组合物的不同之处在于将pH=10.6的Tris-盐水溶液分别滴定至pH=8.7和7.0。
从图17中所示的结果可以看出,使用8.7的pH而不是10.6的标准设定的pH也给出了良好的结果。IBC数量与参考方法相当。然而,7.0的pH值显然不再起作用。低IBC乳样品中的IBC数量太高(例如,与新鲜乳的参考方法相比,每毫升超过150万计数更高)。因此,权利要求的pH范围限定在约8至约11.5,约8至约8,约8至约10.6或约8.5至约10.6的pH。
有利的实施方案在以下条款中列出:
1.一种计数液体样品中的细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将蛋白酶与在室温和中性pH下为不可渗透细胞的核酸染料混合,以形成染色组合物;
b)将所述染色组合物与所述样品混合;
c)任选地超声处理步骤b)的混合物;
d)将混合物在40至70℃,优选在60至68℃,更优选在62℃孵育;
e)任选地对步骤d)的孵育混合物进行超声处理;和
f)计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞。
2.根据条款1的方法,其中所述细胞是体细胞和/或细菌细胞。
3.根据条款1或2的方法,其中所述液体样品是选自乳、血液、尿液、唾液、粪便和脊髓液的生物样品。
4.根据条款1或2的方法,其中所述液体样品是环境样品,例如废水。
5.根据条款1至4中任一项的方法,其中所述染色组合物具有使所述核酸染料可渗透细胞的pH。
6.根据条款5的方法,其中所述染色组合物的pH为8至10.6,并且其中所述孵育在8至10.6的pH范围内进行。
7.根据条款1至6中任一项的方法,其中将所述蛋白酶和所述核酸染料在Tris-NaCl缓冲液中混合以形成所述染色组合物。
8.根据条款1至7中任一项的方法,其中在将所述染色组合物与所述样品混合之前,将所述染色组合物加热至40至70℃,优选至60至68℃,更优选至62℃。
9.根据条款1至8中任一项的方法,其中在将所述样品与所述染色组合物混合之前或之后,将所述样品加热至40至70℃,优选至60至68℃,更优选至62℃。
10.根据条款1至9中任一项的方法,其中所述核酸染料是来自GelGreenTM或GelRedTM染料家族的染料,优选10,10'-(6,22-二氧代-11,14,17-三氧杂-7,21-二氮杂七氮烷-1,27-二基)双(3,6-双(二甲基氨基)吖啶-10--鎓)碘化物)。
11.根据条款1至10中任一项的方法,其中所述蛋白酶是蛋白酶型枯草杆菌蛋白酶。
12.根据条款1至11中任一项的方法,其中通过使用荧光检测仪器,例如流式细胞仪,荧光显微镜或荧光成像系统,荧光计或荧光板读数器对染色的细胞进行计数。
13.一种由渗透细胞的GelGreenTM或GelRedTM家族染料制备核酸染料的方法,所述方法包括以下步骤:将所述染料在合适的缓冲液中保持在8至10.6的pH值并在所述缓冲液中加热所述染料至温度为40至70℃,优选温度为60至68℃,更优选温度为62℃。
14.一种用于计数液体样品中的体细胞和/或细菌细胞的装置,所述装置包括:
-用于将液体样品与染色组合物混合以获得混合物的混合杯;
-用于将液体样品提供给混合杯的样品入口;
-用于将染色组合物提供给混合杯的染色组合物入口;
-加热元件,用于将混合杯和混合物加热至40至70℃的适当温度,优选至60至68℃的温度,更优选至62℃的温度;
-任选地用于向混合物提供超声形式的能量的超声波仪,其中超声波仪的尖端布置在混合物中或者放置在混合杯上;
-用于获得混合物或其部分并将所述混合物或其所述部分提供给测量模块的出口;和
-用于计数所述混合物中或其所述部分中的染色细胞的测量模块。
虽然已详细描述了本发明的优选实施方案,但应当理解通过前述段落限定的本发明不限于前面的描述中所示的具体细节,因为其许多明显的变化是可能的而不脱离本发明的精神或范围。
Claims (33)
1.一种计数液体样品中的细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)将包含二聚核酸染料和缓冲剂的染色组合物与所述样品混合;
b)任选地超声处理步骤a)的混合物;
c)将混合物在约45℃至约95℃的温度下孵育少于10分钟;
d)任选地超声处理步骤c)的孵育混合物;和
e)计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞,
其中所述核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸染料部分,并且BRIDGE连接Q1和Q2。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述二聚核酸染料在37℃和中性pH孵育30分钟后对HeLa细胞是不可渗透细胞的。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述二聚核酸染料能够通过按需释放机制与DNA结合。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述BRIDGE是基本上脂族的、基本上中性的连接基,其包含约8至约150个非氢原子。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述BRIDGE具有下式:
-L-[A1-(CH2)α-]a[A2-(CH2)β-]b[A3-(CH2)γ-]c[A4-(CH2)δ-]d[A5-(CH2)ε-]e[A6-(CH2)ζ-]f[A7-(CH2)η-]g[A8-(CH2)θ-]h[A9-(CH2)ι-]i-A10-L-,
其中:
-每个L是BRIDGE的一部分并且与Q1或Q2共价连接,并且独立地是包含单键的部分;具有1个碳原子至约12个碳原子并且任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的多亚甲基单元,或任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基,
-α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ和ι独立地为0或1至约20的整数,
-a、b、c、d、e、f、g、h和i独立地为0或1至约20的整数,
-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10独立地选自核酸结合增强基团、任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的支链烷基和任选地包含至少一个选自N、O和S的杂原子的至少一个饱和的5-或6-元环。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述BRIDGE具有下式:
—(CH2)x—C(═O)NH—(CH2)α—[O—(CH2)β]b—[O—(CH2)γ]c—NH(O═C)—(CH2)x—,其中:
-BRIDGE的每个L的是—(CH2)x—,其中每个x独立地是选自1到11的整数,
-α可以是选自2至约20的整数,
-β和γ独立地为0、2或3,
-b为0或选自1至约20的整数,和
-c为0、1或2。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,
-BRIDGE的每个L是—(CH2)x—,其中每个x是5,
-α是2或3,
-β是2,
-b是1或2
-c为0、1或2,和
-当c为1或2时,γ为3。
8.根据权利要求7所述的方法,其中BRIDGE具有选自以下的式:
a)—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,和
b)—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中Q1和/或Q2是荧光核酸染料部分。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述荧光核酸染料部分来源于选自下组的核酸染料:基于吖啶的核酸染料,基于非对称花青的核酸染料,基于菲啶鎓的核酸染料,基于对称性花青的核酸染料,派洛宁核酸染料,苯乙烯基核酸染料,DAPI的衍生物和Hoechst染料的衍生物。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述荧光核酸染料部分来源于选自下组的核酸染料:基于吖啶的核酸染料,基于非对称花青的核酸染料和基于菲啶鎓的核酸染料。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述荧光核酸染料部分是具有结构I的基于吖啶的核酸染料:
其中,
-每个R1独立地选自H、C1-C2基团和烷基,
-BRIDGE连接至R2或R3,
-当BRIDGE连接至R2时,R3选自H或-CH3,
-当BRIDGE连接至R3时,R2选自H、-CH3、-NH2、-NHCH3、-CN和-C(═O)NH2,
-R6和R7各自独立地选自H、C1-C2基团和烷基,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述荧光核酸染料部分是具有结构II的基于非对称花青的核酸染料:
其中,
-BRIDGE连接至R7,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述荧光核酸染料部分是具有结构III的基于菲啶鎓的核酸染料:
其中,
-BRIDGE连接至R1,和
-ψ是平衡与染料相关的正电荷的阴离子。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中Q1和Q2是相同的。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述二聚核酸染料选自:
a)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求13所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,
b)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求13所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—,
c)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求14所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,和
d)二聚核酸染料,其中Q1和Q2都是如权利要求15所定义的荧光核酸染料部分,并且通过下式的BRIDGE连接:—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述缓冲剂是有机缓冲剂。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述缓冲剂包括胺。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述缓冲剂选自Tris和CAPS。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述缓冲剂以约10至约500mM,例如约20至约400mM,约40至约300mM,约60至约400mM,约80至约300mM或约100至约200mM的浓度存在。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述染色组合物还包含蛋白酶,例如丝氨酸内肽酶。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述蛋白酶的存在量为约0.1AU/ml至约2×103酶AU/ml(Anson单位/ml),例如约0.12AU/ml至约1.92×103AU/ml。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述染色组合物的pH为约8至约11.5,例如约8至约11,约8至约10.6,约8.5至约10.6。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤c)在约45至约95℃的温度下进行,例如约47至约90℃,约50至约85℃,约52℃至约80℃,约57至约75℃,约60至约70℃,约61至约69℃或约62至约68℃。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤c)在约8至约11.5,例如约8至约11,约8至约10.6,约8.5至约10.6的pH下进行。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤c)进行少于9小时,例如少于8、7、6、4、3或2分钟,例如进行约1分钟。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞是体细胞和/或细菌细胞。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中将步骤a)中获得的混合物和/或步骤c)中获得的混合物在约15至约50kHz下超声处理约1至约10秒。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述液体样品包括选自乳、血液、尿液、唾液、粪便和脊髓液的生物样品。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中通过使用荧光检测仪例如流式细胞仪、荧光显微镜或荧光成像系统、荧光计或荧光板读数器对染色的细胞进行计数。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述液体样品是乳,例如乳,所述方法包括以下步骤:
a)将包含二聚核酸染料、蛋白酶和缓冲剂的染色组合物与所述乳混合;
b)任选地在约15至约50kHz下超声处理步骤a)的混合物约1至约10秒,例如约5秒;
c)将混合物在约62℃至约68℃的温度下孵育约1分钟至约5分钟;
d)任选地在约15至约50kHz下超声处理步骤c)的孵育混合物约1至约10秒,例如约5秒,和
e)使用流式细胞仪计数在所述混合物或其部分内用所述染料染色的细胞;
其中,
-核酸具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是由BRIDGE连接的核酸染料部分,
-Q1和Q2相同并且选自具有结构I、结构II和结构III的核酸染料部分,
-其中BRIDGE具有选自下组的式:
—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)3—[O—(CH2)2]2—O—(CH2)3—NH(O═C)—(CH2)5—,和
—(CH2)5—C(═O)NH—(CH2)2—O—(CH2)2—NH(O═C)—(CH2)5—,和
-所述缓冲剂是Tris。
32.一种用于执行前述权利要求中任一项所述的方法的装置,所述装置包括:
-用于将液体样品提供给混合杯的样品入口;
-用于向混合杯提供染色组合物的染色组合物入口,所述染色组合物包含二聚核酸染料和缓冲剂,其中所述二聚核酸染料具有式Q1-BRIDGE-Q2,其中Q1和Q2是核酸酸性染料部分并且BRIDGE连接Q1和Q2;
-用于将液体样品与染色组合物混合以获得混合物的混合杯;
-加热元件,用于将混合物加热至约45℃至约95℃的适当温度,持续不超过10分钟;
-用于获得混合物或其部分和将所述混合物或其部分提供给测量模块的出口;
-用于计数所述混合物中或其所述部分中的染色细胞的测量模块;
并且该装置任选地包括用于向混合物提供超声形式的能量的超声波仪,其中超声波仪的尖端布置在混合杯内部或者放置在混合杯上。
33.根据权利要求32所述的装置,还包括控制器,其被配置为:
a)控制样品入口和染色组合物入口以将液体样品和染色组合物分配到混合杯中,
b)控制混合杯以将液体样品和染色组合物混合在混合杯中以获得混合物,
c)任选地控制任选的超声波仪以超声处理混合物,
d)控制加热元件以将混合物加热至约45℃至约95℃的适当温度,持续不超过10分钟;
e)任选地控制任选的超声波仪以对孵育的混合物进行超声处理,
f)控制出口以将混合物或其部分提供给测量模块,和
g)控制测量模块以计数在混合物或其部分内用所述染料染色的细胞。
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