CN109627449A - Peg化树枝状大分子药物载体及其制备方法 - Google Patents

Peg化树枝状大分子药物载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种PEG化树枝状大分子药物载体的制备方法：使三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在冰水浴下混合，在保护气氛下于有机溶剂中交替反应，反应温度为25‑60℃，得到以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子；将PEG、对硝基苯基氯甲酸酯和三乙胺溶于有机溶剂，然后在20‑30℃下反应，反应完全后得到PEG化对硝基苯基碳酸酯；将以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子与PEG化对硝基苯基碳酸酯在有机溶剂中反应，反应温度为20‑30℃。本发明的方法操作容易、产率高、成本低，所制备的药物载体对难溶于水的药物具有优异的载药性能。

Description

PEG化树枝状大分子药物载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及树枝状大分子合成技术及药物载体技术领域，尤其涉及一种PEG化树枝状大分子药物载体及其制备方法。
背景技术
近年来，利用纳米药物输送系统(NDDSs)来增强抗肿瘤药物在体内的药效被越来越多的研究者认可，使其成为一种新型的载药系统。NDDSs能够增加生物膜透过性、脂溶性药物的溶解度，不仅具有稳定性好、使药物靶向递送至肿瘤部位并缓慢释放的优势，同时也减少了给药剂量、给药次数以及对其他脏器的损害，应用前景广阔。NDDSs纳米载体类型多样，包括脂质体、聚合物纳米粒、聚合物胶束、碳纳米管、固体脂质纳米粒、囊泡及树枝状聚合物等。其中，由于聚合物纳米材料具有稳定性好、靶向性配体修饰降低体内非特异性分布、增加药物在肿瘤组织的浓度等优点，其受到高度关注。并且聚合物纳米材料利用两亲性聚合物自聚集的特点，形成了核壳结构纳米粒包载难溶性抗癌药物的方式来提高药物溶解性、增强抗癌效率。该领域的研究与应用越来越多，证明了独特的优势。
聚合物纳米粒(PNPs)是一种亚微粒(＜1000nm)大小的分散系统，可由不同结构线性、二嵌段、三嵌段、交联、星形或树枝状聚合物制成或由单体聚合而成。另外，一些天然材料如白蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖等也被用于作为PNPs的载体材料。其中，聚酯类、聚氨基酸类、聚氰基丙烯酸烷酯等是较为常用的载体材料，此类载体材料具有两亲性的特点。由于两亲性聚合物载体材料分子中同时具有亲水基团和疏水基团，在水溶液中亲、疏水链溶解性差异导致两亲性自组装形成核壳结构的纳米粒：亲水链形成纳米粒的外壳，疏水链形成内核。内核作为难溶性药物的储库，使药物溶解度增加，同时由于外壳亲水链的修饰，纳米粒能够躲避网状内皮系统(RES)的识别和吞噬，实现血液系统长循环。但聚合物药物载体的稳定性在很大程度上限制了它的实际应用，尤其是在载体形成过程中，当聚合物浓度低于临界浓度时，药物载体本身的稀释将严重影响其载药效果。纳米粒表面通过物理吸附、共价键结合、层层沉积等方式用聚合物或其他生物性配体进行修饰，修饰的程度往往取决于表面分子的密度和构象，而这些都影响着纳米粒在生物微环境中的行为。为了提高聚合物所形成的药物载体稳定性及超分子纳米结构的完整性，以便于它们在生物环境中更好地应用，人们一直致力于研究稳定的载体结构，因为稳定的载体结构不仅具有渗透性强，增容效果好等优点，还具有独立完整的结构，它的特殊结构和性质决定了它在多个领域具有广泛应用价值。
中国专利CN103212082 A报道了利用可逆加成-断裂链转移聚合法合成一种聚(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐)-b-聚(N-异丙基丙烯酰胺)的嵌段共聚物，再将喜树碱有机溶液与该嵌段共聚物混合，然后用戊二醛或戊二酸类小分子交联剂对聚合物胶束壳交联反应。但该种聚合物药物载体结构粒径分布太宽，尤其是在载体形成过程中，当聚合物浓度低于临界浓度时，药物载体本身的稀释将严重影响其载药效果。中国专利CN106943601 A报道了改善蛋白质生物利用度及难溶药物水溶性的载体及制法，包括聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物的合成，氨解产物的合成，线性聚乙二醇-刷状聚苄氧羰基赖氨酸嵌段共聚物的合成，线性聚乙二醇-刷状聚苄氧羰基赖氨酸和聚赖氨酸嵌段共聚物的合成；优点是解决了蛋白质药物生物利用度及难溶药物水溶性问题，从而可制备多种注射剂，具有提高蛋白质生物利用度、增加疏水药物的水溶性、降低注射频率、减少临床病人经济负担、增强药效的特点，但其制备过程复杂，应用前景受到限制。中国专利CN108066316 A报道了采用硅纳米载体提高难溶性药物溶解度的方法。硅烷水溶液作为水相，曲拉通X-100、烷烃、醇类和致孔剂混合溶剂为油相，在搅拌条件下将水相加入到油相中形成油包水反相微乳液，待微乳液稳定后加入正硅酸乙酯(TEOS)和氨水，在乳液界面触发聚合反应形成硅纳米粒，加入丙酮终止反应，清洗后将硅纳米粒加入到乙酸溶液中溶解致孔剂，即得介孔硅纳米粒。制备的介孔硅纳米粒具有中空结构，粒径为20-100nm，中心空腔直径为5-20nm，介孔直径为1-10nm。该中空介孔纳米粒可以包封难溶性药物，提高药物的溶解度和生物利用度，为难溶药物增溶提供新的平台。但大量用到有机溶剂，现实应用意义不大。中国专利CN106334196 B报道了双亲性羟丙基-β-环糊精纳米药物载体及其载药纳米粒子的制备方法。丙烯酰化mPEG-b-PCL的合成、丙烯酰化羟丙基-β-CD的合成、双亲性羟丙基-β-环糊精纳米药物载体mPEG-b-PCL-co-AC-HP-β-CD的合成和双亲性羟丙基-β-环糊精载药纳米粒子的合成等步骤。该发明设计合理，步骤简单，用于水难溶/不溶性药物载药具理想释药效果。但其稳定性不高，靶向性不强。中国专利CN101636148 B报导了基于连接剂的卵磷脂微型乳剂输送载体。由磷脂，如卵磷脂(表面活性剂)，烷基中包括9个或更多的C原子、亲水亲油平衡(HLB)值为5或更低的亲脂性添加剂(连接剂)和烷基尾中包含6-9个C原子的类表面活性剂亲水性添加剂(连接剂)配制而成。连接剂和磷脂的结合使得制剂具有以低的表面活性剂浓度，最小的细胞毒副作用将高浓度的难溶药物输送到表皮组织的能力。但其可携带的药物种类非常少。
肿瘤组织的血管对血液中循环的纳米粒子和大分子均有高渗透性，这种现象可以引起纳米药物载体输送系统中肿瘤的EPR效应(即实体瘤的高通透性和滞留效应)。纳米药物载体通过EPR效应经过血液循环渗透到肿瘤组织，使胶束粒子在体内的循环时间延长。迄今为止，树状大分子作为药物载体得到了广泛的应用。树枝状大分子是具有独特的三维高度支化结构、表面分布大量氨基或羧基的纳米粒子和单分散性，其具备包裹药物的能力，可改变药物分子的理化性质，增加难溶药物的溶解度、稳定性及生物利用度。但是，树枝状大分子在一系列优势下存在两个重要缺陷。一是制备过程复杂及提纯过程困难；二是树枝状大分子本身的力学性质太差，主要呈粘流态。一般来说，在树枝状大分子制备过程中，为了得到分子量分布单分散的树枝状大分子，每步反应只允许存在需要量的活性官能团，多余的官能团要先保护起来，或使单体带有潜在官能团，在下一步反应之前再解保护或活化。因此合成过程要多次重复保护——解保护或官能团活化步骤。在合成过程中，有效步骤与活化步骤交替进行，两步反应才使树枝状大分子的分枝和端基增长一次。
目前国内外还没有关于端丙烯酸酯基及端氨基的树枝状大分子、PEG化端丙烯酸酯基及端氨基的树枝状大分子来负载喜树碱、左旋紫草素等难溶性抗癌药物的公开报道和专利申请。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种PEG化树枝状大分子药物载体及其制备方法，本发明的方法操作容易、产率高、成本低、对环境无污染，所制备的药物载体对难溶于水的药物具有优异的载药性能，不仅能够快速、高效地吸附难溶性药物，还能够在特定环境下及时、高效、靶向的释放。
在一方面，本发明提供了一种PEG化树枝状大分子药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用Michael加成反应，使三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)和乙二胺(EDA)在保护气氛下于有机溶剂中交替反应，反应温度为25-60℃，得到以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子；
(2)将PEG、对硝基苯基氯甲酸酯和三乙胺溶于有机溶剂，然后在20-30℃下反应，反应完全后得到PEG化对硝基苯基碳酸酯；其中，步骤(1)和步骤(2)没有先后顺序；
(3)将所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子与所述PEG化对硝基苯基碳酸酯在有机溶剂中反应，反应温度为20-30℃，反应完全后得到所述PEG化树枝状大分子药物载体，包括PEG-端氨基树枝状大分子药物载体或PEG-端丙烯酸酯基树枝状大分子药物载体。
进一步地，在步骤(1)中，所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子为G2.0(NH2)18，其制备方法包括以下步骤：
(a1)按照质量比为(1-6):(3-10)，将三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在30-60℃下反应10-20h，得到G1.0(NH2)3；所述三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和有机溶剂的质量比为(1-6):(1-5)；
(a2)按照质量比为(0.1-0.5):(2-30)，将G1.0(NH2)3与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应15-50h，得到G1.5(acrylate)18；所述G1.0(NH2)3和有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.5-4)；
(a3)按照质量比为(0.1-0.6):(1.5-10.0)，将G1.5(acrylate)18与乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应10-20h，得到G2.0(NH2)18；所述G1.5(acrylate)18和有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.1-1)。
以上方法获得了以EDA为核的第1代端丙烯酸酯基树枝状大分子G1.0(acrylate)8，G2.0(acrylate)48和第1.5代端氨基树枝状大分子G1.5(NH2)8。
进一步地，在步骤(1)中，所述以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子为G2.0(acrylate)48，其制备方法包括以下步骤：
(b1)按照质量比为(1-6):(0.04-0.5)，将三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应4-8h，得到G1.0(acrylate)8；所述三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和有机溶剂的质量比为(1-6):(0.4-2.0)；
(b2)按照质量比为(0.1-0.6):(1.5-10)，将G1.0(acrylate)8与乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应10-20h，得到G1.5(NH2)8；所述G1.0(acrylate)8和有机溶剂的质量比为(0.1-0.6):(0.1-1)；
(b3)按照质量比为(0.1-0.5):(2-30)，将G1.5(NH2)8与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应30-60h，得到G2.0(acrylate)48；所述G1.5(NH2)8与有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.5-4)。
以上方法获得了以TMPTA为核的第1代端氨基树枝状大分子G1.0(NH2)3,G2.0(NH2)18和第1.5代端丙烯酸酯基树枝状大分子G1.5(acrylate)18。
在本发明中，仅采用Michael加成反应，使三官能团的TMPTA和四官能团的EDA(A3-B4体系)交替反应，省去了繁琐的官能团保护及解保护步骤，每一步反应都使树枝状大分子有效增长，大力提高了合成工作效率。本发明选择的两种单体都带有多官能团，既能作核又能作支化单体，所得树枝状大分子的端基增长非常迅速，尤其是EDA作核时，整代树枝状大分子的端基增长速度为8×6n-1，而大多数已报导的树枝状大分子的端基增长速度为4×2n -1。本发明的来自TMPTA和EDA的半代和整代树枝状大分子都含有丙烯酸酯双键或氨基，EDA为核，半代树枝状大分子表面带氨基，整代树枝状大分子表面带丙烯酸酯双键；TMPTA为核，半代表面为丙烯酸酯双键，整代表面为氨基。丙烯酸酯基及氨基很容易转化成其他官能团，因此所得树枝状大分子表面很容易进一步功能化。
进一步地，在步骤(1)中，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在-5℃至5℃下混匀后反应。
进一步地，有机溶剂为甲醇、四氢呋喃和二甲亚砜中的一种或几种。
进一步地，在步骤(2)中，PEG、对硝基苯基氯甲酸酯和三乙胺的质量比为(1-12):(2-20):(1.5-8.5)。
进一步地，在步骤(2)中，PEG的质量和有机溶剂的体积比为(1-12g):(5-50mL)。
进一步地，在步骤(2)中，反应时间为20-30h。
进一步地，在步骤(3)中，反应时间为3-5天。
进一步地，在步骤(3)中，以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子的质量与有机溶剂的体积比为(2-5g):(50-150mL)。
进一步地，在步骤(3)中，所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子与所述PEG化对硝基苯基碳酸酯的质量比为(2-5):(3-20)。
由于树枝状大分子其力学性质差，无法广泛应用于生物医用领域，而在生物医药及生物技术方面得到了广泛应用的具有亲水性、水溶性和油溶性、无毒性及无抗原性和免疫原性等的聚乙二醇(PEG)，在分子上又只有两端有活性基团,限制了其在生物材料上的应用。因此在步骤(3)中，将树枝状大分子接枝到有一定力学强度的PEG两端，使其末端活性官能团数量呈几何增长。由于树枝状分子上的羧基在反应时有很大的空间位阻效应，故接枝反应很难完全，本方法采用高浓度溶液聚合可以将树枝状大分子的接枝率提高到96％以上。
在另一方面，本发明还提供了一种采用上述制备方法所制备的PEG化树枝状大分子药物载体。
进一步地，PEG化树枝状大分子药物载体用于负载难溶性药物。难溶性药物指的是难溶于水的药物，如抗癌药物等。
进一步地，难溶性药物为喜树碱、左旋紫草素、黄芩素、水飞蓟素、葛根素和槲皮素中的一种或几种。
进一步地，PEG化树枝状大分子药物载体的载药量为2.87～10.31mg/mL，载药率为24.08％～52.63％。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明采用了Michael等人公开的一种新的酸酐法的基本原理来来制备树枝状大分子，反应容易进行，结果稳定有效。在此基础上，对PEG端基进行活化，然后与制备的树枝状大分子上的氨基或羟基发生反应。本实验的合成方法高效、便捷，可得到规整、分子量分布单一的预期产物，且采用高浓度溶液聚合可以将树枝状大分子的接枝率提高到96％以上。
本发明的制备方法具有操作容易、产率高、成本低、对环境无污染和应用前景广等优点，是新一代高性能载药产品的典范，可用于难溶性药物的体内输送，尤其是针对肿瘤细胞研究等医药领域。
本发明方法制备的药物载体具有优异的载药性能，不仅能够快速、高效地吸附一定浓度条件下的易降解或难溶性药物，如喜树碱、左旋紫草素，还能够在特定环境下及时、高效、靶向的释放。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明实施例1中所制备的G1.0(NH2)3、G1.5(acrylate)18、G2.0(NH2)18的HPLC测试结果；
图2是本发明实施例4中所制备的G1.0(acrylate)8、G1.5(NH2)8、G2.0(acrylate)48的HPLC测试结果；
图3是本发明实施例10和11所制备的PEG-端氨基树枝状大分子和PEG-端丙烯酸酯基树枝状大分子的HPLC测试结果；
图4是本发明G2.0(NH2)18和PEG-端氨基树枝状大分子的FTIR表征结果；
图5是本发明G2.0(acrylate)48和PEG-端丙烯酸酯基树枝状大分子的FTIR表征结果；
图6是G2.0(NH2)18、实施例10合成的PEG-端氨基树枝状大分子对喜树碱的增溶作用测试结果；
图7是喜树碱在G2.0(NH2)18、实施例10合成的PEG-端氨基树枝状大分子中的释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子为G2.0(NH2)18的合成
1、称取3.0g TMPTA单体，将其溶解于2.4g甲醇中，在冰水浴下，加入12g乙二胺，于50mL的三颈瓶中，搅拌混合均匀，升温于45℃，在氮气保护下搅拌反应18h，先减压蒸馏除去甲醇和大部分乙二胺，再分别用8g，6g，6g乙酸乙酯洗涤三次，30℃真空干燥，即得G1.0(NH2)3，其HPLC测试结果如图1a所示。
2、称取G1.0(NH2)3树枝状大分子0.5g溶于4.0g的甲醇中，再加入12.0g TMPTA，于25℃下搅拌反应18h。先减压蒸馏除去甲醇和大部分乙二胺，再分别用8g，6g，6g乙酸乙酯洗涤3次，30℃真空干燥，即得G1.5(acrylate)18，其HPLC测试结果如图1b所示。
3、再称取G1.5(acrylate)18树枝状大分子0.2g溶于0.5g的有机溶剂中，再加入3.0g乙二胺，转移至10mL的三颈瓶中，搅拌，混合均匀，于25℃下搅拌反应18h。先减压蒸馏除去甲醇和大部分乙二胺，再分别用1g，0.5g，0.5g乙酸乙酯洗涤3次，30℃真空干燥，即得G2.0(NH2)18，其HPLC测试结果如图1c所示。
实施例2以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子为G2.0(NH2)18的合成
按照实施例1的方法制备G2.0(NH2)18，不同之处在于：
在步骤1中，TMPTA、乙二胺和有机溶剂的质量比为6:3:5，反应温度为60℃，反应时间为10h。
在步骤2中，G1.0(NH2)3、TMPTA和有机溶剂的质量比为0.1:2:0.5，反应温度为30℃，反应时间为30h。
在步骤3中，G1.5(acrylate)18、乙二胺和有机溶剂的质量比为0.6:10:1，反应温度为40℃，反应时间为10h。
实施例3以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子为G2.0(NH2)18的合成
按照实施例1的方法制备G2.0(NH2)18，不同之处在于：
在步骤1中，TMPTA、乙二胺和有机溶剂的质量比为2:10:1，反应温度为30℃，反应时间为15h。
在步骤2中，G1.0(NH2)3、TMPTA和有机溶剂的质量比为0.5:25:2，反应温度为40℃，反应时间为45h。
在步骤3中，G1.5(acrylate)18、乙二胺和有机溶剂的质量比为0.3:5:0.6，反应温度为30℃，反应时间为15h。
实施例4以TMPTA为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子为G2.0(acrylate)48的制备
1、称取15g TMPTA单体，将其溶解于6.0g甲醇中，在冰水浴下，加入0.50g乙二胺，于50ml的三颈瓶中，搅拌混合均匀，升温于25℃，在氮气保护下搅拌反应6h。反应体系产物分别用80g、60g、60g甲醇洗涤3次，30℃真空干燥，即得G1.0(acrylate)8，其HPLC测试结果如图2a所示。
2、称取G1.0(acrylate)8树枝状大分子3.0g溶于3.0g的甲醇中，再加入50.0g乙二胺，转移至100mL的三颈瓶中，搅拌，混合均匀，于25℃下搅拌反应18h。先减压蒸馏除去甲醇和大部分乙二胺，再分别用8g，6g，6g乙酸乙酯洗涤3次，30℃真空干燥，即得G1.5(NH2)8，其HPLC测试结果如图2b所示。
3、再称取G1.5(NH2)8树枝状大分子0.2g溶于2.0g的甲醇中，再加入2.5g TMPTA，转移至100mL的三颈瓶中，于25℃下搅拌反应60h，然后抽真空除去甲醇，用石油醚：乙酸乙酯(体积比1.0：3.0)作淋洗剂，硅胶作固定相，柱层析，即得G2.0(acrylate)48，其HPLC测试结果如图2c所示。
实施例5以TMPTA为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子为G2.0(acrylate)48的制备
按照实施例4的方法制备G2.0(acrylate)48，不同之处在于：
在步骤1中，TMPTA、乙二胺和有机溶剂的质量比为1:0.04:0.4，反应温度为30℃，反应时间为4h。
在步骤2中，G1.0(acrylate)8、乙二胺和有机溶剂的质量比为0.6:5:0.5，反应温度为40℃，反应时间为15h。
在步骤3中，G1.5(NH2)8、TMPTA和有机溶剂的质量比为0.5:10:1，反应温度为30℃，反应时间为40h。
实施例6以TMPTA为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子为G2.0(acrylate)48的制备
按照实施例4的方法制备G2.0(acrylate)48，不同之处在于：
在步骤1中，TMPTA、乙二胺和有机溶剂的质量比为6:0.5:0.5，反应温度为40℃，反应时间为8h。
在步骤2中，G1.0(acrylate)8、乙二胺和有机溶剂的质量比为0.3:10:1，反应温度为30℃，反应时间为10h。
在步骤3中，G1.5(NH2)8、TMPTA和有机溶剂的质量比为0.3:25:4，反应温度为40℃，反应时间为30h。
实施例7 PEG化对硝基苯基碳酸酯的制备
将6.0gM-PEG 1000溶于50mlTHF中，加入12.0g对硝基苯基氯甲酸酯和4.0g三乙胺，室温下搅拌反应24h，过滤，滤液在50℃下减压旋蒸得到M-PEG 1000-对硝基苯基碳酸酯。
实施例8 PEG化对硝基苯基碳酸酯的制备
按照实施例7的方法制备PEG化对硝基苯基碳酸酯，不同之处在于，M-PEG 1000的质量、对硝基苯基氯甲酸酯的质量、三乙胺的质量和THF的体积比为1g:10g:1.5g:5mL。
实施例9PEG化对硝基苯基碳酸酯的制备
按照实施例7的方法制备PEG化对硝基苯基碳酸酯，不同之处在于，M-PEG 1000的质量、对硝基苯基氯甲酸酯的质量、三乙胺的质量和THF的体积比为12g:20g:8.5g:50mL。
实施例10PEG化树枝状大分子药物载体的制备
取实施例1-3中任一实施例所合成的端氨基的树枝状大分子G2.0(NH2)182.0g溶于60ml二甲基亚砜中，加入8.0g实施例7-9中任一实施例所合成的M-PEG 1000-对硝基苯基碳酸酯，室温下搅拌反应5d。将所得溶液于纯水中透析24h，减压旋蒸至干即得PEG-端氨基树枝状大分子，其HPLC测试结果如图3a所示。图4a、b分别为G2.0(NH2)18和PEG-端氨基树枝状大分子的FTIR表征结果。
实施例11PEG化树枝状大分子药物载体的制备
取实施例4-6中任一实施例所合成的端丙烯酸枝基的树枝状大分子G2.0(acrylate)485.0g溶于120ml二甲基亚砜中，加入20g实施例7-9中任一实施例所合成的M-PEG 1000-对硝基苯基碳酸酯，室温下搅拌反应4d。将所得溶液于纯水中透析24h，减压旋蒸至干即得PEG-端丙烯酸酯基树枝状大分子，其HPLC测试结果如图3b所示。图5a、b分别为G2.0(acrylate)48和PEG-端丙烯酸酯基树枝状大分子的FTIR表征结果。
实施例12药物增溶效果和释药性测试
分别称取溶剂蒸馏水、端丙烯酸酯基树枝状大分子G2.0(acrylate)48、PEG-端丙烯酸酯基的树枝状大分子、端氨基树枝状大分子G2.0(NH2)18、PEG-端氨基的树枝状大分子10.0g，分别置于50mL磨口锥形瓶中，各加入喜树碱、左旋紫草素等粉末至不溶，于振荡器上连续振24h，震荡温度为(25±1)℃，达饱和状态后，各取适量液体置离心管中，离心15min(2500r/min)。取上清液，微孔滤膜(0.22μm)过滤，得5种滤液。精密移取5种滤液适量，分别置25mL棕色量瓶中，加入乙醇至刻度。测定吸收度，计算药物溶解度。
结果表明，喜树碱、左旋紫草素等在、端丙烯酸酯基树枝状大分子G2.0(acrylate)48、PEG-端丙烯酸酯基的树枝状大分子、端氨基树枝状大分子G2.0(NH2)18和PEG-端氨基的树枝状大分子中的溶解度比水中有明显的增大，比在蒸馏水中的溶解度提高约800～1200倍，说明新型载体对喜树碱、左旋紫草素等有明显的增溶作用。
图6是G2.0(NH2)18、实施例10合成的PEG-端氨基树枝状大分子对喜树碱的增溶作用测试结果。
取3.0～10.0mmol.L-1的各代端丙烯酸酯基及PEG-端丙烯酸酯基的树枝状大分子、端氨基及PEG-端氨基的树枝状大分子与喜树碱、左旋紫草素等形成的饱和溶液各1～5ml，分别转移至透析袋中，再将透析袋放入100ml纯水中，37℃恒温搅拌。以一定的时间间隔取1ml外相，并补充1ml纯水。按色谱条件测定样品，同一样品连续进样3次，计算峰面积的RSD。结果表明，PEG-端丙烯酸酯基及PEG-端氨基的树枝状大分子释放喜树碱、左旋紫草素等的速率比同摩尔浓度的同代端丙烯酸酯基及端氨基的树枝状大分子快。
取3.0～10.0mmol.L-1的端氨基的树枝状大分子G2.0(NH2)18、实施例10合成的PEG-端氨基树枝状大分子PEG-G2.0(NH2)18与喜树碱等形成的饱和溶液各5ml，分别转移至透析袋中，再将透析袋放入100ml纯水中，37℃恒温搅拌。以一定的时间间隔取1ml外相，并补充1ml纯水。测定喜树碱在G2.0(NH2)18及PEG-G2.0(NH2)18中释放曲线，结果如图7所示。
本发明的PEG化树枝状大分子药物载体的载药量为2.87～10.31mg/mL，载药率为24.08％～52.63％。本发明方法制备的药物载体具有优异的载药性能，不仅能够快速、高效地吸附一定浓度条件下的易降解或难溶性药物，如喜树碱、左旋紫草素，还能够在特定环境下及时、高效、靶向的释放。可用于难溶性药物的体内输送，尤其是针对肿瘤细胞研究等医药领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种PEG化树枝状大分子药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用Michael加成反应，使三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在保护气氛下于有机溶剂中交替反应，反应温度为25-60℃，得到以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子；
(2)将PEG、对硝基苯基氯甲酸酯和三乙胺溶于有机溶剂，然后在20-30℃下反应，反应完全后得到PEG化对硝基苯基碳酸酯；其中，步骤(1)和步骤(2)没有先后顺序；
(3)将所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子与所述PEG化对硝基苯基碳酸酯在有机溶剂中反应，反应温度为20-30℃，反应完全后得到所述PEG化树枝状大分子药物载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子为G2.0(NH2)18，其制备方法包括以下步骤：
(a1)按照质量比为(1-6):(3-10)，将三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在30-60℃下反应10-20h，得到G1.0(NH2)3；所述三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和有机溶剂的质量比为(1-6):(1-5)；
(a2)按照质量比为(0.1-0.5):(2-30)，将G1.0(NH2)3与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应15-50h，得到G1.5(acrylate)18；所述G1.0(NH2)3和有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.5-4)；
(a3)按照质量比为(0.1-0.6):(1.5-10.0)，将G1.5(acrylate)18与乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应10-20h，得到G2.0(NH2)18；所述G1.5(acrylate)18和有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.1-1)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子为G2.0(acrylate)48，其制备方法包括以下步骤：
(b1)按照质量比为(1-6):(0.04-0.5)，将三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应4-8h，得到G1.0(acrylate)8；所述三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和有机溶剂的质量比为(1-6):(0.4-2.0)；
(b2)按照质量比为(0.1-0.6):(1.5-10)，将G1.0(acrylate)8与乙二胺在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应10-20h，得到G1.5(NH2)8；所述G1.0(acrylate)8和有机溶剂的质量比为(0.1-0.6):(0.1-1)；
(b3)按照质量比为(0.1-0.5):(2-30)，将G1.5(NH2)8与三羟甲基丙烷三丙烯酸酯在所述有机溶剂中混匀，在25-40℃下反应30-60h，得到G2.0(acrylate)48；所述G1.5(NH2)8与有机溶剂的质量比为(0.1-0.5):(0.5-4)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和乙二胺在-5℃至5℃下混匀后反应。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，PEG、对硝基苯基氯甲酸酯和三乙胺的质量比为(1-12):(2-20):(1.5-8.5)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述以乙二胺为核的端氨基树枝状大分子或以三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为核的端丙烯酸酯基树枝状大分子与所述PEG化对硝基苯基碳酸酯的质量比为(2-5):(3-20)。
7.一种权利要求1-3中任一项所述的制备方法所制备的PEG化树枝状大分子药物载体。
8.根据权利要求7所述的PEG化树枝状大分子药物载体，其特征在于：所述PEG化树枝状大分子药物载体用于负载难溶性药物。
9.根据权利要求8所述的PEG化树枝状大分子药物载体，其特征在于：所述难溶性药物为喜树碱、左旋紫草素、黄芩素、水飞蓟素、葛根素和槲皮素中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的PEG化树枝状大分子药物载体，其特征在于：所述PEG化树枝状大分子药物载体的载药量为2.87～10.31mg/mL，载药率为24.08％～52.63％。
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