CN109609640A - Etv4的用途 - Google Patents

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prognosis
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Abstract

本发明属于肝癌诊断研究领域，具体提供了ETV4的用途。本发明通过检测肝癌组织中ETV4的表达水平，识别出ETV4高表达的肝癌组织，以及ETV4和BRD4共同高表达的肝癌组织，并可进一步预测该所述肝癌组织为高风险、预后差的类型。此外，经公开可得的肝癌病人二代测序的基因表达数据和存活数据证实，本发明能够有效预测出高风险、预后差的肝癌组织，具有高度产业利用价值。

Description

ETV4的用途
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及ETV4的用途。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人民健康的最大危险因素之一，我国每年仅肿瘤死亡人数近200万人，恶性肿瘤造成的经济损失高达1400多亿元人民币。在中国，肝癌在恶性肿瘤里，发病率排第三，仅次于肝癌和肝癌，但死亡例数排第二，仅次于肝癌。目前肝癌的治疗方法可分四大块，第一是外科手术(包括肝切除术和肝移植术)，第二是血管介入，第三是局部消融治疗(包括射频、微波、冷冻、无水酒精注射等等)，最后是放化疗和分子靶向治疗、生物治疗等。但在我国，80％以上的肝癌都是晚期才能发现，病人往往已经失去手术机会，且中晚期肝癌病人手术后的复发转移率更高。
预后是指对发病后，疾病未来过程的一种预先估计。在医学上，“预后”是指根据经验预测的疾病发展情况。预后主要涉及到三方面，将发生什么结果、发生不良结局的可能性有多大、什么时候会发生。预后分析是对疾病发病后发展为各种不同结局的预测；是临床非常实用、对临床很有指导作用的临床研究。研究和评价预后的目的，为了便于了解各种疾病对人类危害性的大小、探索影响预后的因素、研究改善预后的具体措施。
肿瘤标志物是可以在血清、血浆、其他体液、组织提取物或石蜡固定的组织中检测到的自然生长的分子。肿瘤标志物可以为肝癌的诊断，选择治疗方案、预测疾病进程和复发以及对治疗效果进行监测等提供有价值的信息。AFP是全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标志物，但AFP诊断肝癌的敏感度为39％～65％，特异度为76％～94％。其敏感度和特异度均不令人十分满意，尤其在具有小肿块的HCC早期阶段，80％的患者血清AFP并未见明显升高，在肿块直径＜3cm和＞3cm的HCC患者中，AFP的检测敏感度分别为25％和52％。其他肿瘤标志物如GP73、AFP-L3、GPC-3等虽也有一定程度的应用，但与肝癌预后判断的联系不大。这些数据表明，如何对肝癌进行准确的分型、尽早判断肿瘤是否会复发、转移，进而选择合理的治疗手段，提高肝癌患者的生存率和生活质量是肝癌治疗的重要发展方向。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种ETV4的用途。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供ETV4用于制备或筛选肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂的用途。
进一步的，ETV4作为生物标志物。
所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测。
进一步的，所述肝癌恶性程度的预测是指通过肝癌组织中ETV4表达量的检测对肝癌样株的恶性程度进行预测。
所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的，所述肝癌预后判断试剂是指用于检测肝癌组织中ETV4表达量的试剂，根据检测结果以对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
ETV4的表达量可以为ETV4的蛋白的表达量、ETV4基因的转录水平或是ETV4的基因表达水平。
需要说明的是，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。
ETV4基因的Ensembl数据库登录号为ENSG00000175832。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂包括特异性识别ETV4的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物。
本发明的第二方面，提供特异性识别ETV4的试剂用于制备肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒的用途。
在一种实施方式中，ETV4作为生物标志物。
所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测。
进一步的，所述肝癌恶性程度的预测是指通过肝癌组织中ETV4表达量的检测对肝癌样株的恶性程度进行预测。
所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的，所述肝癌预后判断试剂是指用于检测肝癌组织中ETV4表达量的试剂，根据检测结果以对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
ETV4的表达量可以为ETV4的蛋白的表达量、ETV4基因的转录水平或是ETV4的基因表达水平。
需要说明的是，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物。
所述试剂盒可以是实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。
本发明第三方面提供ETV4和BRD4联合用于制备或筛选肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂的用途。
所述ETV4和BRD4联合作为生物标志物。
BRD4基因的Ensembl数据库登录号为ENSG00000141867。
所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测。
进一步的，所述肝癌恶性程度的预测是指通过肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的检测对肝癌样株的恶性程度进行预测。
所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的，所述肝癌预后判断试剂是指用于检测肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的试剂，根据检测结果以对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
ETV4的表达量可以为ETV4的蛋白的表达量、ETV4基因的转录水平或是ETV4的基因表达水平。
BRD4的表达量可以为BRD4的蛋白的表达量、BRD4基因的转录水平或是BRD4的基因表达水平。
需要说明的是，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。
本发明的第四方面，提供特异性识别ETV4的试剂和特异性识别BRD4的试剂联合用于制备肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒的用途。
在一种实施方式中，ETV4和BRD4作为生物标志物。
所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测。
进一步的，所述肝癌恶性程度的预测是指通过肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的检测对肝癌样株的恶性程度进行预测。
所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的，所述肝癌预后判断试剂是指用于检测肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的试剂，根据检测结果以对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
需要说明的是，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物；所述特异性识别BRD4的试剂选自特异性扩增BRD4的引物。
本发明的第五方面，提供一种肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒，肝癌检测和/或肝癌预后判断试剂，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂包括特异性识别ETV4的试剂。
进一步的，所述试剂盒还包括特异性识别BRD4的试剂。
在一种实施方式中，ETV4，或ETV4和BRD4联合作为生物标志物。
所述肝癌检测试剂用于肝癌的判断、诊断。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测。
进一步的，所述肝癌恶性程度的预测是指通过肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的检测对肝癌样株的恶性程度进行预测。
所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
进一步的，所述肝癌预后判断试剂是指用于检测肝癌组织中ETV4和BRD4表达量的试剂，根据检测结果以对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
ETV4的表达量可以为ETV4的蛋白的表达量、ETV4基因的转录水平或是ETV4的基因表达水平。
BRD4的表达量可以为BRD4的蛋白的表达量、BRD4基因的转录水平或是BRD4的基因表达水平。
需要说明的是，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂并不限定为必须为液体形式。
在一种实施方式中，所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物；所述特异性识别BRD4的试剂选自特异性扩增BRD4的引物。
所述试剂盒可以是实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。
本发明第六方面提供前述试剂盒的使用方法，包括步骤：
(1)加样：将样品基因组cDNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述ETV4基因检测引物、BRD4基因检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
所述样本可以为肝癌样株。
除了采用本发明的引物，本发明对PCR反应体系中其它各组分及其终浓度没有特别的限制，本领域人员可根据常规建立PCR体系时采用的一般成分及其浓度来建立PCR反应体系。用于PCR扩增的模板(如基因组DNA)也可采用本领域的常规方法提取获得。
进一步的，将测得的肝癌样株的检测结果与ETV4表达水平区分标准相比，肝癌样株中ETV4高表达表示所述肝癌样株具有较高的恶性程度，和/或表现出较差的预后；ETV4低表达表示所述肝癌样株具有较低的恶性程度，和/或表现出较好的预后。与ETV4表达水平区分标准和BRD4表达水平区分标准相比，肝癌样株中ETV4和BRD4高表达表示所述肝癌样株具有更高的恶性程度，和/或表现出更差的预后。
所述ETV4表达水平区分标准是指，根据现有数据库中肝癌病人的样本数据的ETV4的表达量信息进行数据分布分析，对基因的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作即为ETV4表达水平的区分标准。
所述BRD4表达水平区分标准是指，根据数据库中现有肝癌病人的样本数据的BRD4的表达量信息进行数据分布分析，对基因的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作即为BRD4表达水平的区分标准。
所述ETV4高表达是指，ETV4的表达量比ETV4表达水平区分标准的表达量高；所述ETV4低表达是指，ETV4的表达量比ETV4表达水平区分标准的表达量低。
所述BRD4高表达是指，BRD4的表达量比BRD4表达水平区分标准的表达量高；所述BRD4低表达是指，BRD4的表达量比BRD4表达水平区分标准的表达量低。
在一种实施方式中，ETV4表达水平的区分标准为TPM＝991.33。
在一种实施方式中，BRD4表达水平的区分标准为TPM＝1999.07。
ETV4的表达量可以为ETV4的蛋白的表达量、ETV4基因的转录水平或是ETV4的基因表达水平。
BRD4的表达量可以为BRD4的蛋白的表达量、BRD4基因的转录水平或是BRD4的基因表达水平。
本发明第七方面提供一种肝癌预后判断的方法，为通过检测肝癌组织中ETV4的基因表达水平，或ETV4和BRD4的基因表达水平，对肝癌病人的预后进行判断。
进一步的，所述方法包括以下步骤：与ETV4表达水平区分标准相比，肝癌样株中ETV4高表达表示所述肝癌样株具有较高的恶性程度，和/或表现出较差的预后；ETV4低表达表示所述肝癌样株具有较低的恶性程度，和/或表现出较好的预后。与ETV4表达水平区分标准和BRD4表达水平区分标准相比，肝癌样株中ETV4和BRD4高表达表示所述肝癌样株具有更高的恶性程度，和/或表现出更差的预后。
所述ETV4表达水平区分标准是指，根据现有数据库中肝癌病人的样本数据的ETV4的表达量信息进行数据分布分析，对基因的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作即为ETV4表达水平的区分标准。
所述BRD4表达水平区分标准是指，根据数据库中现有肝癌病人的样本数据的BRD4的表达量信息进行数据分布分析，对基因的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作即为BRD4表达水平的区分标准。
所述ETV4高表达是指，ETV4的表达量比ETV4表达水平区分标准的表达量高；所述ETV4低表达是指，ETV4的表达量比ETV4表达水平区分标准的表达量低。
所述BRD4高表达是指，BRD4的表达量比BRD4表达水平区分标准的表达量高；所述BRD4低表达是指，BRD4的表达量比BRD4表达水平区分标准的表达量低。
在一种实施方式中，ETV4表达水平的区分标准为TPM＝991.33。
在一种实施方式中，BRD4表达水平的区分标准为TPM＝1999.07。
在一种实施方式中，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂包括特异性识别ETV4的试剂和特异性识别BRD4的试剂。
在一种实施方式中，所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物；所述特异性识别BRD4的试剂选自特异性扩增BRD4的引物。
本发明第八方面提供ETV4抑制剂用于制备肝癌治疗药物的用途。
进一步地，所述肝癌治疗药物至少具有以下功用之一：
抑制肝癌细胞的增殖速率、改变肝癌细胞周期分布、促进肝癌细胞凋亡，抑制肝癌组织生长。
进一步地，所述ETV4抑制剂是指对ETV4具有抑制效果的分子。
对于ETV4具有抑制效果包括但不限于：抑制ETV4活性，或者抑制ETV4基因转录或表达。
所述ETV4抑制剂可以为siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
所述肝癌治疗药物必然包括ETV4抑制剂，并以ETV4抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述肝癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为ETV4抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即，ETV4抑制剂为所述肝癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。
所述肝癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述肝癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
本发明第九方面，提供ETV4在制备和筛选肝癌治疗药物中的用途。
一种实施方式中，ETV4作为作用靶标。
一种实施方式中，所述用途具体是指：将ETV4作为作用对象，对候选物质进行筛选，以找到ETV4抑制剂，作为潜在的肝癌治疗药物。
一种实施方式中，所述用途具体是指：将ETV4基因作为作用靶标筛选能降低肝癌细胞中ETV4基因的表达水平的双链RNA或shRNA作为肝癌治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过检测肝癌组织中ETV4的表达水平，识别出ETV4高表达的肝癌组织，以及ETV4和BRD4共同高表达的肝癌组织，并可进一步预测该所述肝癌组织为高风险、预后差的类型。此外，经公开可得的肝癌病人二代测序的基因表达数据和存活数据证实，本发明能够有效预测出高风险、预后差的肝癌组织，具有高度产业利用价值。
附图说明
图1显示为本发明的基于ETV4高表达的高风险肝癌预后预测示意图。
图2显示为公开可得的肿瘤基因表达数据中ETV4和BRD4的表达水平分布图。
图3显示为ETV4高表达及ETV4和BRD4共同高表达的肝癌病人的存活分析曲线图。
图4显示为ETV4敲低前后肝癌HepG2细胞的增殖曲线。
具体实施方式
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒
基于本发明所述试剂盒是采用实时荧光PCR技术来进行检测的，所述试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：SYBR premix ex Taq、无菌水(ddH2O)、样品基因组DNA提取试剂、dNTPs、RT buffer、RNasin、M-MLV-RTase等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的各组引物对，也可以是含有配置好的含有各组引物对的PCR检测混合液。
所述PCR检测混合液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测混合液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有SYBR premix ex Taq、无菌水(ddH2O)。加入本发明的引物、待检样本DNA提取物或者cDNA即可获得PCR反应体系。
可选的，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有ETV4基因表达的cD NA样本、BRD4基因表达的cDNA样本。
可选的，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无ETV4和BRD4基因表达的cDNA样本。
所述试剂盒的使用方法
包括如下步骤：
(1)加样：将样品基因组cDNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述ETV4基因检测引物、BRD4基因检测引物；
(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
(4)PCR反应结束后，分析结果。
可选的，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)95℃15S；(b)95℃5S；(c)60℃30S；步骤(b)-(c)循环40次。
ETV4抑制剂
指对于ETV4具有抑制效果的分子。对于ETV4具有抑制效果包括但不限于：抑制ETV4活性，或者抑制ETV4基因转录或表达。所述ETV4抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。
抑制ETV4活性是指使ETV4活力下降。优选地，相比抑制前，ETV4活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制ETV4基因转录或表达是指：使ETV4的基因不转录，或降低ETV4的基因的转录活性，或者使ETV4的基因不表达，或降低ETV4的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对ETV4的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
ETV4的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，ETV4基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地ETV4基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
ETV4抑制剂制备药物
以ETV4抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备肝癌治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与ETV4抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
实施例中所使用的已知的肝癌组织信息源于TCGA数据库最新版(2016年7月15日版)，TCGA-HCC-mRNA-Level3Samples(1176)，其中365例具有临床数据。
实施例1
1.数据处理：
提取TCGA数据库中所有377例肝癌病人的基因表达数据中ETV4和BRD4的表达数据，取log2后的数值作为最终的表达水平，在统计学软件R工作平台(版本号：3.1.2)中调用聚类分析程序包mclust(版本号4.4)，将表达数据分为高表达和低表达的两类；对基因的表达水平按照数值大小进行由小到大地排序，以低表达类的最大值和高表达类的最小值的平均值作为表达水平的区分标准。TCGA最新版所有肝癌病人的基因表达水平检测方法为二代测序法，其中ETV4和BRD4的表达水平分布图如图2所示。按照上述标准选取办法，最终选取的ETV4表达水平的区分标准为TPM＝991.33，BRD4表达水平的区分标准为TPM＝1999.07。
根据区分标准可知，在数据库中的已知肝癌病人的365例临床数据中，所述ETV4单独高表达组55例，ETV4和BRD4共同高表达组21例，共同低表达组211例，即与ETV4和/或BRD4表达相关的临床数据共287例。
依据与ETV4和/或BRD4表达相关的287例临床数据进行存活曲线分析，结果如图3所示。其中，横坐标表示的是肝癌样株来源的病人存活时间，纵坐标表示的是肝癌样株来源的病人肝癌存活几率(无转移生存率)。由图3中可见，相对于ETV4和BRD4共同低表达组而言，ETV4高表达表示肝癌样株均具有较高的恶性程度，并表现出较差的预后。而ETV4和BRD4共同高表达则表示肝癌样株具有更高的恶性程度，表现出更差的预后。
实施例2
ETV4抑制实验：
本发明设计三条ETV4的sgRNA序列克隆进同一个质粒(lentiGuide-Puro vector)中，转染至HEK293T细胞中包病毒。随后，病毒被导入肝癌HepG2细胞中，48小时后获得稳定株，在96孔板上以每孔1000个细胞的密度培养四天进行puromycin抗性筛选和细胞增殖观察。
sgRNA序列分别为：
ETV4-sgRNA1-Forward：CTGCCGCCCCTCGACTCTGA，SEQ ID No：1；
ETV4-sgRNA1-Reverse：TCAGAGTCGAGGGGCGGCAG，SEQ ID No：2；
ETV4-sgRNA2-Forward：GCTCTTTACCTTCAGAGTCG，SEQ ID No：3；
ETV4-sgRNA2-Reverse：CGACTCTGAAGGTAAAGAGC，SEQ ID No：4；
ETV4-sgRNA3-Forward：TAAGTCACTTCCAGGAGACG，SEQ ID No：5；
ETV4-sgRNA3-Reverse：TACCACCATGGCGAGCAGTG，SEQ ID No：6。
应用CellTiter-试剂盒，按照制造商Promega提供的实验手册进行CellTiger-Glo Lunimescent cell Viability试验来测定细胞生长曲线。
此外，由图4中可见，应用CRISPRi技术对ETV4基因进行基因敲低后，肝癌HepG2的生长抑制较为显著(pvalue<0.01)。该结果表明，靶向ETV4的治疗手段可有效抑制肝癌进程，有一定的治疗效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国科学院上海高等研究院
<120> ETV4的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgccgcccc tcgactctga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagagtcga ggggcggcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctttacc ttcagagtcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgactctgaa ggtaaagagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taagtcactt ccaggagacg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taccaccatg gcgagcagtg 20

Claims (12)

1.ETV4用于制备或筛选肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，ETV4作为生物标志物。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测；和/或，所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
4.特异性识别ETV4的试剂用于制备肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或两项：
1)所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测；和/或，所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断；
2)所述特异性识别ETV4的试剂选自特异性扩增ETV4的引物。
6.ETV4和BRD4联合用于制备或筛选肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或两项：
1)所述ETV4和BRD4联合作为生物标志物；
2)所述肝癌检测试剂用于肝癌恶性程度的预测；和/或，所述肝癌预后判断试剂用于对肝癌病人的病程和/或结局进行预后判断。
8.特异性识别ETV4的试剂和特异性识别BRD4的试剂联合用于制备肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒的用途。
9.一种肝癌检测试剂盒和/或肝癌预后判断试剂盒，所述试剂盒中包括：肝癌检测和/或肝癌预后判断试剂，所述肝癌检测试剂和/或肝癌预后判断试剂包括特异性识别ETV4的试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括特异性识别BRD4的试剂。
11.ETV4抑制剂用于制备肝癌治疗药物的用途。
12.ETV4在制备和筛选肝癌治疗药物中的用途。
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