CN101424639A

CN101424639A - 铂类药物疗效预测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN101424639A
Application number: CNA2006101224467A
Authority: CN
Inventors: 吴一龙; 陈志红; 郭爱林; 张绪超; 林嘉颖; 谢至; 陈世良; 董嵩; 聂强
Original assignee: Guangdong General Hospital
Current assignee: Guangdong General Hospital
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2009-05-06

Abstract

本发明属于生物技术和临床医学检验领域，公开了一种检测切除修复交叉互补基因(excision repair cross－complemating 1，ERCC1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用来有效筛选对铂类药物治疗有效的恶性肿瘤患者。

Description

铂类药物疗效预测试剂盒及其应用

[技术领域]

本发明涉及一种检测人切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complemating1，ERCC1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，以此在临床上预测对铂类治疗疗效好的患者。属于生物技术和临床医学检验领域。

[背景技术]

肺癌的发病率及病死率在我国均有逐年上升的趋势，根据病理学的分型，确诊的肺癌中约有80％为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，在每年新诊断的NSCLC中，大部分患者的病程已到晚期而无法行手术治疗，化疗及放疗是针对这部分患者的主要治疗方法，而化疗耐药是晚期患者治疗失败和死亡的主要原因。导致临床化疗耐药的原因有：药代动力学因素，肿瘤微环境因素，肿瘤细胞特异性因素等。在化疗方案与给药剂量相同的情况下，不同个体对化疗的敏感性有很大的差异，这种差异使传统依靠经验进行化疗面临极大的挑战，因此迫切需要一种能够预测化疗疗效的方法，为对患者进行个体化治疗提供依据。

化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，铂类药物在恶性肿瘤的治疗上有着重要的应用价值。随着恶性肿瘤的高发病症从原来的头颈部肿瘤、肺癌等转变为大肠癌、直肠癌及乳腺癌、胰腺癌、转移性肾癌。铂是一种贵重金属，铂类药物在临床上主要应用于肿瘤疾病的治疗，治疗机理主要是依靠铂类产品对细胞的细胞毒作用。目前临床上主要应用的铂类药物有联合化疗中最常用的药物之一、传统铂制剂顺铂(顺氯氨铂，DDP)，替代顺铂的产品卡铂(又称碳铂，CBP)，以及近年来新崛起的铂类药新秀奥沙利铂(又称草酸铂)。

铂类药物对肿瘤细胞的杀伤作用主要通过与细胞内亲核的DNA结合，形成铂—DNA加合物，导致DNA的链间交联或链内交联，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡。而机体的损伤修复系统可以修复这类损伤，从而影响铂类药物的化疗敏感性。

铂类耐药的机制主要包括：药物外排增加；药物失活增强；对铂DNA加合物修复功能增强等。在顺铂耐药的细胞模型中，细胞对DNA损伤修复的能力是铂类敏感或耐药的决定因素。NER(Nucleotide excision repair，NER)是人体DNA损伤修复系统的重要组成部分，铂类药物引起的DNA损伤修复主要由这个系统完成。在这一通路中，包括5个主要步骤，涉及30多种基因产物，其中切除修复交叉互补基因(Excision repair cross complementing，ERCC1)扮演重要角色。ERCC1参与DNA链的切割和损伤识别。ERCC1共有四种分子量的mRNA，过表达时可使停滞在G2/M期的损伤DNA迅速修复，导致其对铂类耐药。因此，DNA修复能力直接影响以铂类为基础联合方案的疗效，该修复能力可以通过外周血淋巴细胞彗星分析法直接判断，也可以通过检测DNA修复基因如ERCC1的表达来分析。最近的研究表明，在哺乳动物细胞系中，ERCC1与错配修复基因MSH2在功能上和物理上相互作用是导致对铂类耐药的主要原因。Bosken等分析DNA修复能力与NSCLC患者死亡率的关系，结果发现在所有检测的肿瘤组织中均能检测到ERCC1mRNA过表达，低表达ERCC1mRNA者中位生存时间显著高于高表达者。ERCC1的低表达是晚期NSCLC接受铂类化疗的一个预见性指标。这一结果告诉我们可通过检测ERCC1的表达水平，指导选择是否含铂类的方案治疗以及预测铂类药物的疗效，从而使病人真正接受个体化治疗，这也将为术前术后化疗方案的选择提供有利的依据。

荧光定量PCR技术是当前检测基因表达水平的较精确的方法之一，技术成熟规范适合于临床标准化的检测，对于活组织切除，纤支镜检查及手术中取得的肿瘤组织标本均可进行检测。其检测结果将有益地指导晚期及术后的非小细胞肺癌患者的治疗。

[发明内容]

本发明的目的在于应用Real-Time PCR技术，设计出一种检测人切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complemating 1，ERCC1)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒。该试剂盒包括：Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品。其中RT-PCR检测试剂为：oligo(dT)₂₀，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RTbuffer，MgCl₂，DTT，RNASEOUT^TM，SuperScript^TM III RT。T-载体连接试剂为：2X RapidLigation Buffer，pGEM-T Vector，T4DNA连接酶。荧光实时定量PCR试剂为：SYBR Premix ExTaq(2X)，Rox reference dye。

目标基因ERCC1上下游引物分别是：

forward：5’-GGCAAAATCCAACAGCATCA-3’

reverse：5’-GTAGCGGAGGCTGAGGAACA-3’；

校正基因Beta-Actin上下游引物分别是：

forward：5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’

reverse：5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’；

目标基因ERCC1标准品序列为：

GTAGCGGAGGCTGAGGAACAGGGCACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATAGTCGGGAATTACGTCGCCAAATTCCCAGGGCA

CGTTGCGCACGAACTTCAGTACGGGATTGCCCCTCTGCCGAGGGCTCACAATGATGCTGTTGGATTTTGCC：

校正基因Beta-Actin标准品序列为：

GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCT

GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。

该试剂盒采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR对临床能取得肿瘤组织的患者进行检测；检测方法简单可行，检测结果稳定可靠，具有高特异性、高灵敏度的特点，而且非常适于批量样本检测，可以用来筛选对铂类治疗有效的晚期或术后非小细胞肺癌患者。

[附图说明]

图1为β-actin标准曲线；

图2为β-actin标准品扩增曲线；

图3为ERCC1标准曲线；

图4为ERCC1标准品扩增曲线。

[具体实施方式]

实施例1

一、材料和方法

Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、Taq酶等够自英伟创津公司。引物为本医院合成。

二：组织RNA的提取

1.新鲜组织取下后，立即置于液氮中，然后存于—80℃冰箱中保存待检测。

2.取适当大小组织标本(约100毫克)用研铂在液氮中磨碎，移入装有1000ul Trizol的预冷的1.5毫升离心管中，冰上放置10分钟。

3.加入200ul的氯仿。

4.用镊子取子弹头，盖上盖子，上下颠倒混匀，15S左右。

5.静置5min。

6.离心，12000RPM/min，4℃，15min。

7.取上层。(中下层为蛋白质和DNA的混合物)

8.加入异丙醇：1000ml Trizol加入500ul异丙醇.

9.混匀，静置10min。离心，12000RPM/min，4℃，15min。

10.直接将上清液弃掉，可以看见壁上有少许白色沉淀黏附。

11.75％酒精洗涤：加入量与Trizol一样。混匀。离心，8000g/min，4℃，15min。

12.弃上清。

13.真空干燥，约10min。

14.用20ul DEPC-水溶解RNA(用Tip头反复吹打)。

15.55℃-60℃水浴5min。

16.1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取情况：完整的RNA在紫外分析仪下可见三条带，分别为28S，18S，5S。28S的亮度应该为18S的两倍，5S带一般较弱，如有降解可见5S带增强。

17.测定所提RNA的OD260和OD280值，计算总RNA的浓度以及纯度：OD260/OD280应在1.8—2.1之间

三：RT-PCR合成cDNA

1.将试剂盒中的所有试剂混匀并快速离心收集；

2.在0.2ml PCR反应管中加入以下反应物：

1ug总RNA nul

50uM oligo(dT)20 1ul

10mM dNTP mix 1ul

DEPC-treatedwater 补足到10ul

3.65℃孵育5分钟，立即置于冰上至少1分钟。

4.再在此管中加入以下反应物，混匀。

10XRT buffer 2ul

25mM MgCl2 4ul

0.1M DTT 2ul

RNASEOUTTM(40U/ul) 1ul

SuperScriptTM III RT(200U/ul) 1ul

5.50℃孵育50分钟，然后85℃反应5分钟。立即置于冰上。

6.离心收集产物。加入1ul RNase H，37℃孵育20分钟。

7.cDNA合成以后置于—20℃保存待下游工作。

四：标准品的构建

1.快速离心PGEM-T Vector，收集反应物于管低。

2.建立连接体系：在0.2mlL离心管中以下反应物：

2X Rapid Ligation Buffer 5ul

pGEM-T Vector 1ul

PCR Product 2ul

T4 DNA连接酶(3U/ul) 1ul

无菌水 1ul

3.混匀，室温1小时或4℃孵育过夜。

4.准备两个AMP LB平板，室温放置备用。

5.将连接体系中的反应物取2ul于7ml的离心管中。

6.取50ul感受态细胞于7ml管中，轻弹混匀，冰浴30分钟。

7.42℃水浴热休克90秒。立即置于冰中2分钟。

8.加950ul soc培养基于管中。37℃，150rpm培养1个半小时。

9.离心，1000g/min，10min后弃上清收集细胞。

10.加入100ul或200ul的SOC培养基，重新悬浮细胞，轻弹混合。

11.于每个平板中加入100ul混合细胞液；用接种环铺开反应液。

12.37℃孵育过夜。

13.观察菌的生长情况，将单个菌落用枪头挑出后放进含100ulSOC培养液的0.5ml的离心管中反复吹打，将菌落洗脱。

14.PCR进行菌落的挑选，挑选目标菌落。

15.取PCR结果合适的SOC培养基加入(5ml+50ulAmp)的LB培养肉汤中，150rpm培养过夜。

16.提取质粒，测OD值，计算此标准品的拷贝数。

17.按照所需浓度稀释成工作液。

18.测定标准品的序列，验证转入序列的正确性。

五：荧光定量检测：包括标准曲线的制作和未知样品的检测：

1.确定未知样品的位置和重复数，最好每个样品重复三次。

2.将质粒标准品ERCC1和看家基因标准品B-actin倍比稀释成5个浓度：10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，确定每个标准品的位置和重复数。

3.在反应板的每个反应孔中加入以下体积的液体：

SYBR Premix Ex 12.5ul

Taq(2X)

10uM sense primer 0.5ul

10uM antisense primer 0.5ul

Rox reference dye 0.5ul

Template DNA 1ul

无菌水 10ul

4.盖上热反应膜，将反应板装入定量分析仪。

5.按仪器操作创建定量反应板。

6.指定热循环的条件并开始运行反应板：

聚合酶的活化：20秒@95℃

PCR扩增(40个循环)：5秒@95℃，31秒@60℃

7.保存文件，单击start开始。

8.待反应完毕，分析数据，以B-actin作为标准，计算每个细胞的ERCC1的表达水平，如在中位数以上定为阳性，如在中位数以下定为阴性。

实施例2、检测肿瘤组织ERCC1表达水平用于预测非小细胞肺癌患者对铂类药物的疗效

对70例非小细胞肺癌患者进行了肿瘤组织ERCC1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对铂类化疗药物的疗效，其准确率达82％，假阴性率为8％，假阳性率为10％。

实施例3、乳腺癌患者行肿瘤组织ERCC1表达水平检测用于预测其对铂类化疗药物的疗效

对100例乳腺癌患者进行肿瘤组织ERCC1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对铂类化疗药物的疗效，其预测准确率达80％，假阴性率为10％，假阳性率为10％。

实施例4、检测肿瘤组织ERCC1表达水平用于预测结直肠癌患者对铂类化疗药物的疗效

对80例结直肠癌患者进行了肿瘤组织ERCC1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对铂类化疗药物疗效，其预测准确率达85％，假阴性率为6％，假阳性率为13％。

实施例5、检测肿瘤组织ERCC1表达水平用于预测转移性肾癌患者对铂类化疗药物的疗效

25例转移性肾癌患者接受了肿瘤组织ERCC1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对铂类化疗药物疗效，其准确率达73％，假阴性率为13％，假阳性率为14％。

实施例6、检测肿瘤组织ERCC1表达水平用于预测铂类化疗药物的疗效

30例头颈部肿瘤患者接受铂类化疗药物的治疗，对这35例患者进行肿瘤组织ERCC1表达水平检测，并根据检测结果预测患者对铂类化疗药物的疗效，其准确率达77％，假阴性率为10％，假阳性率为13％。

虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。

铂类药物疗效预测试剂盒及其应用

<110>广东省人民医院

<120>铂类药物疗效预测试剂盒及其应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>引物

<400>1

ggcaaaatcc aacagcatca 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>引物

<400>2

gtagcggagg ctgaggaaca 20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>引物

<400>3

gccaaccgcg agaagatga 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>引物

<400>4

catcacgatg ccagtggta 19

<210>5

<211>150

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>目标基因ERCC1标准品序列

<400>5

gtagcggagg ctgaggaaca gggcacaggt gctctggccc agcacatagt cgggaattac 60

gtcgccaaat tcccagggca cgttgcgcac gaacttcagt acgggattgc ccctctgccg 120

agggctcaca atgatgctgt tggattttgcc 150

<210>6

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>miSC feature

<223>校正基因Beta-Actin标准品序列

<400>6

gccaaccgcg agaagatga ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60

gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120

Claims

1.一种铂类药物疗效预测试剂盒，它包括：Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、

荧光定量PCR试剂、引物、Taq酶、标准品，其特征是：

目标基因ERCC1上下游引物分别是：

forward：5’-GGCAAAATCCAACAGCATCA-3’

reverse：5’-GTAGCGGAGGCTGAGGAACA-3’；

校正基因Beta-Actin上下游引物分别是：

forward：5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’

reverse：5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’；

目标基因ERCC1标准品序列为：

CGTTGCGCACGAACTTCAGTACGGGATTGCCCCTCTGCCGAGGGCTCACAATGATGCTGTTGGATTTTGCC；

校正基因Beta-Actin标准品序列为：

GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RT-PCR检测试剂为：oligo(dT)₂₀，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl₂，DTT，RNASEOUT^TM，SuperScript ^TM III RT。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于T-载体连接试剂为：2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA连接酶。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于荧光实时定量PCR试剂为：SYBR Premix ExTaq(2X)，Rox reference dye。

5.权利要求1的所述试剂盒应用于铂类药物对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的疗效预测。