CN101424638A - 紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用 - Google Patents
紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术和临床医学检验领域，公开了一种检测β微管蛋白III(βtubulinIII)在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，该试剂盒可以用来有效筛选对紫杉类药物治疗有效的恶性肿瘤患者。
Description
[技术领域]
本发明涉及一种检测人β—微管蛋白III在肿瘤组织中的表达水平的试剂盒，以此在临床上预测对紫杉类治疗疗效好的患者。属于生物技术和临床医学检验领域。
[背景技术]
肺癌的发病率及病死率在我国均有逐年上升的趋势，根据病理学的分型，确诊的肺癌中约有80％为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer NSCLC)，在每年新诊断的NSCLC中，大部分患者的病程已到晚期而无法行手术治疗，化疗及放疗是针对这部分患者的主要治疗方法，而化疗耐药是晚期患者治疗失败和死亡的主要原因。导致临床化疗耐药的原因有：药代动力学因素，肿瘤微环境因素，肿瘤细胞特异性因素等。在化疗方案与给药剂量相同的情况下，不同个体对化疗的敏感性有很大的差异，这种差异使传统依靠经验进行化疗面临极大的挑战，因此迫切需要一种能够预测化疗疗效的方法，为对患者进行个体化治疗提供依据。
紫衫醇类药物，是目前临床治疗NSCLC的常用药物。紫杉醇属细胞毒类化合物，为一抗微管药物。促使微管蛋白二聚体装配成微管，并阻止其解聚而稳定微管，从而抑制了细胞的有丝分裂起到了抗肿瘤作用，但不影响DNA、RNA和蛋白质的合成。微管是真核细胞的一种组成成份，它是由两条类似多肽(α和β)亚单位构成的微管蛋白二聚体形成的。正常情况下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，紫杉醇可使两者之间失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合防止解聚，稳定微管，这些作用导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，抑制了细胞分裂和增殖，从而发挥抗肿瘤作用。体外研究表明，紫杉醇浓度依赖性地、可逆性地结合到微管上，尤其是结合到N端微管蛋白的β-亚单位上，这一作用降低了聚合所需要微管蛋白的浓度，使动态平衡向着微管装配的方向移动，增加聚合的速率和产量。另外紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生，会防止正常的有丝分裂纺锤体的形成，导致染色体断裂并抑制细胞复制和移行。紫杉醇改变了细胞的有丝分裂过程，使有丝分裂持续时间从0.5h增加到15h，并抑制细胞质分裂。
目前紫杉醇类药物包括特素，泰素，安泰素，泰索帝，紫杉特尔，艾素等，主要应用于肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的化疗。
研究表明β微管蛋白III(β tubulin III)的过表达影响患者对紫杉类药物的敏感性。编码β tubulin的基因定位于6p21.3，有4个外显子，第4外显子是最重要的，不仅是主要编码区，而且是β tubulin与GTP和紫杉类药物作用的位点，经常发生突变。β tubulin有7种异构体，Verdier Pinard等用等电点聚焦和质谱仪联合检测发现，在7种异构体中只有β tubulin III才是微管作用药物耐药的惟一标志物。Hari等将β tubulin III cDNA转染至哺乳动物细胞系，表达有β tubulin III蛋白的细胞显示出对紫杉醇耐药。Rosell等用定量PCR法检测75例NSCLC石蜡组织中β tubulin IIIm R NA的表达，研究发现低β tubulin III表达的患者对紫杉醇敏感性高，疗效好，同时，β tubulin III表达与病情进展密切相关。因此，肺癌患者治疗前通过检测β tubulin III等相关基因有助于指导化疗方案的选择及预测疗效。β tubulin III的低表达是晚期NSCLC接受紫衫醇类化疗的一个预见性指标。这一结果告诉我们可通过检测β tubulin III的表达水平，指导选择是否含紫衫醇类的方案治疗以及预测紫衫醇类药物的疗效，从而使病人真正接受个体化治疗，这也将为术前术后化疗方案的选择提供有利的依据。
荧光定量PCR技术是当前检测基因表达水平的较精确的方法之一，技术成熟规范适合于临床标准化的检测，对于活组织切除，纤支镜检查及手术中取得的肿瘤组织标本均可进行检测。其检测结果将有益地指导晚期及术后的非小细胞肺癌患者的治疗。
[发明内容]
本发明的目的在于应用Real-Time PCR技术，设计出一种检测人在肿瘤组织中β—微管蛋白III的表达水平的试剂盒。该试剂盒包括：Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试剂、荧光定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品。其中RT-PCR检测试剂特征是：oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTM III RT。T-载体连接试剂特征是：2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA连接酶。荧光实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织ERCC1试剂特征是：SYBR Premix Ex Taq(2X)，Rox referencedye。
目标基因β tubulin III上下游引物分别是：
forward：5’-GCGAGATGTACGAAGACGAC-3’
reverse：5’-TTTAGACACTGCTGGCTTCG-3’；
校正基因Beta-Actin上下游引物分别是：
forward：5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’
reverse：5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’；
目标基因ERCC1标准品序列为：
GTAGCGGAGGCTGAGGAACAGGGCACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATAGTCGGGAATTACGTCGCCAAATTCCCAGGGCA
CGTTGCGCACGAACTTCAGTACGGGATTGCCCCTCTGCCGAGGGCTCACAATGATGCTGTTGGATTTTGCC；
校正基因Beta-Actin标准品序列为：
GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCT
GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
该试剂盒采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR对临床能取得肿瘤组织的患者进行检测；检测方法简单可行，检测结果稳定可靠，具有高特异性、高灵敏度的特点，而且非常适于批量样本检测，可以用来筛选对紫杉类治疗有效的晚期或术后非小细胞肺癌患者。
[附图说明]
图1是β-actin标准曲线；
图2是β-actin标准品扩增曲线；
图3是β-tubulin标准曲线；
图4是β-tubulin标准品扩增曲线。
[具体实施方式]
实施例1、
一：组织RNA的提取
1.新鲜组织取下后，立即置于液氮中，然后存于-80℃冰箱中保存待检测。
2.取适当大小组织标本(约100毫克)用研铂在液氮中磨碎，移入装有1000ulTrizol的预冷的1.5毫升离心管中，冰上放置10分钟。
3.加入200ul的氯仿。
4.用镊子取子弹头，盖上盖子，上下颠倒混匀，15S左右。
5.静置5min。
6.离心，12000RPM/min，4℃，15min。
7.取上层。(中下层为蛋白质和DNA的混合物)
8.加入异丙醇：1000ml Trizol加入500ul异丙醇．
9.混匀，静置10min。离心，12000RPM/min，4℃，15min。
10.直接将上清液弃掉，可以看见壁上有少许白色沉淀黏附。
11.75％酒精洗涤：加入量与Trizol一样。混匀。离心，8000g/min，4℃，15min。
12.弃上清。
13.真空干燥，约10min。
14.用20ul DEPC-水溶解RNA(用Tip头反复吹打)。
15.55℃-60℃水浴5min。
16.1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取情况：完整的RNA在紫外分析仪下可见三条带，分别为28S，18S，5S。28S的亮度应该为18S的两倍，5S带一般较弱，如有降解可见5S带增强。
17.测定所提RNA的OD260和OD280值，计算总RNA的浓度以及纯度：OD260／OD280应在1.8—2.1之间
二：RT-PCR合成cDNA
1.将试剂盒中的所有试剂混匀并快速离心收集；
2.在0.2ml PCR反应管中加入以下反应物：
1ug总RNA nul
50uM oligo(dT)20 1ul
10mM dNTP mix 1ul
DEPC-treatedwater 补足到10ul
3.65℃孵育5分钟，立即置于冰上至少1分钟。
4.再在此管中加入以下反应物，混匀。
10XRT buffer 2ul
25mM MgCl2 4ul
0.1M DTT 2ul
RNASEOUTTM(40U/ul) 1ul
SuperScriptTM III RT(200U/ul) 1ul
5.50℃孵育50分钟，然后85℃反应5分钟。立即置于冰上。
6.离心收集产物。加入1ul RNase H，37℃孵育20分钟。
7.cDNA合成以后置于—20℃保存待下游工作。
三：标准品的构建
1.快速离心PGEM-T Vector，收集反应物于管低。
2.建立连接体系：在0.2mlL离心管中以下反应物：
2X Rapid Ligation Buffer 5ul
pGEM-T Vector 1ul
PCR Product 2ul
T4 DNA连接酶(3U/ul) 1ul
无菌水 1ul
3.混匀，室温1小时或4℃孵育过夜。
4.准备两个AMP LB平板，室温放置备用。
5.将连接体系中的反应物取2ul于7ml的离心管中。
6.取50ul感受态细胞于7ml管中，轻弹混匀，冰浴30分钟。
7.42℃水浴热休克90秒。立即置于冰中2分钟。
8.加950ul soc培养基于管中。37℃，150rpm培养1个半小时。
9.离心，1000g/min，10min后弃上清收集细胞。
10.加入100ul或200ul的SOC培养基，重新悬浮细胞，轻弹混合。
11.于每个平板中加入100ul混合细胞液，用接种环铺开反应液。
12.37℃孵育过夜。
13.观察菌的生长情况，将单个菌落用枪头挑出后放进含100ulSOC培养液的0.5ml的离心管中反复吹打，将菌落洗脱。
14.PCR进行菌落的挑选，挑选目标菌落。
15.取PCR结果合适的SOC培养基加入(5ml+50ulAmp)的LB培养肉汤中，150rpm培养过夜。
16.提取质粒，测OD值，计算此标准品的拷贝数。
17.按照所需浓度稀释成工作液。
18.测定标准品的序列，验证转入序列的正确性。
四：荧光定量检测：包括标准曲线的制作和未知样品的检测：
1.确定未知样品的位置和重复数，最好每个样品重复三次。
2.将质粒标准品ERCC1和看家基因标准品β-actin倍比稀释成5个浓度：108，107，106，105，104，103，确定每个标准品的位置和重复数。
3.在反应板的每个反应孔中加入以下体积的液体：
SYBR Premix Ex 12.5ul
Taq(2X)
10uM sense primer 0.5ul
10uM antisense primer 0.5ul
Rox reference dye 0.5ul
Template DNA 1ul
无菌水 10ul
4.盖上热反应膜，将反应板装入定量分析仪。
5.按仪器操作创建定量反应板。
6.指定热循环的条件并开始运行反应板：
聚合酶的活化：20秒@95℃
PCR扩增(40个循环)：5秒@95℃，31秒@60℃
7.保存文件，单击start开始。
8.待反应完毕，分析数据，以β-actin作为标准，计算每个细胞的β—tubulin III的表达水平，如在中位数以上定为阳性，如在中位数以下定为阴性。
实施例2、通过检测肿瘤组织β—tubulinIII表达水平用于预测非小细胞肺癌患者对紫杉醇类治疗的疗效
对120例非小细胞肺癌患者进行了肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测患者对紫杉醇类治疗的疗效，其准确率达85％，假阴性率为5％，假阳性率为10％。
实施例3、紫杉醇类治疗的乳腺癌患者行肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测用于预测其对紫杉醇类治疗疗效
对100例乳腺癌进行了肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测患者对紫杉醇类治疗的疗效，其预测准确率达88％，假阴性率为5％，假阳性率为7％。
实施例4、检测肿瘤组织β—tubulinIII表达水平用于预测结直肠癌患者对紫杉醇类治疗的疗效
对80例服用选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶小分子抑制剂，包括但不限于易瑞沙，又名ZD1839，gefitinib或Ireesa和它塞瓦，又名OSI-774，Erlotinib或Tarceva，是人工合成的小分子量化合物，的结直肠癌患者进行了EGFR Intron1(CA)n微卫星多态性检测，并根据检测结果预测患者对靶向抑制剂的疗效，其预测准确率达85％，假阴性率为6％，假阳性率为13％。
实施例5、肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测用于预测转移性肾癌患者对紫杉醇类治疗的疗效
对20例接受紫杉醇类治疗治疗的转移性肾癌患者进行了肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测患者对对紫杉醇类治疗的疗效，其准确率达73％，假阴性率为13％，假阳性率为14％。
实施例6、头颈部肿瘤患者检测肿瘤组织β—tubulinIII表达水平用于预测其对紫杉醇类治疗的疗效
35例头颈部肿瘤患者接受紫杉醇类药物的治疗，我们对这35例患者进行了肿瘤组织β—tubulinIII表达水平检测，并根据检测结果预测患者对紫杉醇类治疗的疗效，其准确率达77％，假阴性率为10％，假阳性率为13％。
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。
紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用
<110>广东省人民医院
<120>紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>引物
<400>1
gcgagatgta cgaagacgac 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>引物
<400>2
tttagacact gctggcttcg 20
>210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>引物
<400>3
gccaaccgcg agaagatga 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>引物
<400>4
catcacgatg ccagtggta 19
<210>5
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>目标基因β tubulin III标准品序列
<400>5
gtagcggaggc tgaggaaca gggcacaggt gctctggccc agcacatagt cgggaattac 60
gtcgccaaat tcccagggca cgttgcgcac gaacttcagt acgggattgc ccctctgccg 120
agggctcaca atgatgctgt tggattttgcc 150
<210>6
<211>120
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>miSC feature
<223>校正基因Beta-Actin标准品序列
<400>6
gccaaccgcg agaagatga ccagatcatg tttgagacct tcaacacccc agccatgtac 60
gtggccatcc aggcagcgct gtccctgtac acctctggcc gtaccactgg catcgtgatg 120
Claims (5)
1.一种紫杉醇类药物疗效预测试剂盒，它包括：Trizol、RT-PCR逆转录试剂、T-载体连接试
剂、荧光定量PCR试剂、引物、TAQ酶、标准品，其特征在于：
目标基因β t u b u l i n III上下游引物分别是：
forward：5’-GCGAGATGTACGAAGACGAC-3’
reverse：5’-TTTAGACACTGCTGGCTTCG-3’；
校正基因Beta-Actin上下游引物分别是：
forward：5’-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3’
reverse：5’-CATCACGATGCCAGTGGTA-3’；
目标基因ERCC1标准品序列为：
GTAGCGGAGGCTGAGGAACAGGGCACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATAGTCGGGAATTACGTCGCCAAATTCCCAGGGCA
CGTTGCGCACGAACTTCAGTACGGGATTGCCCCTCTGCCGAGGGCTCACAATGATGCTGTTGGATTTTGCC；
校正基因Beta-Actin标准品序列为：
GCCAACCGCGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCAGCGCT
GTCCCTGTACACCTCTGGCCGTACCACTGGCATCGTGATG。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RT-PCR检测试剂为：oligo(dT)20，dNTP mix，DEPC-treated water，10X RT buffer，MgCl2，DTT，RNASEOUTTM，SuperScriptTM III RT。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于T-载体连接试剂为：2X Rapid Ligation Buffer，pGEM-T Vector，T4 DNA连接酶。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于荧光实时定量RT-PCR检测人肿瘤组织ERCC1试剂为：
SYBR Premix Ex Taq(2X)，Rox reference dye。
5.权利要求1所述试剂盒应用于紫杉醇类药物对肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、转移性肾癌以及头颈部肿瘤的疗效预测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CNA2006101224452A CN101424638A (zh) | 2006-09-27 | 2006-09-27 | 紫杉醇类药物疗效预测试剂盒及其应用 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102409087A (zh) * | 2011-08-11 | 2012-04-11 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种用于测定β-微管蛋白III 基因表达的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN102492775A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-13 | 童永清 | 抗微管化疗药物基因TUBB3 mRNA表达量快速检测试剂盒 |
| CN104024851A (zh) * | 2011-11-28 | 2014-09-03 | 加拿大国家研究委员会 | 针对癌症的紫杉醇反应标志物 |
| CN106840811A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-13 | 中国科学院自动化研究所 | 一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒 |
-
2006
- 2006-09-27 CN CNA2006101224452A patent/CN101424638A/zh active Pending
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