CN109593840A - 检测mlh1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

检测mlh1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法 Download PDF

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黄京林
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林汉杰
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Abstract

本发明公开了一种检测MLH1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法，所述引物对具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的碱基序列，检测方法是以待检测样品转化后的DNA作为模板，进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；判读待检测样品的熔解曲线。本发明的检测方法可以廉价、快速、灵敏的对MLH1基因启动子进行甲基化检测，适合临床分子诊断实验室使用。

Description

检测MLH1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测MLH1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法。
背景技术
DNA甲基化是胞嘧啶的第5位碳原子在DNA甲基转移酶催化下，使胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA表观遗传修饰方式在不改变基因序列前提下实现了对基因表达的调控。
MLH1是DNA错配修复(MMR)基因，其启动子甲基化与基因表达缺失密切相关。遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)是一种常染色体显性遗传疾病综合征，由错配修复(MMR)基因种系突变引起，占所有结直肠癌的2％-3％。并且，MLH1失活所致的微卫星不稳定(MSI)参与了散发性结直肠癌的发生、发展。
近年来，在MLH1基因启动子甲基化的相关临床和基础方面研究取得较好的进展。NCCN遗传性家族性高风险评估指南结直肠(2017.V1)①对于IHC提示MLH1缺失的结直肠癌患者应做BRAF V600E突变或MLH1启动子甲基化检测，如果未发现突变或甲基化，进而检测有生殖系突变的患者就被认为是林奇患者。②MLH1启动子甲基化检测比BRAF突变检测特异性高，因此MLH1启动子甲基化检测是在MLH1缺失且BRAF未突变的病人中排除更多林奇综合症患者的一种方法。
目前实验室检测甲基化的方法包括：甲基化特异性PCR法(MSP)、亚硫酸氢盐测序法(BSP)、甲基化敏感的限制性内切酶法(MS-RE)，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法(MS-HRM)等。亚硫酸氢盐测序法(BSP)，步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，不易于形成标准化操作的分子诊断产品。甲基化敏感的限制性内切酶法(MS-RE)，识别的CG序列因酶的识别位点有限故有局限性，且存在酶不完全消化引起的假阳性问题等。甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-HRM)完全是基于核酸的物理性质进行分析，只需在常规PCR基础上增加一些饱和染料，通过熔解曲线的差异即可分辨。样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，具有快速、低成本、灵敏性高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析。但HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能获得较好的检测灵敏度。
因此，有必要提供一种改进的方法以实现MLH1基因启动子甲基化准确、快速且廉价的检测。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种针对MLH1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及HRM检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测MLH1基因启动子甲基化的引物对，所述引物对具有如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的碱基序列。
本发明还提供了一种检测MLH1基因启动子甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括2*master mix。
在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括MgCl2。
本发明还提供了一种检测MLH1基因启动子甲基化的反应体系，所述反应体系包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
在其中一些实施例中，所述反应体系还包括2*master mix和MgCl2。
在其中一些实施例中，检测MLH1基因启动子甲基化的反应体系为：DNA模板1-5μL、2*Master mix 10-12.5μL、MgCl22.5-3.5μL、SEQ ID NO.1引物0.6-1μL、SEQ ID NO.2引物0.6-1μL、无酶水加至15-20μL。
本发明还提供了一种检测MLH1基因启动子甲基化的方法，包括以下步骤：
(1)、采用甲基化处理试剂盒(EZ DNA MethylationTMKit产品编号：D5001)对DNA样本进行亚硫酸盐处理转化，具体步骤参照甲基化试剂盒说明书，得到待测样品DNA转化后产物。
(2)、以上述待测样品DNA转化后产物为模版，采用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对进行HRM检测分析，收集荧光信号，判读待检测样品的熔解曲线，若待检测样品的熔解曲线中显示出两个或以上的熔解峰，则表示该样品的MLH1基因启动子发生甲基化，如只显示一个熔解峰，则表示该样品的MLH1基因启动子未发生甲基化。
在其中一些实施例中，步骤(1)的荧光定量PCR的反应体系为：DNA模板1-5μL、2*Master mix 10-12.5μL、MgCl22.5-3.5μL、SEQ ID NO.1引物0.6-1μL、SEQ ID NO.2引物0.6-1μL、无酶水加至15-20μL。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量PCR的反应程序为：92-98℃预变性5-10min→(92-98℃20s、58-62℃20s、72℃20s)40-45cycles→熔解温度75-86℃，温度每升高1℃获取25次荧光信号→40℃10s。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述模板的浓度为20-100ng/μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的发明人通过大量的试验，寻找到了一种特异性和敏感性较高的检测MLH1基因启动子甲基化的位点，从而排除更多非林奇综合征患者；并根据筛选到的检测MLH1基因启动子甲基化的位点，从大量的引物对中，筛选到了一组可以使用HRM方法正确检测MLH1基因启动子甲基化状态的引物对；
2、采用本发明的试剂盒进行MLH1基因启动子甲基化HRM法检测，对样本DNA的质量要求低，适用性广。同时，本发明方法对设备的要求也大大降低，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR仪即可无需使用测序仪，适用范围更广，仪器成本更低。
3、本发明的检测方法操作程序大大简化，全程闭管操作，避免交叉污染,易形成标准化操作的体外诊断试剂产品，且检测时间和试剂成本大大降低，转化后待测样品90分钟内即可完成检测。
附图说明
图1为样品MLH1基因启动子发生甲基化的HRM分析图(A)；样品MLH1基因启动子未发生甲基化的HRM分析图(B)；
图2为MLH1基因启动子不同甲基化程度标准品的HRM分析图；其中，A为50％甲基化程度标准品，B为25％甲基化程度标准品，C为10％甲基化程度标准品，D为非甲基化标准品；
图3为采用不同引物，使用本发明所述HRM检测方法检测MLH1基因启动子甲基化状态的结果图，其中，A为使用引物对2检测①号甲基化样品只有一个熔解峰，B为使用引物对3检测②号非甲基化样品出现两个熔解峰，C为使用引物对4扩增效率差，无法检测样品。
具体实施方式
以下通过附图和具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。
实施例1肠癌肿瘤组织样品MLH1基因启动子甲基化检测
1、引物
本实施例的一种检测MLH1基因启动子甲基化的引物，具有如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的碱基序列。
上游引物SEQ ID NO.1:GGTGATTGGTTGAAGGTATTTT
下游引物SEQ ID NO.2:AATTCTCAATCATCTCTTTAATAACATTAA
2、反应体系
使用LightCycler 480 High Resolution Melting Master(货号为04909631001)配制如下反应体系：DNA模板1-5μL、2*Master mix 10-12.5μL、MgCl22.5-3.5μL、SEQ IDNO.1引物0.6-1μL、SEQ ID NO.2引物0.6-1μL、无酶水加至15-20μL。
3、检测方法
(1)、样品来源及检测：所有肠癌患者肿瘤样品均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用美基石蜡样品提取试剂盒对基因组DNA进行提取。采用甲基化处理试剂盒(EZ DNA MethylationTM Kit产品编号：D5001)对DNA样本进行亚硫酸盐处理转化。在上述反应体系中分别加入2ul的转化后产物。离心后，使用罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪进行检测，程序如下：92-98℃预变性5-10min→(92-98℃20s、58-62℃20s、72℃20s)40-45cycles→熔解温度75-86℃，温度每升高1℃获取25次荧光信号→40℃10s。
(2)、判读待测标本的熔解曲线，以确定MLH1基因启动子是否发生甲基化。如熔解曲线显示出两个或以上的熔解峰，则待测样品MLH1基因启动子发生甲基化。如只显示一个熔解峰，则表示该样品的MLH1基因启动子未发生甲基化。
图1为①号样品MLH1基因启动子发生甲基化的HRM分析图(A)；②号样品MLH1基因启动子未发生甲基化的HRM分析图(B)。
试验例1检测MLH1基因启动子甲基化的位点筛选
MLH1是DNA错配修复(MMR)基因，其启动子甲基化与基因表达缺失密切相关。林奇综合征(HNPCC)是一种常染色体显性遗传疾病综合征，由错配修复(MMR)基因种系突变引起，占所有结直肠癌的2％-3％。并且，MLH1失活所致的微卫星不稳定(MSI)参与了散发性结直肠癌的发生、发展。
常规的免疫组化可以检测MLH1基因是否表达从而初步筛查林奇综合征，但不表达的样品常常由于MLH1基因启动子甲基化造成而不是林奇综合征。并且临床上免疫组化会遇到一些可疑的样品，因此需要寻找一种特异性和敏感性较高的检测MLH1基因启动子甲基化的位点，从而排除更多非林奇综合征患者。
本试验例参照实施例1中检测方法，分别使用如表1所示引物对检测了MLH1启动子的4个区域，检测结果分别如表2-5所示。
表1检测引物对
注：上表I是次黄嘌呤核苷，简并碱基。
检测①区(-755至-574号碱基共182bp)：特异性不高，造成林奇综合征患者的漏诊。
表2检测①区与免疫组化结果的比较
检测②区：(-597至-393号碱基共205bp)：特异性不高，造成林奇综合征患者的漏诊。
表3检测②区与免疫组化结果的比较
检测③区：(-934至-733号碱基共202bp)：特异性不高，造成漏诊。
表4检测③区与免疫组化结果的比较
检测④区：(-64至+115号碱基)与免疫组化结果相比，特异性100％，不会造成林奇综合征患者的漏诊，敏感性40.43％，这部分病人可以节约做二代测序的成本和时间(见表4)，是本发明方法的检测区域。
表5检测④区与免疫组化结果的比较
试验例2本发明方法与亚硫酸氢盐测序法(BSP)方法比较
88例临床肿瘤样品均来自中山大学附属第六医院病理科，分别采取本发明实施例1方法和亚硫酸氢盐测序法(BSP)对这88例样品进行了检测，结果如表6所示。
表6两种方法的检测结果比较
由表6结果可知，本发明检测的88例样品结果与亚硫酸氢盐测序法结果完全相符，每个标本的检测时间比Sanger测序法缩短了83.33％，同时每个标本的检测成本降低了79.41％。使用本发明所述HRM方法检测MLH1基因启动子甲基化，可以大大节约检测时间和成本，值得推广使用。
试验例3不同百分比甲基化标准品的MLH1基因启动子甲基化检测
1、使用甲基化标准品CpGenomeTM Human Methylated DNA Standard(Millipore,货号S8001M)和非甲基化标准品CpGenomeTM Human Methylated DNA Standard(Millipore,货号S8001U)配制成以下几种不同甲基化比例的标准品：50％甲基化、25％甲基化、10％甲基化、非甲基化，具体配制方法参考本技术领域的常规方法。
2、配制检测试剂，即实施例1中反应体系；
3、取步骤1所配制的不同突变比例的标准品1ul，加入步骤2中检测试剂中，将检测试剂放入罗氏LightCycler 480实时荧光定量PCR仪中进行检测；
4、PCR和HRM程序：92-98℃预变性5-10min→(92-98℃20s、58-62℃20s、72℃20s)40-45 cycles→熔解温度75-86℃，温度每升高1℃获取25次荧光信号→40℃10s。
5、HRM结果分析：若待测样品熔解曲线显示出两个或以上的熔解峰，样品发生MLH1基因启动子甲基化，否则为MLH1基因启动子非甲基化。
图2为MLH1基因启动子不同甲基化程度标准品的HRM分析图；其中，A为50％甲基化程度标准品，B为25％甲基化程度标准品，C为10％甲基化程度标准品，D为非甲基化标准品；说明本发明的检测方法能检测出低至10％甲基化的样品，能满足临床检测需求。
试验例4采用不同引物对MLH1基因启动子甲基化进行检测的结果对比
发明人摸索了多组引物，研究HRM法(实施例1的方法)对检测上述MLH1基因启动子甲基化实验结果的影响。以下表7以实施例1方法，采用多组示例性引物包括简并引物对MLH1基因启动子甲基化进行检测所得结果。实验证明，引物的最终选择关乎方法的可行性。
表7采用4对示范性引物对峰型、判读结果的影响
注：上表I是次黄嘌呤核苷，简并碱基。采用HRM检测法，样品扩增CT值<33为佳，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次PCR反应扩增效果不好或无法扩增，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。
图3为采用不同引物，使用本发明所述HRM检测方法检测MLH1基因启动子甲基化状态的结果图，其中，A为使用引物对2检测①号甲基化样品只有一个熔解峰，B为使用引物对3检测②号非甲基化样品出现两个熔解峰，C为使用引物对4扩增效率差，无法检测样品；检测结果显示，只有本发明选用的引物对1才能正确检测MLH1基因启动子甲基化状态。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 傅新晖
黄京林
陈志婷
林汉杰
王婧璇
王磊
汪建平
<120> 检测MLH1基因启动子甲基化的引物对、试剂盒及方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ggtgattggt tgaaggtatt tt 22
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
aattctcaat catctcttta ataacattaa 30
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
aggatttttt gttttgtgat atttg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
taacctcctt cactcctaaa aaaaa 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
actaaccict aaataacttc ccc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
actaaccict aaataacttc ccc 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
ggtattgagg tgattggttg a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
taacigctaa ataacttcc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
ttttttagga gtgaaggagg 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ataaaaccct atacctaatc tatc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
gatagattag gtatagggtt ttat 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
tacttaacic ttctcaaact cct 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
aggatttttt gttttgtgat atttg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
taacctcctt cactcctaaa aaaaa 25

Claims (10)

1.一种检测MLH1基因启动子甲基化的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
2.一种检测MLH1基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的检测MLH1基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2*master mix。
4.根据权利要求3所述的检测MLH1基因启动子甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MgCl2。
5.一种检测MLH1基因启动子甲基化的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括权利要求1所述的引物对。
6.根据权利要求5所述的检测MLH1基因启动子甲基化的反应体系，其特征在于，所述反应体系为：DNA模板1-5μL、2*Master mix 10-12.5μL、MgCl2 2.5-3.5μL、SEQ ID NO.1引物0.6-1μL、SEQ ID NO.2引物0.6-1μL、无酶水加至15-20μL。
7.一种检测MLH1基因启动子甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将待检测样品的DNA进行亚硫酸盐转化；
(2)、以步骤(1)中的产物作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行荧光定量PCR反应，收集荧光信号，绘制熔解曲线；
(3)、判读待检测样品的熔解曲线。
8.根据权利要求7所述的检测MLH1基因启动子甲基化的方法，其特征在于，步骤(2)中所述荧光定量PCR反应的反应体系为：DNA模板1-5μL、2*Master mix 10-12.5μL、MgCl22.5-3.5μL、SEQ ID NO.1引物0.6-1μL、SEQ ID NO.2引物0.6-1μL、无酶水加至15-20μL。
9.根据权利要求7所述的检测MLH1基因启动子甲基化的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光定量PCR反应的反应程序为：92-98℃预变性5-10min→(92-98℃20s、58-62℃20s、72℃20s)40-45cycles→熔解温度75-86℃，温度每升高1℃获取25次荧光信号→40℃10s。
10.根据权利要求7所述的检测MLH1基因启动子甲基化的方法，其特征在于，步骤(1)所述模板的浓度为20-100ng/μL。
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