CN109593799A - 一种制备l-茶氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备L‑茶氨酸的方法，属于生物工程领域。该方法包括以下步骤：(1)制备L‑茶氨酸粗液；(2)预处理；(3)超滤；(4)脱色、浓缩；(5)结晶，得到L‑茶氨酸。该方法可使用较低酶活力的谷氨酰胺酶发酵液生产L‑茶氨酸，能够提高L‑茶氨酸的提取率和品质，可广泛应用于L‑茶氨酸的工业制备中。

Description

一种制备L-茶氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种制备L-茶氨酸的方法。
背景技术
L-茶氨酸是茶树的特有成分之一，其分子式为C7H14O3N2(N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)，占茶叶26种游离氨基酸的50％-70％，占茶叶干重的1％-3％。迄今为止，除茶之外，研究者也在油茶、茶梅、红山茶以及菌类中发现含有少量L-茶氨酸。自1950年L-茶氨酸被首次发现以来，其生理功能也慢慢被人们熟知。L-茶氨酸能够干扰肿瘤细胞内的谷氨酸代谢，从而抑制肿瘤并能够增强抗阿霉素、吡桑比星等肿瘤药物的疗效；L-茶氨酸进入脑中通过影响中枢及末梢神经系统实现降血压作用；L-茶氨酸可抑制咖啡碱引起的神经系统的兴奋，可使人体放松，有助于睡眠。这些生理功能的发现为其应用奠定了基础。最初L-茶氨酸的利用是作为低档绿茶品质改善的风味剂，随后L-茶氨酸被用在食品中改善风味，在医疗保健中增强药效等。
L-茶氨酸的生产方法有化学合成法、天然茶氨酸提取法和微生物发酵法。化学合成法制备L-茶氨酸的成本较高且有被用于存在铅离子污染的危险，实际生产意义不大。天然茶氨酸提取法是根据茶氨酸易溶于水、在高温和酸碱等条件下稳定性较强的特性，采用热水或冷乙醇从茶叶中直接提取，该法操作复杂、容易被铜离子等污染，同时茶氨酸容易受硫酸钡沉淀析出而损失。发酵法根据菌种的特性、酶的活性、设备的选择和发酵条件控制等因素制备L-茶氨酸。随着基因工程技术的发展，工业上多使用产谷氨酰胺酶、谷氨酰转肽酶的菌株发酵产生相应的酶后，再与L-谷氨酰胺、盐酸乙胺反应从而制备L-茶氨酸。
比如，中国专利CN102850235A公开了一种L-茶氨酸的纯化工艺，该方法以产谷氨酰转肽酶的菌株发酵液为起始原料，通过催化反应、大孔树脂吸附、超滤浓缩、冷冻干燥得到的L-茶氨酸产品，纯度达到98％、收率为70％以上；但是该方法操作步骤复杂且收率相对不高。
再如，中国专利CN103409475A公开了一种酶法合成L-茶氨酸的方法，该方法以过量表达γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌为原始菌株，将其发酵液与L-谷氨酰胺、乙胺盐酸盐反应进而得到的L-茶氨酸产物，L-茶氨酸对谷氨酰胺的摩尔转化率为75％；但是，此方法获得L-茶氨酸的纯度及收率极易受到起始发酵液的酶活的限制。
因此，亟需一种不受发酵液酶活的限制且收率较高的制备L-茶氨酸的方法。
发明内容
针对现有技术中制备L-茶氨酸的方法受发酵液酶活的限制且收率较低的问题，本发明提供了一种制备L-茶氨酸的方法，该方法可使用较低酶活力的谷氨酰胺酶发酵液生产L-茶氨酸，本方法制备的L-茶氨酸纯度可达98％、提取率80％以上。
本发明提供了一种制备L-茶氨酸的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)制备L-茶氨酸粗液：向谷氨酰胺酶发酵液中加入底物，反应得到L-茶氨酸粗液；
(2)预处理：向步骤(1)所得的L-茶氨酸粗液中加入絮凝剂和离子去除剂，搅拌后，加热、离心处理，得到上清液；
(3)超滤：将步骤(2)所得的上清液通过超滤膜进行超滤处理，得到滤清液1；
(4)脱色：向步骤(3)所得的滤清液1中加入活性炭，脱色、过滤，得到滤清液2，将滤清液2浓缩至原体积的50％，得到浓缩液；
(5)结晶：将步骤(4)所得的浓缩液用无水乙醇进行结晶，得到L-茶氨酸。
优选地，步骤(1)中所述的底物包括：终浓度为0.5-1.5M L-谷氨酰胺、2.0-3.0M乙胺和0.5-1.0M吲哚乙酸；所述的反应在pH为8.0、40℃下进行3小时；进一步优选地，所述的底物包括：终浓度为1.0M L-谷氨酰胺、2.5M乙胺和0.8M吲哚乙酸。
优选地，步骤(2)中所述的絮凝剂包括：按照质量百分比计，70-90％壳多糖和30-10％盐酸二甲双胍。
优选地，步骤(2)中所述的絮凝剂包括：壳多糖和盐酸二甲双胍；絮凝剂的用量为：按质量体积百分比计，L-茶氨酸粗液的0.8％；进一步优选地，所述的絮凝剂包括：按照质量百分比计，70-80％壳多糖和30-20％盐酸二甲双胍。
优选地，步骤(2)中所述的离子去除剂为1.0-2.0g/L草酸铵和0.5-1.0g/L三聚磷酸钠组成的溶液；离子去除剂的用量为L-茶氨酸反应液体积的0.4％；进一步优选地，所述的离子去除剂为1.5g/L草酸铵和0.8g/L三聚磷酸钠组成的溶液。
优选地，步骤(2)中所述的加热温度为40-60℃，保温10-20分钟；进一步优选地，所述的加热温度为50℃，保温15分钟。
优选地，步骤(2)中所述的离心的条件为使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟。
优选地，步骤(3)中所述的超滤膜为聚丙烯腈超滤膜，切割截留分子量为10000。
优选地，步骤(3)中所述的超滤处理条件包括：操作温度为30-40℃，操作压力为0.10-0.14MPa；进一步优选地，所述的操作温度为32℃，操作压力为0.13MPa。
优选地，步骤(4)中所述的活性炭的用量按质量体积百分比为滤清液1的1.0-2.0％，脱色时间为10-15分钟，脱色温度为20-35℃；进一步优选地，所述的活性炭的用量按质量体积百分比为滤清液1的1.5％，脱色时间为12分钟，脱色温度为30℃。
优选地，步骤(5)中所述的结晶的条件包括：结晶温度为0-3℃，结晶时间为24-36小时；进一步优选地，所述的结晶温度为1℃，结晶时间为26小时。
以上技术方案均能够实现本发明所述的技术效果，但在一些优选的实施方案中，所达到的技术效果优于其他方案。
例如：当步骤(1)中所述的絮凝剂中壳多糖和盐酸二甲双胍的比例为5:1时，所达到的技术效果更佳。其中一个优选的絮凝剂包括：按照质量百分比计，75％壳多糖和15％盐酸二甲双胍。
最优选地，所述的絮凝剂包括：按照质量百分比计，80％壳多糖和16％盐酸二甲双胍。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明可使用酶活力低至0.4U/mL的谷氨酰胺酶发酵液生产L-茶氨酸。
(2)本发明使用由壳多糖和盐酸二甲双胍组成的絮凝剂，使用由草酸铵和三聚磷酸钠组成的离子去除剂，能够有效地去除大分子杂质及离子。
(3)本发明采用超滤分离技术，有效地去除了非目标氨基酸等杂质。
(4)本发明提供的L-茶氨酸的分离纯化方法制备得到的L-茶氨酸纯度达到99％、提取率80％以上。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
基础实施例
一种制备L-茶氨酸的方法，以100L谷氨酰胺酶发酵液为例，包括以下步骤：
(1)制备L-茶氨酸粗液：向谷氨酰胺酶发酵液中加入底物，在pH为8.0、40℃下反应3小时得到L-茶氨酸粗液；其中，谷氨酰胺酶发酵液是由工业上常用谷氨酰胺酶生产菌株与原料发酵后获得的；
(2)预处理：向步骤(1)所得的L-茶氨酸粗液中加入絮凝剂和离子去除剂，室温搅拌30分钟后，加热，使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟，得到上清液；其中，絮凝剂的用量为：按质量体积百分比计，L-茶氨酸粗液的0.8％，离子去除剂的用量为L-茶氨酸反应液体积的0.4％；
(3)超滤：将步骤(2)所得的上清液使用聚丙烯腈超滤膜(切割截留分子量为10000)进行超滤处理，得到滤清液1；
(4)脱色：按照活性炭与滤清液1的质量体积百分比，向滤清液1加入活性炭，使用常规方法进行脱色，得到滤清液2，将滤清液2浓缩至原体积的50％，得到浓缩液；
(5)结晶：将步骤(4)所得的浓缩液与无水乙醇按照体积比为1:4进行结晶，使用常规方法进行真空干燥，得到L-茶氨酸。
使用上述基础步骤制备L-茶氨酸，各步骤中关键条件的参数如表1所示。
表1各步骤中关键条件的参数
对比例1
与实施例3相比仅缺少盐酸二甲双胍。
对比例2
与实施例3相比仅缺少离子去除剂中的草酸铵。
对比例3
与实施例3相比仅缺少离子去除剂中的三聚磷酸钠。
对比例4
使用中国专利CN102850235A所述方法制备L-茶氨酸。
实验例1发酵液中谷氨酰胺酶的酶活测定
以γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GpNA)和双甘二肽(Gly-Gly)为底物进行酶活测定。酶活测定体系为1mL(含终浓度为5mmol/Lγ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GpNA)，80mmol/L双甘二肽(Gly-Gly)，50mM硼砂-NaOH缓冲液，pH10)，在37℃下加入20μL适当稀释的酶液反应5分钟后，加入4M醋酸溶液400μL终止反应，在分光光度计410nm处测定吸光值。该条件下每分钟生成1μmol对硝基苯胺的酶量所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。本发明实施例中使用的谷氨酰胺酶发酵液的酶活力为0.4U/mL。
实验例2 L-茶氨酸粗液中初始L-茶氨酸含量测定
将反应液样品经氨基酸自动分析仪进行检测分析，对L-茶氨酸粗液中L-茶氨酸含量进行精确测定。测定结果显示，本发明实施例中使用的L-茶氨酸粗液中初始L-茶氨酸含量为0.082kg/L。
实验例3 L-茶氨酸提取率的计算
提取率＝L-茶氨酸终质量(kg)/[初始L-茶氨酸含量(kg/L)*L-茶氨酸粗液体积(L)]×100％
实验例4 L-茶氨酸纯度的测定
使用高效液相色谱法进行纯度测定。
实验结果
L-茶氨酸终质量(kg) 提取率 纯度
实施例1 6.740 82.20％ 98.21％
实施例2 6.660 81.22％ 98.10％
实施例3 7.120 86.83％ 99.20％
实施例4 6.850 83.54％ 98.50％
对比例1 6.120 74.63％ 95.20％
对比例2 6.220 75.85％ 95.40％
对比例3 6.010 73.29％ 95.10％
对比例4 5.300 64.63％ 93.00％
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备L-茶氨酸的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)制备L-茶氨酸粗液：向谷氨酰胺酶发酵液中加入底物，反应得到L-茶氨酸粗液；
(2)预处理：向步骤(1)所得的L-茶氨酸粗液中加入絮凝剂和离子去除剂，搅拌后，加热、离心处理，得到上清液；
(3)超滤：将步骤(2)所得的上清液通过超滤膜进行超滤处理，得到滤清液1；
(4)脱色：向步骤(3)所得的滤清液1中加入活性炭，脱色、过滤，得到滤清液2，将滤清液2浓缩至原体积的50％，得到浓缩液；
(5)结晶：将步骤(4)所得的浓缩液用无水乙醇进行结晶，得到L-茶氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的底物包括：终浓度为0.5-1.5M L-谷氨酰胺、2.0-3.0M乙胺和0.5-1.0M吲哚乙酸；所述的反应在pH为8.0、40℃下进行3小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的絮凝剂包括：壳多糖和盐酸二甲双胍；絮凝剂的用量为：按质量体积百分比计，L-茶氨酸粗液的0.8％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的絮凝剂包括：按照质量百分比计，70-90％壳多糖和30-10％盐酸二甲双胍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的离子去除剂为1.0-2.0g/L草酸铵和0.5-1.0g/L三聚磷酸钠组成的溶液；离子去除剂的用量为L-茶氨酸反应液体积的0.4％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的加热的温度为40-60℃，保温10-20分钟；所述的离心的条件为使用沉降式离心机10000转/分钟离心10分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的超滤膜为聚丙烯腈超滤膜，切割截留分子量为10000。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的超滤处理条件包括：操作温度为30-40℃，操作压力为0.10-0.14MPa。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的活性炭的用量按质量体积百分比为滤清液1的1.0-2.0％，脱色时间为10-15分钟，脱色温度为20-35℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的结晶的条件包括：结晶温度为0-3℃，结晶时间为24-36小时。
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CN102432495A (zh) * 2011-11-03 2012-05-02 江苏阿格罗生物科技有限公司 利用集成膜技术从谷氨酰胺酶或谷氨酰转肽酶转化液中分离、浓缩l-茶氨酸的方法

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七院校《普通化学》编写组: "《普通化学》", 31 August 1985, 河南科学技术出版社 *

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