CN109593084B - 脯氨酰羟化酶小分子光敏前药及其制备方法与应用 - Google Patents

脯氨酰羟化酶小分子光敏前药及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于脯氨酰羟化酶光敏前药的设计、合成和制药用途。该类光敏前药的结构模块包括脯氨酰羟化酶结合基团和香豆素光敏基团，此类光敏小分子在特定激光照射下导致光敏基团离去，释放活性分子，可用于脯氨酰羟化酶抑制剂活性的光调控，基于光控光敏分子，可以在时间和空间上选择性地活化脯氨酰羟化酶抑制剂。本发明的脯氨酰羟化酶光敏前药结构新颖、设计合理、以此类结构分子作为工具分子，高效精确地实现光控制的脯氨酰羟化酶抑制剂的活化，实现光调控HIF的稳定性及下游基因EPO表达。该类光敏前药可用于制备治疗贫血症及缺血性疾病的药物。

Description

脯氨酰羟化酶小分子光敏前药及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化学生物学，具体涉及一类基于脯氨酰羟化酶设计的小分子光敏前药，其制备方法，以及在稳定缺氧诱导因子(HIF)方面的应用。
背景技术
缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)可以调控多种信号转录程序，例如红细胞生成，线粒体代谢和血管生成等，这些转录程序通常与中风，慢性肾性贫血，神经退行性疾病和急性肾损伤等缺血性疾病紧密联系，严重影响了患者的正常生活。缺血性疾病的主要诱因是缺氧诱导因子(HIF)表达下降，导致相关脏器产生和分泌促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)不足(Clin.Sci.2018,132(7),825-838)。目前，缺血性疾病的护理标准旨在通过静脉注射重组人促红细胞生成素(rhEPO)来恢复红细胞(RBC)水平，从而提高缺血性患者的生活质量(Nat.Med.2015,21(3),221-230)。然而，rhEPO治疗存在许多缺点，包括严重的副作用(高血压)，治疗不方便等。此外，rhEPO治疗可能会导致不良的心血管结果。因此，为了更好地治疗缺血性疾病，迫切需要发展安全可靠和组织靶向性小分子。
值得注意的是，HIF是由HIF-α和HIF-β组成的二聚化转录因子，它在调控EPO和其他血液相关调节因子中至关重要。在常氧条件下，HIF-α的脯氨酸残基被脯氨酰羟化酶(Prolyl Hydroxylase,PHD)羟基化，导致HIF-α被林希因子(VHL)识别，随后快速被蛋白酶体降解(Science 2002,296(5574),1886-1889)。目前研究表明，HIF的羟基化降解过程主要由脯氨酰羟化酶2主导，抑制PHD2酶的生理功能，抑制PHD2酶对HIF-α的羟基化作用，使得HIF-α逃脱被降解的命运，从而上调内源性EPO等靶蛋白(Blood 2017,110(6),2193-2196)，有望治疗包括肾性贫血在内的缺血性疾病(Expert Opin.Ther.Pat.2010,20(9),1219-1245)。近年来，PHD2抑制剂是治疗肾性贫血最有前景的手段(Med.Chem.Comm.2016,7,1271-1284)，科学家一直致力于开发一种可以治疗贫血的PHD2小分子抑制剂。最近，FG-4592(vadadustat)在中国获批上市，用于治疗慢性肾性贫血(http://www.nmpa.gov.cn/WS04/CL2168/333945.html)。PHD2抑制剂除了在慢性肾性贫血方面的应用外，PHD2抑制剂在急性肾损伤，中风，脑卒中等缺血性疾病中展示出了一定的治疗潜力。然而，目前大多数PHD2抑制剂缺乏对特定组织的选择性，并在体内具有广谱的HIF稳定活性，这使它们在缺血性疾病的治疗中显得复杂化，生物利用度较差。为了避免PHD2抑制剂广谱活性带来的副作用和潜在风险，基于已报道的PHD2抑制剂，我们发展了一类光敏前药，为靶向脑卒中和急性肾损伤等缺血性疾病的药物开发奠定基础。
近年来，光敏前药在药物研究中有着广泛的应用，光敏前药主要包括光敏基团和靶标活性分子(Chemical reviews 2013,113(1),119-191)。光敏前药在特定的激光照射下，光敏基团离去释放活性分子，比如杀虫剂、神经递质、信号分子和活性小分子，从而表现出理想的生物学功能。在激光照射下，光敏前药能够在特定的组织精准高效释放出活性分子，达到治疗疾病的作用，减小毒副作用，改善生物利用度。
基于此，本发明公开了一类基于PHD2甘氨酸类小分子抑制剂设计的光敏前药，其制备方法，以及在稳定缺氧诱导因子(HIF)方面的应用。在特定激光照射下，光敏基团离去释放活性小分子，达到疾病预期治疗效果。基于此类光敏前药，可准确地实现药物的光控释放，有效地提高了药物的靶向选择性，能够很好地用于治疗缺血性疾病和脑卒中等与脯氨酰羟化酶及HIF调控密切相关疾病，具有极大的临床应用前景。
发明内容
发明目的：基于上述现有技术，本申请提供了一种基于脯氨酰羟化酶PHD2抑制剂的光敏前药，及其制备方法，以及在制备治疗缺血性疾病以及与脯氨酰羟化酶密切相关疾病的药物中的应用。
技术方案：本发明所述的一种脯氨酰羟化酶小分子光敏前药，结构式如通式I所示：
Figure BDA0001954198640000021
R1为脯氨酰羟化酶结合基团，选自异喹啉、苯基吡啶、喹诺酮、三氮唑吡啶、炔基吡啶甘氨酸类脯氨酰羟化酶抑制剂；
R2为香豆素光敏基团，选自羟基、氨基、卤素、-NR3R4，其中，R3、R4分别选自羧甲基、C1-C4烷基，或者R3、R4形成C3-C6环烷烃。
优选的，R1选自：
Figure BDA0001954198640000022
Figure BDA0001954198640000023
作为优选，R2选自：-I、-OH、
Figure BDA0001954198640000024
进一步的，所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药优选自Ⅰ-1至Ⅰ-10：
Figure BDA0001954198640000025
Figure BDA0001954198640000031
Figure BDA0001954198640000041
本发明所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药的合成方法，反应式如下：
Figure BDA0001954198640000051
通式化合物脯氨酰羟化酶抑制剂1在碱性条件下与光敏分子2经缩合反应制得通式I光敏前药。
其中，所述碱性试剂选自KF、NaOH、KOH；反应溶剂选自二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷，反应温度为30-50℃，反应时间1.5-10小时。
本发明所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药在药学上可接受的盐及载体也在本发明的保护范围内。
本发明所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药或药学上可接受的盐及载体用于制备治疗贫血症或缺血性疾病的药物的用途也在本发明的保护范围内。
进一步的，所述缺血性疾病包括脑卒中、中风和心肌缺血相关疾病。
在所述应用中，将本发明的脯氨酰羟化酶小分子光敏前药溶于缓冲溶液，在特定激光照射下导致光敏基团离去，释放活性脯氨酰羟化酶抑制剂，实现基于光控制的脯氨酰羟化酶抑制剂的活化。所述激光波长优选380–450nm。
有益效果：本发明通过将香豆素类光敏基团引入到脯氨酰羟化酶抑制剂的活性作用位点，成功合成脯氨酰羟化酶小分子光敏前药，在特定激光照射下导致光敏基团离去，释放活性分子，可用于脯氨酰羟化酶抑制剂活性的光调控，基于光控光敏分子，可以在时间和空间上选择性地活化脯氨酰羟化酶抑制剂。本发明的脯氨酰羟化酶光敏前药结构新颖、设计合理、以此类结构分子作为工具分子，高效精确地实现光控制的脯氨酰羟化酶抑制剂的活化，实现光调控HIF的稳定性及下游基因EPO表达。该类光敏前药有望提高药物的选择性，改善其生物利用度，用于制备治疗心肌损伤和脑卒中等与脯氨酰羟化酶及HIF调控密切相关的缺血性疾病的药物。
附图说明
图1是光敏前药Ⅰ-1未经特定光照和405nm照射下随时间变化对PHD2的抑制率；
图2是光敏前药Ⅰ-1细胞水平的免疫印迹试验结果。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。
细胞、试剂和仪器来源：
Hek293细胞：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；LaminB：Abcam。
化学试剂：阿拉丁。
SpectraMaxGeminiXS：Molecular Devices i 3；
PHD2蛋白：Nanjing zoombio biotechmology；
FITC-HIF1α(556-574)：Shanghai Apeptide Co.,Ltd.
质粒：Addgene。
实施例1
荧光探针Ⅰ-1的制备
N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸(0.834g，2.0mmol)，4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮(0.494g，2.0mmol)，和氟化钾(0.174g，3.0mmol)溶于DMF(6mL)中，在N2保护下将混合物在45℃搅拌2.0小时，并用CH2Cl2(3×5mL)萃取。合并的有机相用饱和NaCl水(5mL)洗涤两次，无水Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，粗品柱层析纯化(CH2Cl2：EtOAc＝3:8)，得目标产物探针Ⅰ-1 0.641g，产率为49.7％，Rf：0.31(甲醇：乙酸乙酯＝2：5)，m.p.250.7-253.1℃，该化合物的1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.29(s,1H),9.62(s,1H),8.92(s,1H),8.70(s,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝7.9Hz,1H),7.31(d,J＝7.1Hz,2H),6.98(d,J＝7.0Hz,2H),6.58(d,J＝7.8Hz,1H),6.50(s,1H),6.06(s,1H),5.36(s,2H),4.84(s,2H),4.43(s,2H),4.23(s,2H),3.36(d,J＝7.2Hz,4H),1.07(d,J＝7.1Hz,6H).,HRMS(ESI):found 647.2003(C32H32ClN6O7,[M+H]+647.2016,requires 647.2006).
实施例2
荧光探针Ⅰ-2的制备
制备方法同实施例1，用4-(羟甲基)-7-(哌啶-1-基)-2H-色烯-2-酮(0.518g，2.0mmol)替换(4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.716g，收率54.4％，Rf：0.32(甲醇：乙酸乙酯＝2：5)，m.p.253.1-255.6℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.73(d,J＝1.6Hz,1H),8.41–8.34(m,1H),8.12(s,1H),7.86(d,J＝1.5Hz,1H),7.52(d,J＝7.5Hz,1H),7.29–7.23(m,2H),6.98–6.93(m,2H),6.76(dd,J＝7.4,1.6Hz,1H),6.59(d,J＝1.5Hz,1H),6.14(t,J＝1.0Hz,1H),5.28(d,J＝1.1Hz,2H),4.54–4.48(m,2H),4.46–4.31(m,2H),4.17(d,J＝9.7Hz,2H),3.42(t,J＝6.9Hz,4H),1.72–1.56(m,6H).,HRMS(ESI):found659.1949(C33H31ClN6O7,[M+H]+,requires 659.1943).
实施例3
荧光探针Ⅰ-3的制备
制备方法同实施例1，用(5-(3-氯苯基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸(0.612g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用2,2'-((4-(溴甲基)-2-氧代-2H-色烯-7-基)氮杂二基)二乙酸(0.742g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.790g，收率66.7％，m.p.260.1-263.6℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝1.6Hz,1H),8.37(t,J＝9.6Hz,1H),7.67(d,J＝1.4Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.50(d,J＝7.5Hz,1H),7.39–7.36(m,1H),7.35(dt,J＝7.5,1.7Hz,1H),6.88(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.64(d,J＝1.4Hz,1H),6.14(t,J＝0.9Hz,1H),5.28(d,J＝1.1Hz,2H),4.19–4.13(m,6H).，HRMS(ESI):found 595.1004(C28H22ClN3O10,[M+H]+,requires 596.0994).
实施例4
荧光探针Ⅰ-4的制备
制备方法同实施例1，用(5-(3-氯苯基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸(0.612g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用7-(二甲氨基)-4-(溴甲基)-2H-吡喃-2-酮(0.566g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.660g，收率65.0％，m.p.220.1-221.6℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝1.4Hz,1H),8.37(t,J＝9.6Hz,1H),7.70(d,J＝1.4Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.41–7.32(m,2H),6.71(td,J＝4.0,1.5Hz,2H),6.15(t,J＝1.0Hz,1H),5.28(d,J＝0.9Hz,2H),4.16(d,J＝9.7Hz,2H),2.88(s,6H).，HRMS(ESI):found 508.1199(C26H22ClN3O6,[M+H]+,requires508.1197).
实施例5
荧光探针Ⅰ-5的制备
制备方法同实施例1，用(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-羰基)甘氨酸(0.704g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用4-(溴甲基)-7-(吡咯烷-1-基)-2H-吡喃-2-酮(0.618g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.813g,收率70.2％，m.p.189.1-191.6℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.35(t,J＝9.6Hz,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.55–7.50(m,2H),7.37–7.30(m,2H),7.09(tt,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.03–6.97(m,2H),6.89(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.77(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.59(d,J＝1.6Hz,1H),6.14(t,J＝0.9Hz,1H),5.28(d,J＝1.1Hz,2H),4.16(d,J＝9.5Hz,2H),3.56–3.46(m,4H),2.68(s,3H),2.05–1.96(m,4H).，HRMS(ESI):found 580.6096(C33H29N3O7,[M+H]+,requires 580.6090).
实施例6
荧光探针Ⅰ-6的制备
制备方法同实施例1，用(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-羰基)甘氨酸(0.704g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用7-羟基-4-(溴甲基)-2H-吡喃-2-酮(0.512g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.881g,收率83.7％，m.p.189.1-191.6℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.29(s,1H),8.35(t,J＝9.6Hz,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.57(d,J＝1.5Hz,1H),7.38(d,J＝7.5Hz,1H),7.37–7.29(m,2H),7.08(tt,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.04–6.98(m,2H),6.89(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),6.75(d,J＝1.5Hz,1H),6.62(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.15(t,J＝1.0Hz,1H),5.28(d,J＝0.9Hz,2H),4.16(d,J＝9.5Hz,2H),2.69(s,3H).，13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ170.87,167.77,161.52,160.99,157.05,155.70,155.44,152.65,147.10,145.37,128.96,127.69,127.41,125.04,124.46,121.82,118.94,113.45,113.14,111.14,109.54,109.47,102.91,102.85,65.36,41.78,25.17.，HRMS(ESI):found 527.1372(C29H22N2O8,[M+H]+,requires527.1376).
实施例7
荧光探针Ⅰ-7的制备
制备方法同实施例1，用(1-苄基-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-羰基)甘氨酸(0.704g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用7-(氮杂环丁烷-1-基)-4-(羟甲基)-2H-吡喃-2-酮(0.590g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.629g,收率55.7％，m.p.191.6-193.5℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.78–8.71(m,1H),8.25(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.54–7.46(m,2H),7.38(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.34–7.27(m,5H),7.27–7.22(m,1H),6.77(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.59(d,J＝1.5Hz,1H),6.14(t,J＝0.9Hz,1H),5.30–5.25(m,4H),3.98(d,J＝9.1Hz,2H),3.54(t,J＝7.1Hz,4H),1.96(p,J＝7.1Hz,2H).，HRMS(ESI):found 566.1850(C32H27N3O7,[M+H]+,requires 566.1849).
实施例8
荧光探针Ⅰ-8的制备
制备方法同实施例1，用(1-苄基-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-羰基)甘氨酸(0.704g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用4-(溴甲基)-7-碘-2H-苯并吡喃-2-酮(0.692g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.889g,收率71.8％，m.p.198.6-199.7℃，该化合物的1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.78–8.71(m,1H),8.25(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.61(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.58–7.51(m,2H),7.42(d,J＝7.5Hz,1H),7.38(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.34–7.22(m,6H),6.14(t,J＝1.0Hz,1H),5.31–5.25(m,4H),3.98(d,J＝9.1Hz,2H).，HRMS(ESI):found 606.2166(C35H31N3O7,[M+H]+,requires 606.2162).
实施例9
荧光探针Ⅰ-9的制备
制备方法同实施例1，用(5-(3-(4-氯苯氧基)丙-1-炔-1-基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸(0.720g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，得黄色固体0.912g,收率77.4％，m.p.188.1-190.4℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.49(d,J＝1.5Hz,1H),8.41(t,J＝9.5Hz,1H),7.58(d,J＝1.5Hz,1H),7.51(d,J＝7.5Hz,1H),7.28–7.23(m,2H),6.99–6.93(m,2H),6.72(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.58(d,J＝1.4Hz,1H),6.14(t,J＝0.9Hz,1H),5.28(d,J＝1.1Hz,2H),4.85(s,2H),4.16(d,J＝9.5Hz,2H),3.50(q,J＝8.0Hz,4H),1.17(t,J＝8.0Hz,6H).，HRMS(ESI):found591.0292(C31H28ClN3O7,[M+H]+,requires 591.0290)，HPLC(80:20甲醇:水):tR＝3.976min,96.67％。
实施例10
荧光探针Ⅰ-10的制备
制备方法同实施例1，用(5-(3-(4-氯苯氧基)丙-1-炔-1-基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸(0.720g，2.0mmol)替换N-(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰)甘氨酸，用4-(溴甲基)-7-(2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2H-吡喃-2-酮(0.710g，2.0mmol)替换4-(溴甲基)-7-(二乙基氨基)-2H-吡喃-2-酮，得黄色固体0.910g,收率77.8％，m.p.190.1-193.7℃，该化合物的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.49(d,J＝1.4Hz,1H),8.41(t,J＝9.5Hz,1H),7.58(d,J＝1.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.4Hz,1H),7.28–7.23(m,2H),6.99–6.93(m,2H),6.82(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.67(d,J＝1.5Hz,1H),6.14(t,J＝0.9Hz,1H),6.07–5.98(m,2H),5.28(d,J＝1.1Hz,2H),4.85(s,2H),4.16(d,J＝9.5Hz,2H),3.98(dt,J＝3.6,1.0Hz,2H),3.93(dt,J＝3.8,1.2Hz,2H).，HRMS(ESI):found586.1307(C31H24ClN3O7,[M+H]+,requires 586.1303)，HPLC(80:20甲醇:水):tR＝3.9450min,97.51％。
上述制备所得化合物的生物学实验及结果如下：
半抑制浓度(IC50)检测；
光敏前药要能应用于HIF的稳定调节，首先需要保证光敏前药在可见光照射下能释放出活性PHD2抑制剂，达到抑制PHD2的效果。光敏前药溶于缓冲液里，用405nm的激光照射，我们通过HPLC追踪光控释放活性分子的情况。HPLC法示踪表明本发明通式I的光敏前药有较好的光控释放效率。接着，我们选取光照20min后的反应液，通过荧光偏振法(affinity-based fluorescence polarization assay,FP assay)来检测光敏前药光照后对于PHD2的活力，用半数抑制浓度(IC50)来表征其亲和力强弱。PHD酶包含3中亚型，分别为PHD1、PHD2、PHD3，其中PHD2亚型为体内分别最为广泛的亚型，也是治疗缺血性疾病的主要靶向亚型。我们主要考察了光敏前药对PHD2酶的亲和力。
测试方法：荧光偏振实验在384孔平底黑色板(#3575，Corning)中进行，最终体积为60μL。最终的测定缓冲液含有40nM PHD2、，20μL FITC-HIF-1α556-574，以及处理好的光敏前药，用来测试的384黑色板在室温下孵育2h，然后使用具有偏振滤光器和用于荧光素的光学模块SpectraMaxGeminiXS读板器读取数值(λex＝485nM±25nM，λem＝535nM±25nM)。GraphPad Prism 6.0分析标准误差。
具体操作：测试中使用384孔黑板(型号为Corining#3575)，测试终体积选择60μL，所测试的化合物和FITC-HIF-1α556-574分别溶解于DMSO和纯水中备用。将化合物用assaybuffer倍比稀释12个浓度梯度后每孔加入20μL稀释好100nM/L PHD2蛋白。每个化合物浓度设定两个附孔，每次试验设置空白对照(20μL FITC-HIF-1α556-574+40μL assay buffer)和阴性对照(20μL FITC-HIF-1α556-574+20μL PHD2+20μL assay buffer)。室温孵育1小时，用Synergy读板器扫板，激发波长设置为485nm，发射波长设置为535nm，测试结果用Graphpad Prime 6进行分析，相同条件下，我们还测试了相应的PHD2抑制剂对PHD2蛋白的半数抑制浓度(IC50)，如表1所示。
表1
Figure BDA0001954198640000101
根据表1的统计数据可见，本发明中的光敏前药在光照之后均具与阳性药相当的PHD2酶结合活力。
本发明以Ⅰ-1光敏前药为例说明此类光敏前药随着405nm激光照射时间的变化，测试其对PHD2蛋白抑制率的动态变化。我们给予1.3μMⅠ-1光敏前药405nm的激光持续照射，选取不同照射时间点的样品进行PHD2靶标抑制率测试。通过酶标仪读取的荧光偏振数值和对应的Ⅰ-3光敏前药405nm照射时间如表2所示，酶标仪读取荧光偏振值，以只加荧光多肽探针缓冲液为空白对照，荧光多肽探针和PHD2蛋白为阴性对照。当探针和蛋白结合时，荧光偏振值(mp)变小。以Ⅰ-1光敏前药为例说明随着光照，其对PHD2抑制率的计算过程，酶标仪读取两个复孔的荧光偏振值如表2所示，通过公式％抑制率＝100*(1-(实测值-空白)/(阴性值-空白))，得出具体光照时间点所对应的抑制率。将所得数据导入Graphpad prism 6.0分析拟合得光照时间-抑制率曲线，如图1所示，表明未经过405nm光照的样品未显示出PHD2抑制活性，经过光照的样本数据表明，抑制率有明显的光照时间依赖性，随着光照时间的延长，其对PHD2的抑制率也在增加，20min后达到等同于阳性药的抑制率。
表2
Figure BDA0001954198640000102
Figure BDA0001954198640000111
下游HRE和EPO基因表达实验：
稳定存在的HIF-α能够进入细胞核，形成多聚体后与低氧应答元件(HRE)结合，而激活下游基因的表达。构建质粒在HRE下游插入荧光素酶基因，加入底物后产生的化学发光可间接代表HIF-α的量。将构建质粒转染进入Hek 293细胞后，给相应将代表性实施例光敏前药，405nm激光照射20min后，共孵育24h，将细胞裂解，加入相应的荧光素底物，测定其产生的化学发光，通过发光强度的高低来表示化合物是否对细胞HIF-α水平具有提高作用。
EPO为体内HIF-α升高后的标志物，当脯氨酰羟化酶活性受到抑制后，体内HIF-α含量升高，将入核诱导下游相关基因的表达，包括EPO等。通过检测EPO的表达来验证化合物在细胞水平是否具有抑制脯氨酰羟化酶同时稳定HIF-α的能力。表3表明本发明代表性化合物经过光照之后，是否能够提高细胞HIF-α以及EPO水平如表3所示：
表3
Figure BDA0001954198640000112
Figure BDA0001954198640000121
细胞水平的免疫印迹实验(Western-blot)：
由表1和表3可见，这类光敏前药随着405nm激光照射，光敏基团有较优的离去效率，从而释放阳性药PHD2抑制剂抑制PHD2酶活性。以光敏前药Ⅰ-1为例，说明其在细胞水平的免疫印迹试验(Western-blot)说明本发明化合物稳定HIF-α的作用。
选取肝癌细胞Hek293细胞，饥饿细胞6h，给50μM的化合物Ⅰ-1，405nm激光照射处理细胞，照射时间分别为1min、5min、10min、15min、20min。共孵育细胞24小时，处理细胞，将Hek293细胞核质分离，以细胞核为样品进行WB分析。LaminB作为内参对照，DMSO作为阴性对照，阳性化合物III-1作为阳性对照。实验结果如图2所示，表明化合物Ⅰ-1随着光照能显著稳定HIF-α。

Claims (9)

1.一种脯氨酰羟化酶小分子光敏前药，其特征在于，结构式如通式I所示：
Figure FDA0003199556130000011
R2选自羟基、氨基、卤素、-NR3R4，其中，R3、R4分别选自羧甲基、羧乙基、C1-C6烷基，或者R3、R4形成C3-C8环烷基；
R1选自：
Figure FDA0003199556130000012
Figure FDA0003199556130000013
2.根据权利要求1所述的脯氨酰羟化酶小分子光敏前药，其特征在于，R2选自：-I、-OH、
Figure FDA0003199556130000014
3.根据权利要求1所述的脯氨酰羟化酶小分子光敏前药，其特征在于，选自Ⅰ-1至Ⅰ-10：
Ⅰ-1:(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-色烯-4-基)甲基(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸
Ⅰ-2:(2-氧代-7-(哌啶-1-基)-2H-色烯-4-基)甲基(5-(1-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸
Ⅰ-3:2,2'-((4-((((5-(3-氯苯基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酰基)氧)甲基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-7-基)氮杂二基)二乙酸
Ⅰ-4:(7-(二甲基氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(5-(3-氯苯基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸
Ⅰ-5:(2-氧代-7-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基异喹啉-3-羰基)甘氨酸
Ⅰ-6:(7-羟基-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基异喹啉-3-羰基)甘氨酸
Ⅰ-7:(7-(氮杂环丁烷-1-基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(1-苄基-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-羰基)甘氨酸
Ⅰ-8:(7-碘-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(1-苄基-4-羟基-2-氧代-1,2-二氢喹啉-3-羰基)甘氨酸
Ⅰ-9:(7-(二乙基氨基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(5-(3-(4-氯苯氧基)丙-1-炔-1-基)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸
Ⅰ-10:(7-(2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-4-基)甲基(5-(3-(4-氯苯氧基)丙-1-炔-1)-3-羟基吡啶甲酰基)甘氨酸。
4.权利要求1所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药药学上可接受的盐。
5.权利要求1所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药的合成方法，其特征在于，反应式如下：
Figure FDA0003199556130000021
通式化合物脯氨酰羟化酶抑制剂1在碱性条件下与光敏分子2经缩合反应制得通式I光敏前药。
6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述碱性试剂选自KF、NaOH、KOH；反应溶剂选自二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷，反应温度为30-50℃，反应时间1.5-10小时。
7.权利要求1所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药或药学上可接受的盐用于制备治疗贫血症或缺血性疾病的药物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述缺血性疾病为脑卒中、中风和心肌缺血相关疾病。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述脯氨酰羟化酶小分子光敏前药溶于缓冲溶液，在波长380–450nm激光照射下导致光敏基团离去，释放活性脯氨酰羟化酶抑制剂，实现基于光控制的脯氨酰羟化酶抑制剂的活化。
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