CN111004225B - 一种新型哌嗪类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种新型哌嗪类化合物，其结构通式为：

Description

一种新型哌嗪类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种新型哌嗪类化合物及其制备方法和其做为抗炎药物的应用。
背景技术
炎症是机体与致病因素进行斗争反应产生的病理过程，其与多种、甚至重大疾病相关，如脓毒症、多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病、癌症等(非专利文献1、2、3、4),极易对机体造成损伤。目前，上市的甾体、非甾体类药物，如塞米考昔、阿司匹林、布洛芬、保泰松等在治疗炎症的同时，副作用较大。因此，寻找高效、低副作用的新型抗炎药仍是科研工作中的难题。
本发明的目的在于提供一种新的高效、低副作用的抗炎药。由于海洋特殊环境易产生富含硝基等典型海洋特征骨架分子，其具有极强的生物活性和较高的药用潜力，因此，本发明对海洋天然产物Chrysamide B不同部位进行修饰，改造得到系列衍生物，对其进行抗炎活性实验测试。结果表明，所述化合物具有很好的抗炎活性，具有开发抗炎物开发潜力。
Figure BDA0002320599150000011
非专利文献1：Hotchkiss R S,Nicholson D W.Apoptosis and caspasesregulate death and inflammation in sepsis[J].Nature Reviews Immunology,2006,6(11):813.
非专利文献2：Noss E H,Brenner M B.The role and therapeuticimplications of fibroblast-like synoviocytes in inflammation and cartilageerosion in rheumatoid arthritis[J].Immunological reviews,2008,223(1):252.
非专利文献3：Donath M Y.Targeting inflammation in the treatment oftype 2diabetes:time to start[J].Nature reviews Drug discovery,2014,13(6):465.
非专利文献4：Crusz S M,Balkwill F R.Inflammation and cancer:advancesand new agents[J].Nature reviews Clinical oncology,2015,12(10):584.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供了一种具有抗炎的新型哌嗪化合物，该化合物由海洋天然产物Chrysamide B改造而来。
本发明的另一目的是提供上述新型哌嗪化合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供上述新型哌嗪化合物的应用。
为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：
一种新型哌嗪类化合物，其结构通式为：
Figure BDA0002320599150000021
其中，波浪线代表相连碳原子的不同手性；
R1为氢原子或是硝基的一种，R1在苯环上的取代位置为2位、3位、4位，取代基数量可以为单取代或多取代；
R2为氢原子或是烷基的一种；
R3为烷基链；
X为烷基链、链烯基、环烃基、杂环基中的一种，优选的X为1-2个碳原子低级烷基链；或2个碳原子的
Figure BDA0002320599150000022
链烯基；或有取代基或无取代基的
Figure BDA0002320599150000023
Figure BDA0002320599150000024
的3元环状结构。
上述新型哌嗪类化合物，其结构式为：
Figure BDA0002320599150000031
上述新型哌嗪类化合物的制备方法，具体步骤如下：
第一步：羧酸类化合物Ⅲ或羧酸类化合物Ⅵ的制备；
Figure BDA0002320599150000032
苯甲醛类化合物Ⅰ与Wittig试剂反应生成化合物Ⅱ；
化合物Ⅱ经KOH水解的羧酸化合物Ⅲ；
化合物Ⅱ被DIBAL-H还原得化合物Ⅳ；
化合物Ⅳ经环氧化或环丙烷化得到Y＝O或Y＝CH2化合物Ⅴ；
化合物Ⅴ通过两步连续氧化生成羧酸类化合物Ⅵ；
第二步：2，5-二甲基哌嗪类化合物X的制备；
Figure BDA0002320599150000041
不同构型氨基酸甲酯盐酸盐Ⅶ与Boc保护的不同构型氨基酸在缩合剂HATU作用下缩合得二肽Ⅷ；
二肽Ⅷ脱保护后发生分子内反应生成2,6-二羰基哌嗪类化合物Ⅸ；
2,6-二羰基哌嗪类化合物Ⅸ经LiAlH4还原得2,6-二甲基哌嗪Ⅹ；
第三步：二聚体类化合物式(一)的制备；
Figure BDA0002320599150000042
羧酸类化合物Ⅲ或羧酸类化合物Ⅵ与2,6-二甲基哌嗪Ⅹ发生双边酸胺缩合得二聚体式(一)化合物；
单体类化合物式(二)的制备：
Figure BDA0002320599150000043
羧酸类化合物Ⅵ与2,6-二甲基哌嗪Ⅹ发生单边酸胺缩合后与得单体式(二)化合物。
单体类化合物式(三)的制备：
Figure BDA0002320599150000051
羧酸类化合物Ⅵ与2,6-二甲基哌嗪Ⅹ发生单边酸胺缩合后与得单体式(三)化合物。
上述新型哌嗪类化合物与盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、甲磺酸、延胡索酸、枸橼酸、苯磺酸或对甲苯磺酸中的一种或一种以上的混合物形成盐。
上述新型哌嗪类化合物具有抗毒、抗炎、抗氧化作用和具有镇痛作用。其抗炎作用表现为下调诱导型一氧化氮合酶、COX-2、IL-1β和COX-2mRNA和蛋白的表达，升高IL-10的表达。
上述新型哌嗪类化合物可以抑制免疫细胞的焦亡，可以抑制NF-κB的核转位。
上述新型哌嗪类化合物用于脓毒血症、骨关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性红斑狼疮性脑炎、痛风、银屑病、炎症性肠病、三叉神经疼痛、帕金森、脑卒中、脑外伤，高脂血症、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、全身型幼年特发性关节炎，心脑血管疾病，高脂血症，疼痛，糖尿病，神经炎症，肿瘤免疫疗法。尤其可以具有预防和治疗脓毒血症作用。
上述新型哌嗪类化合物用于治疗疾病时制成的剂型包括滴丸剂、软胶囊、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、片剂、巴布剂、软膏剂、凝胶剂、透皮控释贴剂、气雾剂、喷雾剂、脂质体。
本发明对新型哌嗪类化合物Chrysamide B不同部位进行修饰，改造得到系列衍生物，其具有极强的生物活性和较高的药用潜力，对其进行抗炎活性实验测试。结果表明，所述化合物具有很好的抗炎活性，提供一种新的高效、低副作用的抗炎药，体内外实验证实所述化合物具有抗炎相关疾病的应用。
附图说明
图1为所选化合物对RAW264.7炎症状态下的保护作用；
图2为所选化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响；
图3为所选化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞表达iNOS、p-NF-κB和COX-2的影响；
图4电泳图和PCR实时扩增产物溶解图；
图5为所选化合物对LPS诱导的RAW264.7 NF-κB核转位的影响；
图6为所选化合物对LPS诱导的小鼠脓毒血症生存曲线；
图7为所选化合物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响；
图8为所选化合物对LPS诱导的C6细胞GFAP表达的影响；
图9为所选化合物对细胞焦亡的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明不限于这些实施例。1HNMR在Bruker核磁共振波谱仪(400MHz或300MHz)上完成。13C NMR在Bruker核磁共振波谱仪(101MHz或75MHz)上完成。常规缩写如下:s＝单峰,d＝双峰,t＝三重峰,q＝四重峰,m＝多重峰,brs＝宽单峰,overlap＝重叠峰.氘代试剂选用氘代氯仿，氢谱定标为7.26ppm；碳谱定标为77.30ppm。LC-MS的检测源为ES-API(Agilent InfinityLab LC/MSD；USA).
实施例1
羧酸类化合物(Ⅲ或Ⅵ)的制备路线:
Figure BDA0002320599150000061
1、化合物Ⅱ的制备：
氩气条件下，在250mL反应瓶中，将3g(19.87mmol)4-硝基苯甲醛(Ⅰ)溶于40mL无水无氧二氯甲烷中，冰浴条件下，缓慢加入8.3g(23.84mmol)叶立德试剂(wittig试剂)methyl2-(triphenylphosphoranylidene)propanoate，室温搅拌12h。经TLC监测反应完全后，用二氯甲烷稀释，加水萃取，收集有机相，将其旋干，并用无水硫酸钠干燥后，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝15：1)得到淡黄色固体4g，收率92％。
同样的合成过程，适用于苯甲醛，3-硝基苯甲醛，2-硝基苯甲醛为起始原料(I)，可制备不同硝基位置取代或无取代基的中间体(II)；wittig试剂也可选用methyl 2-(triphenyl-l5-phosphaneylidene)acetate，操作过程相同，用于制备中间体(II)。
2、化合物Ⅲ的制备：
在50mL反应瓶中，将500mg(2.26mmol)化合物Ⅱ溶于甲醇中，随后加入2mL(2M)KOH溶液，室温搅拌30min。经TLC检测反应完全后，加乙酸乙酯稀释，用水萃取，收集水相，再用3M HCl酸化至PH＝1～2，加乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，过滤，旋干得淡黄色固体444mg，收率95％。
3、化合物Ⅳ的制备：
氩气条件下，在100mL反应瓶中，3.5g(15.83mmol)化合物Ⅲ溶于30mL无水无氧二氯甲烷中，将反应冷至-78℃，缓慢滴加23.22mL DIBAL-H，搅拌3h。TLC监测反应完全后，滴加10mL饱和酒石酸钠溶液，移至室温，搅拌1h后，加二氯甲烷稀释，加水萃取，收集有机相，将其旋干，并用无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝3：1)得到淡黄色固体2.75g，收率90％。
4、化合物Ⅴ的制备(Y＝O)：
在反应瓶里，将1g(5.18mmol)化合物Ⅳ、5g
Figure BDA0002320599150000071
分子筛溶于17mL无水无氧二氯甲烷中，将反应冷至-36℃，缓慢加入194mg(0.83mmol)D-(-)-酒石酸二异丙酯、236mg(0.83mmol)钛酸四异丙酯，搅拌30min后，加入2mL(11.40mmol)过氧叔丁醇(5.5M indecane)，搅拌1h。经TLC检测反应完全，将反应移至室温，加水淬灭，抽滤并收集有机相，旋干，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝3：1)得到环氧化合物((2R,3R)-2-methyl-3-phenyloxiran-2-yl)methanol(白色固体)920mg，收率85％,ee值95％；
同样的，((2S,3S)-2-methyl-3-phenyloxiran-2-yl)methanol的制备同上述条件。以L-(-)-酒石酸二异丙酯代替D-(-)-酒石酸二异丙酯，收率80％，ee值92％；
5、化合物Ⅴ的制备(Y＝CH2)：
氩气条件下，在100mL反应瓶里，将3.2g(25.9mmol)二乙基锌、6.7g(25.9mmol)二碘甲烷溶于25mL无水无氧二氯甲烷中，冷至-20℃，缓慢滴入5.18mmol化合物Ⅳ的二氯甲烷溶液，搅拌10h。TLC监测反应完全后，用3mL饱和氯化铵淬灭后，加6mL 1M HCl，加水稀释，萃取，收集有机相，旋干，干燥，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝3：1)得(2-methyl-3-phenyloxiran-2-yl)methanol(无色液体)750mg，收率70％。
6、化合物Ⅵ的制备：
在100mL反应瓶中，将1g化合物Ⅴ溶于30mL二氯甲烷后，缓慢加入2.1g DMP，搅拌1h。TLC监测反应完全后，加5mL饱和碳酸氢钠和5mL饱和酒石酸钠溶液淬灭反应后，加水稀释，萃取，收集有机相，干燥，旋干，经硅胶层析柱纯化(V/V PE:EA＝5：1)得白色固体或液体。将上述产物溶于30mL二氯乙烷中，依次加入1.9g(4.58mmol)硝酸铁(九水)、716mg(4.58mmol)四甲基哌啶氮氧化物、341mg(4.58mmol)氯化钾，搅拌12h。TLC监测反应完全后，加水萃取，收集水相后，加3M HCl调PH至1～2,加乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得白色固体或无色液体，收率为80％。
同样的，以((2S,3S)-2-methyl-3-phenyloxiran-2-yl)methanol或(2-methyl-3-phenyloxiran-2-yl)methanol为起始原料V制备VI同上述条件。
实施例2
2，5-二甲基哌嗪类化合物(Ⅹ)的制备：
Figure BDA0002320599150000081
1、化合物Ⅷ的制备：
在500mL反应瓶中，将5g(35.97mmol)L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ⅶ)与6.8g(35.97mmol)Boc保护L-丙氨酸溶于90mL DMF中，将反应瓶移至冰浴，依次加入20.52g(53.96mmol)2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、15mL(107.91mmol)三乙胺，室温搅拌16h。经TLC检测反应完全，水洗，然后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝3：1)得白色固体8.9g，收率90％。
同样的，以原料(L-丙氨酸甲酯盐酸盐,Boc保护D-丙氨酸)及原料(甘氨酸甲酯盐酸盐,Boc保护甘氨酸)为起始原料VII的制备同上述条件。
2、化合物Ⅸ的制备：
在250mL反应瓶中，将2g(7.3mmol)化合物Ⅷ溶于18mL二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢加入5.9mL(80.3mmol)三氟乙酸，室温搅拌3h。经TLC检测反应完全，旋干溶剂，得棕色液体，将其重新溶于36mL叔丁醇中，在冰浴条件下，缓慢加入13.35mL(153.3mmol)吗啉，室温搅拌26h。经TLC检测反应完全，旋干，乙酸乙酯稀释后，抽滤，旋干，得白色固体932mg，收率90％。
同样的，以Methyl(tert-butoxycarbonyl)-D-alanyl-D-alaninate或Methyl(tert-butoxycarbonyl)gly-cylglycinate为起始原料VIII的制备同上述条件。
3、化合物Ⅹ的制备：
在250mL反应瓶中，将1g(7.04mmol)化合物Ⅸ溶于28mL无水四氢呋喃中，在冰浴条件下，缓慢加入5.61g(147.84mmol)氢化锂铝后，70℃回流12h。经TLC检测反应完全，加水淬灭后，抽滤，旋干得化合物Ⅹ710mg，收率90％。
同样的，以(3R,6R)-3,6-dimethylpiperazine-2,5-dione,或是piperazine-2,5-dione为起始原料IX的制备同上述条件。
实施例3
式(一)化合物的制备：
Figure BDA0002320599150000101
1、在50mL反应瓶中，将100mg(0.48mmol)(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid(Ⅲ)与20mg(0.18mmol)(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine(Ⅹ)溶于2mL DMF中，随后，依次加入104mg(0.54mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、73mg(0.54mmol)1-羟基苯并三唑、0.19mL(1.08mmol)三乙胺，室温搅拌16h。经TLC检测反应完全，水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝1：1)得白色固体s-1 85mg，收率90％。
2、同样的反应条件适用于(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylicacid(Ⅵ)为起始原料VI。50mL反应瓶中，将100mg(0.45mmol)(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-car-boxylic acid(Ⅵ)与20mg(0.18mmol)(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine(Ⅹ)溶于2mL DMF中，随后，依次加入104mg(0.54mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、73mg(0.54mmol)1-羟基苯并三唑、0.19mL(1.08mmol)三乙胺，室温搅拌16h。经TLC检测反应完全，水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，经硅胶柱层析纯化(V/V PE:EA＝1：1)得白色固体ab-1 75mg，收率80％。
同样选用(2R,3S)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-2-methyl-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-2-methyl-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-2-methyl-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-2-methyl-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2R,3S)-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-3-(3-nitrophenyl)oxi-rane-2-carboxylic acid,(2S,3R)-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid,(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid,(2S,3R)-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid,benzoic acid,3-phenylpropanoic acid,2-phenylacetic acid,1-methyl-2-(4-nitrophenyl)cyclopropane-1-carboxylic acid,(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid之一为起始原料IX,选用piperazine，(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine，(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine之一为起始原料X；可以按不同组合方式上述缩合方式得到终产物XI。
实施例4
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)-oxiran-2-yl)methanone)(ab-1):
(2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到ab-1为目标产物。[α]D 24.7＝+120.690(c:0.290,chloroform)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝8.6Hz,4H),7.53(d,J＝8.5Hz,4H),4.45(s,2H),4.28(s,4H),3.32–3.12(m,2H),1.31(s,6H),1.25(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.98,148.16,141.43,127.75,123.90,63.90,62.13,50.07,44.08,16.13,15.16.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例5
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)-oxiran-2-yl)methanone)(ab-2):
(2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到ab-2为目标产物。[α]D 24.7＝-157.45(c:0.470,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(d,J＝8.5Hz,4H),7.52(d,J＝8.6Hz,4H),4.45(s,2H),4.22(s,4H),3.06(s,1H),1.40–1.12(m,13H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.66,147.90,141.60,127.66,123.63,63.85,61.68,50.33,43.78,15.38,15.07.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例6
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(ab-3)
(2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到ab-3为目标产物。[α]D 25.2＝-121.43(c:0.280,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝8.6Hz,4H),7.52(d,J＝8.5Hz,4H),4.44(brs,2H),4.27(s,4H),3.32–3.10(m,2H),1.31(s,6H),1.28–1.15(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.97,148.18,141.44,127.76,123.92,63.93,62.15,50.06,44.09,16.16,15.18.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例7
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(ab-4)
(2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到ab-4为目标产物。[α]D 24.6＝+147.170(c:0.530,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(d,J＝8.6Hz,4H),7.52(d,J＝8.6Hz,4H),4.45(brs,2H),4.22(overlap,4H),3.06(brs,1H),2.58(brs,1H),1.36–1.13(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.74,148.00,141.61,127.72,123.72,63.93,61.79,50.38,43.83,15.46,15.17.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例8
Piperazine-1,4-diylbis(((2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxiran-2-yl)-methanone)(a-1)
(2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,piperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到a-1为目标产物。[α]D 25.3＝-26.667(c:0.150,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.27(d,J＝8.7Hz,4H),7.54(d,J＝8.6Hz,4H),4.31(d,J＝8.6Hz,2H),4.11–3.96(m,2H),3.84–3.67(m,4H),3.61(d,J＝10.6Hz,1H),3.33(d,J＝9.7Hz,1H),1.32(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.63,147.58,141.76,128.16,123.81,62.99,60.82,45.13,41.52,14.43.LC-MS(ESI+)m/z 519.1(MNa+).
实施例9
Piperazine-1,4-diylbis(((2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxiran-2-yl)-methanone)(a-2)
(2R,3S)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,piperazine做为中间体X,实施过程同XI。[α]D 24.5＝+56.000(c:0.250,chloroform).此实施例得到a-2为目标产物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝8.7Hz,4H),7.54(d,J＝8.6Hz,4H),4.31(d,J＝8.9Hz,2H),4.03(dd,J＝21.0,9.8Hz,2H),3.85–3.67(m,4H),3.61(d,J＝10.0Hz,1H),3.32(d,J＝9.8Hz,1H),1.31(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.39,148.20,141.44,127.78,123.91,64.02,62.08,45.91,42.53,15.27.LC-MS(ESI+)m/z519.1(MNa+).
实施例10
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis((1-methyl-2-(4-nitrophenyl)cyclo-propyl)methanone)(b-1):
1-methyl-2-(4-nitrophenyl)cyclopropane-1-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到b-1为目标产物。[α]D 24.3＝+190.698(c:0.430,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26–8.13(m,4H),7.44–7.30(m,4H),4.52–4.29(m,2H),4.16(dd,J＝14.4,6.6Hz,1H),4.00(dd,J＝14.1,6.4Hz,1H),3.19–2.97(m,2H),2.70–2.50(m,2H),1.59–1.54(m,1H),1.29–1.16(m,9H),1.06(d,J＝5.8Hz,4H),1.02(s,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.11,147.02,146.99,145.61,145.33,145.27,129.83,129.44,129.39,123.93,123.91,123.79,49.92,49.85,49.63,44.62,29.22,28.68,27.77,27.73,27.15,17.77,17.70,17.68,17.12,16.54,16.46,16.19.LC-MS(ESI+)m/z 543.2(MNa+).
实施例11
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis((1-methyl-2-(4-nitrophenyl)-cyclopropyl)methanone)(b-2)
1-methyl-2-(4-nitrophenyl)cyclopropane-1-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到b-2为目标产物。[α]D 24.4＝-81.308(c:1.070,chloroform)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26–8.13(m,4H),7.44–7.29(m,4H),4.52–4.29(m,2H),4.23–4.09(m,1H),4.09–3.94(m,1H),3.19–2.97(m,2H),2.70–2.50(m,2H),1.59–1.55(m,1H),1.29–1.16(m,9H),1.06(d,J＝5.8Hz,4H),1.02(s,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.11,147.03,147.00,145.61,145.33,145.28,129.83,129.44,129.39,123.92,123.90,123.79,49.92,49.85,49.63,44.76,29.22,29.16,28.68,27.78,27.74,17.78,17.71,17.68,17.11,16.54,16.46.LC-MS(ESI+)m/z 543.2(MNa+).
实施例12
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-phenyl-oxiran-2-yl)methanone)(c-1)
(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-1为目标产物。[α]D 25.1＝+39.216(c:2.550,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41–7.27(m,10H),4.46(brs,2H),4.35–4.09(m,4H),3.28–3.08(m,2H),1.30(s,6H),1.22(d,J＝4.8Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.73,133.99,128.55,128.44,126.66,63.25,62.71,49.78,44.09,16.11,14.97.LC-MS(ESI+)m/z 457.2(MNa+).
实施例13
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-phenyl-oxiran-2-yl)methanone)(c-2)
(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-2为目标产物。[α]D 25.3＝-163.49(c:0.630,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42–7.27(m,10H),4.46(brs,2H),4.36–3.95(m,4H),3.03(brs,1H),2.53(brs,1H),1.44–1.05(m,12H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ169.40,133.93,128.26,128.13,128.01,126.46,63.13,62.25,49.91,43.67,15.33,14.84.LC-MS(ESI+)m/z 457.2(MNa+).
实施例14
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-phenyl-oxiran-2-yl)methanone)(c-3)
(2R,3S)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-di-methy-piperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-3为目标产物。[α]D 25.2＝-109.52(c:0.630,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3))δ7.42–7.27(m,10H),4.46(brs,2H),4.37–4.11(m,4H),3.31–3.07(m,2H),1.31(s,6H),1.22(d,J＝4.7Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.67,133.92,128.49,128.39,126.60,63.16,62.62,49.72,44.03,16.04,14.90.LC-MS(ESI+)m/z 457.2(MNa+).
实施例15
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-phenyl-oxiran-2-yl)methanone)(c-4)
(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-4为目标产物。[α]D 25.0＝+61.053(c:2.850,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.27(m,10H),4.45(brs,2H),4.16(overlap,4H),3.05(brs,1H),2.53(brs,1H),1.48–1.06(m,12H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ169.61,134.21,128.55,128.42,128.30,126.74,126.66,63.40,62.50,50.28,43.90,15.55,15.12.LC-MS(ESI+)m/z 457.2(MNa+).
实施例16
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-(2-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(c-5)
(2S,3R)-2-methyl-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-5为目标产物。[α]D 24.8＝+132.961(c:0.895,chloroform).1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.23–8.13(m,2H),7.74–7.65(m,2H),7.64–7.57(m,2H),7.57–7.48(m,2H),4.67(d,J＝13.0Hz,2H),4.60(s,1H),4.55–4.42(m,2H),4.40–4.26(m,1H),4.24–4.09(m,1H),3.26–2.97(m,2H),1.32–1.14(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.51,147.98,133.99,131.12,129.74,129.46,125.17,63.89,63.64,61.56,61.25,44.25,15.69.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例17
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-(2-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(c-6)
(2S,3R)-2-methyl-3-(2-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-6为目标产物。[α]D 24.9＝-100.00(c:0.910,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25–8.15(m,2H),7.74–7.66(m,2H),7.65–7.58(m,2H),7.57–7.49(m,2H),4.76–4.59(m,2H),4.58–4.41(m,2H),4.34(s,1H),4.26–4.11(m,1H),3.29–2.93(m,2H),1.31–1.17(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.60,148.00,134.00,131.14,129.76,129.47,129.41,125.19,63.66,61.58,50.57,44.10,15.68.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例18
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-2-methyl-3-(3-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(c-7)
(2S,3R)-2-methyl-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-7为目标产物。[α]D 25.1＝+115.951(c:1.630,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24–8.11(m,4H),7.69(d,J＝7.6Hz,2H),7.62–7.51(m,2H),4.46(brs,2H),4.28(overlap,4H),3.30–3.01(m,2H),1.41–1.10(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.71,148.28,148.24,136.37,136.21,132.68,132.58,129.49,129.42,123.27,123.20,121.50,63.56,61.62,49.81,43.81,15.05,14.85.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例19
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-(3-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(c-8)
(2R,3S)-2-methyl-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-8为目标产物。[α]D 24.9＝+121.481(c:1.350,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24–8.14(m,4H),7.70(d,J＝7.7Hz,2H),7.56(t,J＝7.9Hz,2H),4.46(brs,2H),4.22(overlap,4H),3.07(s,1H),2.55(s,1H),1.44–1.10(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.66,147.90,141.60,127.66,123.63,63.85,61.68,50.33,43.78,15.38,15.07.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例20
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-2-methyl-3-(3-nitro-phenyl)oxiran-2-yl)methanone)(c-9)
(2R,3S)-2-methyl-3-(3-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到c-9为目标产物。[α]D 24.7＝-101.82(c:1.100,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.26(d,J＝8.7Hz,4H),7.54(d,J＝8.6Hz,4H),4.31(d,J＝8.9Hz,2H),4.03(dd,J＝21.0,9.8Hz,2H),3.85–3.67(m,4H),3.61(d,J＝10.0Hz,1H),3.32(d,J＝9.8Hz,1H),1.31(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.77,148.34,136.26,132.64,129.55,123.33,121.55,63.56,61.69,49.88,43.89,15.90,14.92.LC-MS(ESI+)m/z 547.2(MNa+).
实施例21
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-3-(4-nitrophenyl)-oxiran-2-yl)methanone)(r-1)
(2S,3R)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到r-1为目标产物。[α]D 24.1＝+200.000(c:0.410,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝6.9Hz,4H),7.57–7.42(m,4H),4.71–4.43(m,2H),4.38–4.14(m,3H),4.05(dd,J＝14.3,6.1Hz,1H),3.72–3.46(m,2H),3.30–2.95(m,1H),2.86–2.58(m,1H),1.25–1.09(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.93,148.50,142.83,126.79,124.30,57.32,50.07,44.05,41.15,18.93.LC-MS(ESI+)m/z 519.2(MNa+).
实施例22
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2S,3R)-3-(4-nitrophenyl)-oxiran-2-yl)methanone)(r-2)
(2S,3R)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到r-2为目标产物。[α]D 24.2＝-3.125(c:0.320,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(d,J＝8.0Hz,4H),7.50(s,4H),4.48(brs,2H),4.36–3.98(m,4H),3.67–3.43(m,2H),3.13(s,1H),2.67(s,1H),1.50–1.08(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.87,148.23,142.94,126.81,124.05,56.94,50.56,49.62,43.85,41.27,15.64.LC-MS(ESI+)m/z 519.2(MNa+).
实施例23
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-3-(4-nitrophenyl)-oxi-ran-2-yl)methanone)(r-3)
(2R,3S)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到r-3为目标产物。[α]D 24.3＝-196.67(c:0.300,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28–8.12(m,4H),7.55–7.43(m,4H),4.65(dd,J＝13.7,6.3Hz,1H),4.51(s,1H),4.40–4.15(m,3H),4.05(dd,J＝14.4,6.2Hz,1H),3.70–3.53(m,2H),3.28–3.08(m,1H),2.86–2.67(m,1H),1.26–1.07(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.92,148.44,142.85,126.79,124.26,56.87,50.31,44.03,41.12,18.91.LC-MS(ESI+)m/z 519.2(MNa+).
实施例24
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(((2R,3S)-3-(4-nitrophenyl)-oxi-ran-2-yl)methanone)(r-4)
(2R,3S)-3-(4-nitrophenyl)oxirane-2-carboxylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到r-4为目标产物。[α]D 24.3＝-6.061(c:0.330,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝7.7Hz,4H),7.50(s,4H),4.53(brs,J＝55.4Hz,2H),4.36–3.94(m,4H),3.67–3.41(m,2H),3.12(s,1H),2.67(s,1H),1.26(d,J＝42.6Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.90,148.41,142.98,126.85,124.20,56.95,49.66,43.86,41.38,15.73.LC-MS(ESI+)m/z 519.2(MNa+).
实施例25
(2E,2'E)-1,1'-((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one)(s-1)
(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-1为目标产物。[α]D 24.4＝+170.000(c:0.200,chloroform)1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.27–8.18(m,4H),7.51–7.42(m,4H),6.57(s,2H),4.50–4.29(m,2H),4.18–4.00(m,2H),3.10–2.88(m,2H),2.14(d,J＝1.6Hz,6H),1.24(d,J＝6.2Hz,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ172.85,147.14,142.38,137.10,129.99,127.82,124.01,50.02,16.72,16.64.LC-MS(ESI+)m/z 515.2(MNa+).
实施例26
(2E,2'E)-1,1'-((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one)(s-2)
(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-2为目标产物。[α]D 24.5＝-200.00(c:0.330,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(d,J＝8.6Hz,4H),7.47(d,J＝8.7Hz,4H),6.57(s,2H),4.49–4.32(m,2H),4.17–3.99(m,2H),3.12–2.88(m,2H),2.14(d,J＝1.5Hz,6H),1.24(d,J＝6.2Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.83,147.15,142.39,137.11,129.99,127.82,124.01,50.01,16.72,16.64.LC-MS(ESI+)m/z 515.2(MNa+).
实施例27
1,1'-((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(3-(4-nitrophenyl)propan-1-one)(s-3)
3-(4-nitrophenyl)propanoic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-3为目标产物。[α]D 24.8＝+117.647(c:0.340,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.6Hz,4H),7.36(d,J＝8.4Hz,4H),4.57(s,1H),4.35(s,1H),3.91(s,1H),3.75–3.55(m,1H),3.16–2.86(m,5H),2.72–2.43(m,5H),1.10(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.23,149.27,146.77,129.57,123.97,49.34,44.65,34.76,31.01,15.95.LC-MS(ESI+)m/z 491.2(MNa+).
实施例28
1,1'-((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis(3-(4-nitrophenyl)propan-1-one)(s-4)
3-(4-nitrophenyl)propanoic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-4为目标产物。[α]D 24.6＝-152.94(c:0.340,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.4Hz,4H),7.35(d,J＝8.3Hz,4H),4.55(s,1H),4.35(s,1H),3.85(s,1H),3.74–3.55(m,1H),3.16–2.89(m,5H),2.73–2.43(m,5H),1.10(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.20,149.26,146.79,129.57,123.98,53.70,49.34,34.76,31.03,15.99.LC-MS(ESI+)m/z 491.2(MNa+).
实施例29
((2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis((4-nitrophenyl)methanone)(s-5)
4-nitrobenzoic acid做为中间体VI,(2S,5S)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-5为目标产物。[α]D 25.2＝+248.485(c:0.660,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36–8.28(m,4H),7.63–7.55(m,4H),4.43(s,2H),3.74(s,2H),3.21–2.96(m,2H),1.20(d,J＝6.2Hz,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ169.33,148.92,141.92,128.01,124.45,50.22,16.38.LC-MS(ESI+)m/z 435.1(MNa+).
实施例30
((2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine-1,4-diyl)bis((4-nitrophenyl)methanone)(s-6)
4-nitrobenzoic acid做为中间体VI,(2R,5R)-2,5-dimethylpiperazine做为中间体X,实施过程同XI。此实施例得到s-6为目标产物。[α]D 25.3＝-263.08(c:0.650,chloroform).1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝8.7Hz,4H),7.59(d,J＝8.6Hz,4H),4.43(s,2H),3.76(s,2H),3.22–2.97(m,2H),1.20(d,J＝6.2Hz,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ169.33,148.92,141.92,128.01,124.45,50.19,16.37.LC-MS(ESI+)m/z 435.1(MNa+).
实施例31
单体类化合物(Ⅻ)的制备：
Figure BDA0002320599150000221
在50mL反应瓶中，将100mg(0.45mmol)(2S,3R)-2-methyl-3-phenyloxirane-2-carboxylic acid(Ⅵ)与46mg(0.36mmol)N-(2-Hydroxyethyl)piperazine(ⅩⅢ)溶于2mLDMF中，随后，依次加入52mg(0.27mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、73mg(0.27mmol)1-羟基苯并三唑、0.1mL(0.54mmol)三乙胺，室温搅拌16h。经TLC检测反应完全，水洗，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋干，经硅胶柱层析纯化(V/V DCM:MeOH＝30：1)得淡黄色色固体75mg,收率80％.
(4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl)((2S,3R)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)-oxiran-2-yl)methanone(d-1):[α]D 24.9＝-22.120(c:1.085,chloroform)1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.24(d,J＝8.7Hz,2H),7.52(d,J＝8.5Hz,2H),4.27(s,1H),3.85–3.74(m,1H),3.72–3.55(m,5H),2.65–2.54(m,5H),2.41(s,1H),1.28(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.03,148.09,141.78,127.75,123.84,63.95,61.93,59.62,58.12,53.43,52.74,45.63,42.22,15.23.LC-MS(ESI+)m/z 358.1(MNa+).
实施例32
化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞保护作用
取对数期细胞进行消化、离心、重悬、计数后，按照5×10^5个/mL的密度接种于96孔板中培养过夜，分为空白对照组、LPS诱导损伤组(0.5μg/L组)、LPS(0.5μg/L)+(1、2、4)μmol/L化合物ab-1、LPS+(1、2、4)μmol/L化合物b-1、LPS+(1、2、4)μmol/L化合物r-1组，培养24h后，先于显微镜下观察细胞形态并采集。细胞形态见图1，空白细胞圆润，折光性良好，细胞体积较小，较少的细胞伪足。LPS刺激后细胞形态变差，死细胞较多，胞体变大，细胞较多伪足。经过化合物ab-1处理后细胞形态改善，伪足减少。
实施例33
本发明化合物抗LPS诱导的RAW264.7细胞炎症作用机制
试验方法：
(1)对细胞毒性的影响
RAW264.7细胞培养于DMEM完全培养基(10％FBS，100μg/mL Penicillin G+100μg/mL Streptomycin)，5％CO2，37℃培养箱常规培养。取对数生长期的细胞，细胞计数(1×105个/mL)并种植于96孔培养板，培养24h。用不同浓度的样品孵育细胞24h，随后按照说明书的步骤进行MTT检测，酶标仪570nm下检测OD值，计算抑制率和IC50。除c-5、a-1、a-2、r-2、r-4外，大多数化合物对MTT法测定的细胞活力无影响。
表1.对RAW264.7存活率的影响
Figure BDA0002320599150000231
(2)对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型分泌一氧化氮、细胞因子IL-1β、IL-10的影响
取对数生长期的RAW264.7、BV2和C6细胞消化后，按照5×10^5个/mL的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为空白对照组，LPS组，LPS+化合物处理组(2.5、5、10、20、40μM终浓度)。LPS组和LPS+化合物处理组加药后，空白和LPS组加入等体积溶媒，除了空白组以外采用LPS 0.5μg/mL分别刺激RAW264.7细胞。孵育24h后，收集上清，用Griess法测定一氧化氮的产生，结果见表2。用ELISA法检测上清液IL-1β，IL-10的含量。收集细胞。结果见图2,本发明化合物具有下调促炎炎症介质一氧化氮，IL-1β，上调抗炎介质IL-10作用。
表2.对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞分泌一氧化氮的影响
Figure BDA0002320599150000241
实施例34
Western blot法测定诱导型一氧化氮合酶(iNOs)和COX-2蛋白表达
(1)制样：RAW264.7细胞接种于6孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜后用LPS(0.5μg/mL)刺激24h，同时用4,2,1μM的化合物ab-1、b-1、r-1作用24h，之后用PBS洗细胞2次，使用索莱宝高效RIPA裂解液300μL于冰上裂解10min,收集样品，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，涡旋混匀后于95℃水浴中变性10min，冷却后置于-20℃待测。
(2)制胶：用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。
(3)上样：将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。
(4)转印：电泳结束后，剥离凝胶，将0.45μM PVDF膜于甲醇中活化5min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的PVDF膜上。
(5)封闭：待转印结束，将PVDF膜置于5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温封闭1.5h。用TBST缓冲液洗膜3次，各10min。
(6)一抗孵育：将PVDF膜置于适当比例稀释的相应一抗中，于4℃孵育过夜。
(7)二抗孵育：用TBST缓冲液洗膜3次，各10min。加入适当比例稀释的HRP标记的IgG二抗，室温摇床孵育1.5h。
(8)化学发光：抗体孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗膜3次，各10min。加入ECL化学发光液，采用天能多功能成像仪化学发光模块成像，结果见图3。
结果见图3,本发明化合物具有下调促炎炎症介质iNOs,COX-2,p-NF-κB作用。
实施例35
荧光定量PCR检测COX-2mRNA的表达
(1)RNA抽提
引物序列(Primer Premier 5.0软件设计)
Figure BDA0002320599150000251
采用TRNzol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
把组织放入已预冷的研钵中进行研磨,待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管,加入等体积的-20℃预冷异丙醇,充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀,加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
(2)RNA质量检测
紫外吸收测定法检测浓度和纯度
使用
Figure BDA0002320599150000261
ND-2000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零，操作方法如下：
①滴加1Μl DEPC水或者RNA样品至测量基座的表面。
②液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件。
③一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量。
④浓度测定
260nm处读值为1表示40ng RNA/ul。样品RNA浓度计算公式为：A260 X 40ng/ul。具体计算如下：
RNA溶于20μl DEPC水中，取1ul用于测定，测得A260＝65.003：
RNA浓度＝65.003 X 40ng/ul＝2600.12ng/ul
取1ul用来测量以后，剩余样品RNA为19μl，剩余RNA总量为：19μl X 2600.12ng/ul＝49.4μg
纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些普通实验中如Northern杂交，RT-PCR和RNA酶保护实验。
(3)变性琼脂糖凝胶电泳
A、制胶
0.8g琼脂糖溶于80mL1×TAE中，冷却至60℃，加入Goldview核酸预染液，600ml的1×TAE电泳缓冲液。
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
B、准备RNA样品
取5μl RNA，加1倍体积的loading buffer。
C、电泳
上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
D、紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
取5μLRNA，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图4。
表3样本RNA浓度
Figure BDA0002320599150000271
(4)反转录
1.实验试剂
第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit)(RR0474)
2.cDNA第一链合成(注：(1)中rna反转录依据浓度浓度定量为一致2微克，并不是5微升，水加入量依据rna加入量不同而变化)
a)在0.2-ml PCR管中加入以下试剂：
5L total RNA
1L gDNA Er做为er
2L 5X gDNA Er做为er Buffer
2L Rn做为e-free ddH2O
b)42℃温浴2min,4℃。
c)离心加入下列试剂：
1.0L PrimeScript RT Enzyme Mix I
4.0L 5X PrimeScript Buffer 2
4.0L RT Primer Mix
20.0L Rn做为e-free ddH2O
20.0L Total volume
d)37℃温浴15min。
e)85℃温浴5s。
f)4℃温浴10min。
g)将上述溶液-20℃保存。
(5)荧光定量PCR检测
a).实验样本
将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。
b).实时定量PCR试验材料及仪器
定量PCR试剂：TaKaRa TB Green Premix Ex Taq II(2X)
定量PCR仪：ABI 7500型荧光定量PCR仪
c).PCR反应步骤
i.配制反应混合液
Figure BDA0002320599150000291
Total
20μl
Figure BDA0002320599150000292
iii.仪器的操作
完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在ABI 7500型荧光定量PCR仪中进行反应。
(6)相对定量结果
实时定量PCR时各样品加样量均为2μL，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用内参(不同样品间表达量基本恒定)作为校正。根据RealTimePCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，即
Figure BDA0002320599150000293
计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异，结果见图4，本发明化合物具有下调mCOX-2作用。
实施例36
对NF-κB核转运的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，消化后，按照5×105个/mL的密度接种于玻片上，待细胞贴壁后，分为空白对照组，LPS组，LPS+化合物处理组。LPS+化合物处理组加2μM终浓度的化合物，空白组加入相应给药量体积的DMSO，轻轻混匀后，除空白组以外，其余各组均加入0.5μg/mL LPS处理，作用24h。弃去培养液，PBS洗涤3次，采用碧云天NF-κB核转运试剂盒进行检测，严格按按照说明书进行操作。激光共聚焦显微镜下拍照。
结果见图5。相同激光强度下观察，与空白组相比较，LPS刺激细胞后，磷酸化的NF-κB向细胞核转移，化合物ab-1、b-1、r-1处理后，可以显著降低NF-κB的核转运水平。
实施例37
化合物ab-1对LPS诱导的C57小鼠脓毒血症的影响
LPS小鼠脓毒症模型小鼠(n＝10DMSO对照组和n＝9或10化合物ab-1(50mg/kg)处理的C57BL/6J 8周龄雌鼠)注入LPS(35mg/kg)(O127:B8,Sigma)。LPS和ab-1均采用腹腔注射给药，LPS用无菌生理盐水溶解适量浓度，化合物ab-1采用1.5％豆磷脂混悬，并在LPS注射前30min给药完成。造模结束后观察48h，记录各组动物死亡时间。生存曲线采用GraphPadPrism(GraphPad Software Inc.)中的log-rank(Mantel-Cox)检验进行分析。实验结果见图6，与模型组比较，经过50mg/kg的ab-1治疗后，脓毒血症小鼠中位死亡时间推迟10.5h，死亡率降低10％。
实施例38
大鼠角叉菜胶足肿胀模型抗炎作用的测定
动物处理：
在本实验中使用体重为180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠，使这些动物在标准实验条件下自由进食和进食市售的啮齿动物饮食。将室温维持在20～23℃并使房间照明为12/12h光暗循环。在进行研究前，使动物在所述实验室环境中适应5-7天。
试验操作：
每只大鼠称重，做好标记，按照体重随机分组。大鼠每组9只，角叉菜胶致炎剂浓度为1.2％。分为空白组(注射生理盐水+腹腔注射生理盐水)，模型组(注射角叉菜胶+腹腔注射生理盐水)、实验组(注射角叉菜胶+腹腔注射测试化合物50mg/kg)。检验方差齐性是否大于0.05。分笼饲养一晚，禁食不禁水。
分别对各组用圆珠笔在大鼠踝关节周围作一标记，先测定给药前每只大鼠右侧的后足足容积，重复3次，保证SD<10％。测量者需为同一人，或约定同种方式测量。测量者应不知分组情况。
按照顺序进行腹腔注射给药。1小时后开始按照编号顺序注射致炎物质和生理盐水，记录精确时间。记录每只灌胃时间。
一人按顺序致炎，他人配合按压针孔1min记录注射后的时间。在致炎后用足跖体积测量仪测量3小时，7小时、9小时测量大鼠右脚体积，与致炎之前体积对比，求出肿胀度。肿胀度＝致炎后右脚体积–致炎前右脚体积统计学分析：
以致炎后足容积减去前足容积测出肿胀度％，将组数据表示为均值±SEM并认为p<0.05表示有显著差异。可以通过不成对Student t检验来进行组间比较(两组间)或是单因素方差分析，Bonferroni’多重比较检验进行统计分析，与模型组对比，分析给药组是否产生作用，结果用平均值±SEM表示。
实验结果：
当用这种方法进行试验时，本发明的某些化合物可以表现出降低水肿的作用。如图7所示。
实施例39
对C6细胞激活的影响
神经炎症主要与小胶质细胞和星状胶质细胞的激活有关。用LPS刺激C6大鼠星状胶质细胞引起炎症反应，。除了星形胶质细胞具有独特的形态以外，可以通过它们表达的中间丝胶质纤维酸性蛋白(胶质纤维酸性蛋白(GFAP))来鉴别，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的骨架蛋白，被公认为星形胶质细胞的特征性标记物。星形胶质细胞被激活后，开始出现胶质增生，并且胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达增加，胶质增生是各种CNS疾病包括多发性硬化和阿尔兹海默症的病理学标志。通过免疫荧光标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的方法，可以评价化合物抗神经炎症的作用。
取对数生长期的C6消化后，按照5×10^5个/mL的密度接种于玻片上，待细胞贴壁后，分为空白对照组，LPS刺激组，LPS(10000ng/mL)刺激+化合物处理组。孵育24h后，在玻片上加入50μL预冷的4％多聚甲醛，室温固定10min；用封闭液(含1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS溶液)室温封闭1h；同时滴加用封闭液(1％BSA和0.3％Triton X-100)稀释的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(1:500)避光4℃过夜；PBS洗3次，每次5min；玻片上同时加入二抗，1：200(1％BSA和0.3％Triton X-100)，避光室温孵育2h；加含2μg/mL的DAPI抗淬灭封片剂用盖玻片封片，避光室温作用5min；激光共聚焦显微镜下用同一荧光强度观察并记录，发现给药组红色荧光明显弱于LPS刺激组，说明该类化合物具有抗神经炎症的作用，实验结果如图8。
上述体外实验结果表明：所制备的化合物能显著降低脂多糖诱导的促炎因子(IL-1β、COX-2)、一氧化氮等的过量释放，可显著降低GFAP的表达，升高IL-10水平。具有抗中枢和外周炎症活性。同时，体内实验结果表明：所制备的化合物能够延长脓毒血症小鼠生存时间，降低死亡率。抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀，具有抗炎作用。
实施例40
对iBMDM细胞焦亡的影响
PI测定是在加入LPS(1ug/mL)的细胞后4小时进行。细胞被洗之后在磷酸盐(PBS)和培养基底盐溶液含有PI(1ug/mL)(分子探针)120mM NaCl,4mM KCl,1.5mM CaCl2,1mMMgCl2,25mM Hepes,5mM glucose,and 0.1％(BSA)at pH 7.4。在37℃条件下，用多模微板阅读器(分子器件)在533/617nm(激发/发射)下对细胞进行刺激和动态读取。使用1％的Triton X-100获得最大的荧光。根据各孔的背景和最大荧光计算相对PI摄取，计算为相对PI摄取＝(样本值-背景)/(最大值-背景)，同时，记录荧光图像。

Claims (9)

1.一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于哌嗪类化合物结构式为：
Figure QLYQS_1
。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物与盐酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、甲磺酸、延胡索酸、枸橼酸、苯磺酸或对甲苯磺酸中的一种或一种以上的混合物形成盐。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物其抗炎作用表现为下调诱导型一氧化氮合酶、COX-2、IL-1β和COX-2 mRNA和蛋白的表达，升高IL-10的表达。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物可以抑制免疫细胞的焦亡。
5.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物可以抑制NF-κB的核转位。
6.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述药物用于脓毒血症、骨关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、系统性红斑狼疮性脑炎、痛风、银屑病、炎症性肠病、三叉神经疼痛、帕金森、脑卒中、脑外伤、高脂血症、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、全身型幼年特发性关节炎、心脑血管疾病、高脂血症、疼痛、糖尿病、神经炎症、肿瘤免疫疗法。
7.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物可以预防和治疗脓毒血症。
8.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述哌嗪类化合物具有镇痛作用。
9.根据权利要求1所述的一种具有抗毒、抗炎、抗氧化作用的哌嗪类化合物在制备药物中的应用，其特征在于：所述药物的剂型包括滴丸剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、片剂、巴布剂、软膏剂、凝胶剂、透皮控释贴剂、气雾剂、喷雾剂、脂质体。
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