CN109580788B - 拆分和测定氟比洛芬酯及s-氟比洛芬酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及拆分和测定氟比洛芬酯及S‑氟比洛芬酯的方法，特别是涉及一种使用HPLC法进行拆分和测定氟比洛芬酯及S‑氟比洛芬酯的方法。该方法针对氟比洛芬酯及S‑氟比洛芬酯的各种产品采用淀粉柱进行拆分分离分析，并且呈现如本发明说明书所述优异的色谱学效果。

Description

拆分和测定氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种拆分及测定氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的方法，特别是涉及一种使用HPLC法进行拆分和测定氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的方法。

背景技术

氟比洛芬酯为氟比洛芬的前体药物。用于手术后及各种癌症的镇痛。氟比洛芬酯注射液是一种非甾体类靶向镇痛药，通过在脊髓和外周抑制环氧化酶(COX)减少前列腺素的合成，降低手术创伤引起的痛觉过敏状态。

氟比洛芬酯原1992年由日本科研製薬株式会社开发，为无色至微黄色透明油状物，略臭，味苦，和甲醇、乙醇、乙腈或丙酮混溶，不溶于水。为前体药物，氟比洛芬酯注射液商品名凯纷

国内生产厂家为北京泰德制药，为白色乳液，略带粘性，有特异性气味。处方：氟比洛芬酯50mg；大豆油500mg；卵磷脂60mg；甘油110.5mg；氢氧化钠(pH调节剂)。本品是以脂微球为药物载体的非甾体类镇痛剂。药物进入体内靶向分布到创伤及肿瘤部位后，氟比洛芬酯从脂微球中释放出来，在羧基酯酶作用下迅速水解生成氟比洛芬，通过氟比洛芬抑制前列腺素的合成而发挥镇痛作用。脂微球制剂药效更强，起效更迅速，持续时间更长，且不易引起胃黏膜损伤等不良反应。其用于术后镇痛，优点在于没有中枢抑制作用，不影响处于麻醉状态患者的苏醒，可在术后立即使用。

手性药物氟比洛芬(flurbiprofen)属于芳基丙酸类非甾体抗炎药，为选择性COX-1和COX-2抑制剂。其化学结构见下图。目前临床上应用的是其消旋体，研究发现，氟比洛芬酯的活性来源主要是其S-(+)-对映体，而R-(-)对映体缺乏显著的环氧酶抑制活性，此外消旋体的胃肠毒副作用由于R-(-)对映体的存在而增加。因此理论而言，与消旋的氟比洛芬酯相比较，S-(+)-对映体用消旋体的半量就可以达到相同的治疗效果，而且可以降低由于使用消旋体中的R-(-)对映体带来的毒副反应。

氟比洛芬酯注射乳剂是国内泰德制药的独家品种，近10年的平均增长率高达178.0％，虽然2014年后的增速开始下降，但仍高于行业水平，氟比洛芬酯2014年的样本医院销售额达4.2亿元，是国内销量最高的非甾体抗炎药。据米内网报道，2015年的凯纷销售额高达10.24亿人民币，较2014年增长24％。

氟比洛芬和氟比洛芬酯的化学结构式如下：

氟比洛芬(Flurbiprofen)的CAS为5104-49-4，其分子式C15H13FO2，分子量244.26；性质：S-和R-构型外消旋体，白色结晶粉末，微刺激臭并有刺激味；溶解性：不溶于水，易溶于DMSO(50mg/ml)，甲醇(50mg/ml)，乙醇(～100mg/ml)，DMF(～100mg/ml)，缓冲盐(≥0.1M and pH≥7.4)(～5mg/ml)。

氟比洛芬酯(Flurbiprofen Axetil)，其CAS为91503-79-6，分子式C19H19FO4，分子量330.36；性质：无色至微黄色透明油状物，略臭，味苦，和甲醇、乙醇、乙腈或丙酮混溶，不溶于水；溶解性：水中溶解度为1.363mg/L(25℃)。

鉴于氟比洛芬酯结构中存在两个手性碳，如上述化学结构式中所示的，C1和C2两个手性碳，其存在四种异构体。据信C1位为S构型的异构体，即人们通常所说的S-氟比洛芬酯是有效的，文献(Brune et al.,1991；Wechter,Bigornia,Murray,Levine,&Young,1993)报道S(+)-氟比洛芬和R(-)-氟比洛芬表现为不同抗炎镇痛活性，S(+)-氟比洛芬具有抗炎及镇痛作用，而R(-)-氟比洛芬无COX抑制活性，无抗炎和镇痛作用，同时也不会引起胃肠道溃疡。连续30天给予不同氟比洛芬(S(+),R(-)和消旋体)，R异构体未表现胃肠道溃疡，等剂量的消旋体与S异构体相比，消旋体产生溃疡是S异构体的2～4倍。因此人们一直尝试采用S-氟比洛芬特别是S-氟比洛芬酯来代替其消旋体应用于临床。

氟比洛芬对映异构体手性拆分研究已有文献综述(邢志华，氟比洛芬对映异构体手性拆分研究进展，黑龙江医药，2012，25(4)，530-532)。

另外，CN 105777544 A(中国专利申请号201610229238.0，成都倍特)公开了一种高光学纯度S-(+)-氟比洛芬酯的制备方法，包括以下步骤：(1)在碱与有机溶剂存在下，使S-(+)-氟比洛芬与1-取代乙酸乙酯反应，反应温度为0-25℃，反应时间为3-15小时；(2)将所述反应的产物萃取、洗涤，并分离出油状物；(3)将所述油状物进行柱层析纯化；(4)通过溶剂共蒸发的方法除去有机溶残，然后真空干燥得目标产物。据信该发明避开无机碱，从与有机溶剂互溶性高的有机碱出发进行研究，选择合适的溶剂配比，保证了反应的进行，在制备过程中没有发现常见的消旋与产品分解现象；发明制备的S-(+)-氟比洛芬酯总收率可达80％以上，光学纯度大于99％。

然而，如上文所述，制备得到的S-(+)-氟比洛芬酯(人们通常还简写为S-氟比洛芬酯或S氟比洛芬酯)理论上存在C1位为R构型且C2为SR构型的两种异构体杂质，并且C1位为S构型的目的物质同样的在C2倍存在S和R两种构型。对这些产物进行定量分析仍然是本领域技术人员迫切需要解决的，特别是通过分析色谱来拆分及测定氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的方法仍然是本领域技术人员迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过分析色谱来拆分及测定氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的方法，以期对氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的各种产品进行有效的色谱分离分析。已经出人意料的发现，通过采用本发明方法能够有效的对氟比洛芬酯及S-氟比洛芬酯的各种产品进行色谱分离分析。

在本发明中，提及氟比洛芬酯时，如未另外说明，是指上文所述C1和C2两个手性碳原子处均为消旋体的物质；提及S-氟比洛芬酯或类似表述时，如未另外说明，是指上文所述C1处为S构型的物质；提及R-氟比洛芬酯或类似表述时，如未另外说明，是指上文所述C1处为R构型的物质。

为此，本发明提供了使用高效液相色谱法对氟比洛芬酯或S-氟比洛芬酯进行拆分和测定的方法，该方法包括如下操作：

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01～2mg/ml的供试品溶液；(例如，精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品10mg，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；)

吸取供试品溶液0.2～5ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(例如取1ml置100ml量瓶中制成的浓度相当于供试品溶液的1％)；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀制成浓度为0.01～2mg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液；

[上述这些配液的浓度通常是不作特别要求的，因为浓度大小通常不会影响色谱分析的可靠性和准确性等性能]

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：0.6～1.0的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速0.5～1.5ml/min；柱温20～30℃；检测波长200～300nm；

取系统适用性试验溶液5～20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各5～20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

根据本发明的方法，其中在“(1)配液”中所用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：0.8～1.2所配制的混合液。

根据本发明的方法，其中在“(1)配液”中所用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：0.9～1.1所配制的混合液。

根据本发明的方法，其中在“(1)配液”中所用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：1所配制的混合液。

根据本发明的方法，其中所述色谱柱中的填充剂的粒径为5um。

根据本发明的方法，其中所述色谱柱的内径为4.6mm。

根据本发明的方法，其中所述色谱柱的长度为150～300mm。

根据本发明的方法，其中所述流动相为体积比100：0.7～0.9的正己烷-异丙醇的混合液。

根据本发明的方法，其中所述流动相为体积比100：0.8的正己烷-异丙醇的混合液。

根据本发明的方法，其中所述流动相的流速为0.75～1.25ml/min。

根据本发明的方法，其中所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min。

根据本发明的方法，其中所述流动相的流速为1ml/min。

根据本发明的方法，其中所述柱温为22～28℃。

根据本发明的方法，其中所述柱温为25℃。

根据本发明的方法，其中所述检测波长为220～280nm。

根据本发明的方法，其中所述检测波长为240～260nm。

根据本发明的方法，其中所述检测波长为247nm。

根据本发明的方法，其中第一色谱峰的保留时间在15～25min范围内，特别是在15～20min范围内。

根据本发明的方法，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于1.5、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0。

根据本发明的方法，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于5.0。

本发明已经出人意料的发现，当测试溶液所用的配液混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：0.8～1.2所配制的混合液，且流动相是以体积比100：0.6～1.0的正己烷-异丙醇的混合液时，能够使四种异构体色谱峰达到令人满意的分离度的效果，特别是前三个异构体色谱峰相邻二者之间的分离度均大于1.0，特别是均大于1.5，完全能够满足一般对于异构体分离的分离度要求。一般来说，本领域技术人员通常使用与流动相相同的溶液制备测试溶液，以避免出现溶剂峰而影响测定效果；并且一般来说，配液用的溶剂通常只是影响较早出现的溶剂峰区域，因为，例如本发明所用的配液用两种溶剂它们通常会在给1～3分钟区间出峰，从而呈现流动相本体变化的典型溶剂峰区域，配液用溶剂不会影响后续的洗脱过程，特别是不会影响在本发明条件下四个异构体出峰时间通常在15分钟以后的区域。

在本发明实施例1-5中，第一色谱峰的保留时间均在15～20min范围内；第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度均大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度均大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度均大于5.0；各相邻异构体峰的分度均大于1.5，各异构体峰信噪比均大于15，各异构体峰拖尾因子T值均在0.97～1.03之间，重复性测定中各异构体峰的相对标准偏差均小于0.7％。

但是对于流动相和样品配液用的混合溶剂的使用却有着严格的限制，特别是二者不能使用相同的混合液，这一结论通过参照实施例1但是改变流动相或样品配液用混合溶剂的组成比例得以证实。例如，对于流动相，异丙醇占正己烷比小于1.5％特别是要小于1.2％，当大于1.2％或等于1.2％(即正己烷和异丙醇以体积比100：1.2的混合液)时各异构体峰拖尾因子T值均大于1.25并且异丙醇占比越大T值越大(虽然上述其余各色谱性质参数结果与实施例1-5基本相同，例如三组分离度分别大于2.0、大于1.5、大于5.0)。又例如，对于样品配液用的混合溶剂，正己烷和异丙醇体积比9：0.8～1.2范围是可行的，但是异丙醇占比大于此范围(即异丙醇大于1.2)或小于此范围(即异丙醇小于0.8例如趋向于与流动相比例相同的方向)时均会造三组分离度显著减小，并且不论是向大的范围还是向小的范围越偏离上述范围则分离度越小。特别是当异丙醇占比小于此范围(即异丙醇小于0.8)时第二色谱峰和第三色谱峰二者合并到第一色谱峰中从而导致前三个色谱峰分离不开；而当异丙醇占比大于此范围(即异丙醇大于1.2)时不但第二色谱峰和第三色谱峰二者合并到第一色谱峰中从而导致前三个色谱峰分离不开，而且第四色谱峰会显著前移并与前三个色谱峰之间的分离度小于2。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：氟比洛芬酯的HPLC色谱图，图中各峰顶的数值表示该峰的保留时间，例如图1第一色谱峰顶的数值18.563表示该峰的保留时间为18.563min，图2相关数值亦有类似含义。

图2：S-氟比洛芬酯的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的制备实例和试验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些例子仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

一、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的提供

氟比洛芬酯，为市售的原料药(国家食品药品监督管理总局批准生产的产品)。

S-氟比洛芬酯采用CN 105777544 A之[0064]方法制备得到。

上述氟比洛芬酯中包含S-氟比洛芬酯的两个C2异构体和R-氟比洛芬酯的两个C2异构体共四个异构体，上述S-氟比洛芬酯中主要包含S-氟比洛芬酯的两个C2异构体以及极其微量的作为杂质的R-氟比洛芬酯的两个C2异构体。另外还对氟比洛芬酯进行精制以得到在下分HPLC拆分测定中可能用到的氟比洛芬酯消旋体对照品。上述氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯以及氟比洛芬酯消旋体对照品作为测试样品进行下文测试。

二、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

实施例1、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品10mg，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

吸取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(其浓度相当于供试品溶液的1％)；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品10mg，置100ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含0.1mg的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：0.8的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长247nm；

取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

结果：氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC测定结果分别呈现于图1和图2两个色谱图，由图中可见，第一色谱峰的保留时间约18.6，第二色谱峰的保留时间约20.1，第三色谱峰的保留时间约21.4，第四色谱峰的保留时间约26.6。另外，经计算，第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.4、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.8、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于6.7。图2中的S-氟比洛芬酯显示仅存在少量的两个R异构体，主要是两个S异构体。图2中四个异构体相邻两峰之间的分离度与图1基本相同。在下面实施例2-5中四个异构体相邻两峰之间的分离度亦与图1基本相同。

一般来说，对于异构体的分析测定，分离度大于0.8即可满足要求，本发明方法的分离度至少在1.5以上；特别是，根据本发明的方法，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于5.0。

本实施例中，使用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：1所配制的混合液；本实施例中，使用的色谱柱中的填充剂的粒径为5um，内径为4.6mm，色谱柱的长度为250mm。

实施例2、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(0.01mg/ml)；

吸取供试品溶液0.2ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液相同浓度的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：0.6的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速1.5ml/min；柱温20℃；检测波长200nm；

取系统适用性试验溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

结果：第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于5.0。

本实施例中，使用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：0.8所配制的混合液；本实施例中，使用的色谱柱中的填充剂的粒径为5um，内径为4.6mm，色谱柱的长度为300mm。

实施例3、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(2mg/ml)；

吸取供试品溶液5ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液相同浓度的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：1.0的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速0.5ml/min；柱温30℃；检测波长300nm；

取系统适用性试验溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

结果：第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于5.0。

本实施例中，使用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：1.2所配制的混合液；本实施例中，使用的色谱柱中的填充剂的粒径为5um，内径为4.6mm，色谱柱的长度为200mm。

实施例4、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(0.5mg/ml)；

吸取供试品溶液2ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液相同浓度的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：0.9的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速1.25ml/min；柱温25℃；检测波长254nm；

取系统适用性试验溶液15μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

结果：第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于5.0。

本实施例中，使用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：0.9所配制的混合液；本实施例中，使用的色谱柱中的填充剂的粒径为5um，内径为4.6mm，色谱柱的长度为150mm。

实施例5、氟比洛芬酯和S-氟比洛芬酯的HPLC拆分和测定

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(1.2mg/ml)；

吸取供试品溶液1.5ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置10ml量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成与供试品溶液相同浓度的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；以体积比100：0.8的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速1.0ml/min；柱温25℃；检测波长247nm；

取系统适用性试验溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体(即S-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体(即R-氟比洛芬酯在其C2位置的两个异构体)；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

结果：第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于2.0、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度大于5.0。

本实施例中，使用的混合溶剂是正己烷和异丙醇以体积比9：1.1所配制的混合液；本实施例中，使用的色谱柱中的填充剂的粒径为5um，内径为4.6mm，色谱柱的长度为200mm。

在以上各实施例1-5中，第一色谱峰的保留时间在15～20min范围内。以上实施例1-5中，对于四个异构体峰而言，均能满足一般的HPLC色谱测定要求，特别是例如能够满足2015年版四部第0512节高效液相色谱法的各项指标要求，例如各相邻异构体峰的分度均大于1.5，各异构体峰信噪比均大于15，各异构体峰拖尾因子T值均在0.97～1.03之间，重复性测定中各异构体峰的相对标准偏差均小于0.7％。

本发明方法可以用于氟比洛芬酯和/或S-氟比洛芬酯的各种制品例如其粗品、精制品、药用原料药等物料中各异构体的定性定量分析。

Claims (10)

1.使用高效液相色谱法对氟比洛芬酯或S-氟比洛分酯进行拆分和测定的方法，该方法包括如下操作：

(1)配液：

精密称取氟比洛芬酯供试品或S-氟比洛芬酯供试品适量，置量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01～2mg/ml的供试品溶液；

吸取供试品溶液0.2～5ml置100ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

另精密称取氟比洛芬酯消旋体对照品适量，置量瓶中，加混合溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀制成浓度为0.01～2mg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液；

(2)色谱条件与系统适用性试验：

用淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱：内径为4.6mm，填充剂的粒径为5μm，长度150mm～300mm；以体积比100：0.6～1.0的正己烷-异丙醇的混合液为流动相；流速0.5～1.5ml/min；柱温20～30℃；检测波长200～300nm；

取系统适用性试验溶液5～20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，依次洗脱出峰面积基本上相等的四个色谱峰，根据出峰先后依次称为第一色谱峰、第二色谱峰、第三色谱峰、第四色谱峰，其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度应大于1.2、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.2、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0，其中第一色谱峰和第四色谱峰为S-氟比洛芬酯的两种异构体，第二色谱峰和第三色谱峰为R-氟比洛芬酯的两种异构体；第一色谱峰的理论塔板数应不小于2000；

(3)测定：

分别精密量取供试品溶液和对照溶液各5～20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，读取该供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图中各异构体色谱峰的峰面积，根据峰面积计算供试品中单个或多个异构体相对于其它异构体或全部异构体总和的百分含量。

2.根据权利要求1的方法，其中在步骤1中所用混合溶剂的异丙醇和正己烷混合比例是9：0.8～1.2。

3.根据权利要求1的方法，其中所述色谱柱的长度为200mm。

4.根据权利要求1的方法，其中所述色谱柱的长度为250～300mm。

5.根据权利要求1的方法，其中所述色谱柱的长度为300mm。

6.根据权利要求1的方法，其中所述流动相为体积比100：0.8～1.0的正己烷-异丙醇的混合液。

7.根据权利要求1的方法，其中所述流动相的流速范围为0.5～1.25ml/min。

8.根据权利要求1的方法，其中所述柱温范围为25～30℃。

9.根据权利要求1的方法，其中所述检测波长为220～300nm。

10.根据权利要求1的方法，其中第一色谱峰的保留时间在15～20min范围内；其中第一色谱峰与第二色谱峰之间的分离度大于1.5、第二色谱峰与第三色谱峰之间的分离度应大于1.5、第三色谱峰与第四色谱峰之间的分离度应大于3.0。

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