CN117761200A - 一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法 - Google Patents
一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种氟比洛芬酯和氟比洛芬酯异构体的检测方法，选择包含正己烷、异丙醇、乙醇、甲醇中的3种或4种流动相混合作为流动相进行等度洗脱，检测方法的灵敏度高、专属性好，各峰之间的分离度好，对研究的各个氟比洛芬酯异构体峰均能有效分离，能满足任意构型氟比洛芬酯、氟比洛芬产品的异构体检测需求。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种对不同构型氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体进行分离定量的方法。
背景技术
氟比洛芬酯(Flurbiprofen axetil)，化学名称为2-氟-Α-甲基-(1,1'-联苯)-4-乙酸1-(乙酰氧基)乙基酯，其分子式为C19H19FO4，分子量为330.36，其结构式如下：
氟比洛芬酯是氟比洛芬的前体药物，用于手术后及各种癌症的镇痛。氟比洛芬酯注射液是一种非甾体类靶向镇痛药，通过在脊髓和外周抑制环氧化酶(COX)减少前列腺素的合成，降低手术创伤引起的痛觉过敏状态。脂微球制剂药效更强，起效更迅速，持续时间更长，且不易引起胃黏膜损伤等不良反应。其用于术后镇痛，优点在于没有中枢抑制作用，不影响处于麻醉状态患者的苏醒，可在术后立即使用。
研究发现，氟比洛芬酯的活性来源主要是其S构型的氟比洛芬酯(亦叫艾氟洛芬酯)，此外消旋体的胃肠毒副作用由于R构型氟比洛芬酯的存在而增加。因此理论而言，与消旋的氟比洛芬酯相比较，半量的S构型氟比洛芬酯就可以达到相同的治疗效果，而且可以降低由于使用消旋体中的R构型氟比洛芬酯带来的毒副反应。
CN 113834882A中国专利中，虽然也可以检测不同构型氟比洛芬酯异构体，但是其出峰顺序为：氟比洛芬酯R构型的第一个峰、氟比洛芬酯S构型的第一个峰、氟比洛芬酯R构型的第二个峰、氟比洛芬酯S构型的第二个峰，由于R构型与S构型的峰为交叉出现，任意两峰之间的分离度均需符合要求方可满足氟比洛芬酯R构型与S构型之间的检测，造成实际检测应用过程中的方法耐用性较差，易受到流动相或色谱条件的常规波动的影响。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种同时检测不同构型氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，检测方法灵敏度高、专属性好，各峰之间的分离度好，对研究的各异构体峰均能有效分离，能满足任意构型氟比洛芬酯和氟比洛芬产品检测的需求。
本发明的技术方案如下：
一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其检测方法采用高效液相色谱法，色谱条件为：
色谱柱：直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；
检测波长：220-260nm；
柱温：20-40℃；
流速：0.8～1.2ml/min；
流动相：正己烷、异丙醇和乙醇的混合溶液；
洗脱方式为等度洗脱。
本发明所述的流动相选自正己烷、异丙醇和乙醇的混合溶液，在某些实施例中所述的流动相为正己烷-异丙醇-乙醇，其体积比为97：1：2；在另一些实施例中所述的流动相的混合溶液中还包括甲醇，更具体的为正己烷：异丙醇：甲醇：乙醇的混合溶液，在一些实施例中，正己烷：异丙醇：甲醇：乙醇的体积比为(96～98)：(0.5～1)：0.5：(1～2)；优选其体积比96.5：1：0.5：2。
本发明所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法中，对照品和供试品配制为0.1～1.0mg/ml；配制所用的溶液为流动相。
在一些实例中，本发明所述的色谱柱选择CHIRALPAK AD-H的分离效果更佳，优选的色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。
本发明所使用的流速为0.8～1.2ml/min，在某些实施例中所使用的流速为1.0ml/min。
对于本发明而言，柱温选择20-40℃，具体柱温可以但不局限于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，为了获得更好的分离效果，优选柱温为25-35℃，更优选为30℃。
本发明所使用的检测波长为220-260nm，优选为254nm。
本发明所使用的进样量为1-20μl，可以但不局限于5μl、10μl、15μl、20μl，优选为5μl。
采用本发明的技术方案，优势如下：
(1)本发明所述的氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，依次洗脱出6个色谱峰：氟比洛芬酯R构型的第一个峰、氟比洛芬酯S构型的第一个峰、氟比洛芬酯S构型的第二个峰、氟比洛芬酯R构型的第二个峰、氟比洛芬R构型峰、氟比洛芬S构型峰，其中氟比洛芬酯S构型的两个峰相邻，检测时可以无需要求氟比洛芬酯S构型两个峰的分离度，只需要求其与R构型的色谱峰分开即可，使得分析方法的耐用性更强，流动相或色谱条件的常规波动均不影响各异构体的分离和检测。
(2)在常规质量研究工作中，常需关注氟比洛芬酯或氟比洛芬中的不同异构体，本发明所述的的方法可以将二者的异构体进行很好的分离和检测，各峰的出峰顺序依次为：氟比洛芬酯R构型的第一个峰、氟比洛芬酯S构型的第一个峰、氟比洛芬酯S构型的第二个峰、氟比洛芬酯R构型的第二个峰、氟比洛芬R构型峰、氟比洛芬S构型峰，上述各异构体均可有效分离，适用性更广。
(3)采用本发明的流动相和特定的洗脱过程，溶剂易得，在其他条件的配合下，检测效率高，各个异构体峰灵敏度高，专属性好，耐用性强，并且能快速、有效、准确的监控不同构型氟比洛芬酯或氟比洛芬的含量，各峰之间的分离度均不小于1.5；各峰的理论板数不小于5000，各峰之间的分离度好，对研究的各个氟比洛芬异构体峰均能有效分离，能满足任意构型氟比洛芬酯产品的异构体检测需求。
附图说明
图1实施例1对照品溶液HPLC色谱图；
图2实施例1的R构型-氟比洛芬酯供试品溶液HPLC色谱图；
图3实施例1的S构型-氟比洛芬酯供试品溶液HPLC色谱图；
图4实施例1的R构型-氟比洛芬供试品溶液HPLC色谱图；
图5实施例1的S构型-氟比洛芬供试品溶液HPLC色谱图；
图6实施例2对照品溶液HPLC色谱图；
图7实施例2的S构型-氟比洛芬酯供试品溶液HPLC色谱图；
图8对比例1对照品溶液HPLC色谱图；
图9对比例2对照品溶液HPLC色谱图；
图10对比例3对照品溶液HPLC色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
若无特别说明，以下实施例中所用到的仪器、试剂和溶液如下：
1、仪器及设备
| 设备名称 | 型号或规格 | 厂家 |
| 液相色谱仪 | Agilent1100 | Agilent |
| 分析天平 | SQP | Sartoris |
| 色谱柱 | CHIRALPAK AD-H 4.6*250mm,5μm | DAICEL |
2、试剂及对照品
| 名称 | 级别 | 厂家 |
| 正己烷 | HPLC | CINC |
| 异丙醇 | HPLC | CINC |
| 乙醇 | HPLC | TEDIA |
| 甲醇 | HPLC | Adamas-beta |
| 氟比洛芬酯 | 对照品 | 中国食品药品检定研究院 |
| 氟比洛芬 | 对照品 | 中国食品药品检定研究院 |
3、对照品溶液配制：分别取氟比洛芬酯外消旋对照品、氟比洛芬外消旋对照品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并混匀。
4、S构型(或R构型)氟比洛芬酯供试品溶液配制：因单一构型的样品无法通过市售获得，故发明人按照本领域常规方法合成S构型(或R构型)的氟比洛芬(参照文献专利号：WO2015/145163 A1)，最终获得单一S构型氟比洛芬酯(即艾氟洛芬酯)和单一R构型氟比洛芬酯；取S构型(或R构型)-氟比洛芬酯供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
5、S构型(或R构型)氟比洛芬供试品溶液配制：因单一构型的样品无法通过市售获得，故发明人按照现有技术常规方法合成S构型(或R构型)的氟比洛芬(参照文献专利号：WO2015/145163 A1)，最终获得单一S构型氟比洛芬和单一R构型氟比洛芬，分别取S构型(或R构型)-氟比洛芬供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
实施例1：
(1)溶液配制：
对照品溶液：分别取氟比洛芬酯对照品、氟比洛芬对照品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并定量稀释制成每1ml含氟比洛芬酯0.1mg、氟比洛芬0.2mg的溶液。
S构型-氟比洛芬酯供试品溶液：取S构型-氟比洛芬酯供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
R构型-氟比洛芬酯供试品溶液：取R构型-氟比洛芬酯供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
S构型-氟比洛芬供试品溶液：取S构型-氟比洛芬供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
R构型-氟比洛芬供试品溶液：取R构型-氟比洛芬供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
(2)色谱条件与系统适用性
色谱柱：CHIRALPAK AD-H 4.6*250mm，5μm
流动相：正己烷：异丙醇：乙醇＝97：1：2
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：254nm
精密量取上述对照品溶液、各供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据供试品比对可知，对照品的出峰顺序依次为R构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、R构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、R构型-氟比洛芬的色谱峰、S构型-氟比洛芬的色谱峰。
(3)结果
氟比洛芬酯四种构型、氟比洛芬两种构型的HPLC测定结果呈现于图1～图5色谱图，由图1可见，第一色谱峰的保留时间为9.129min，第二色谱峰的保留时间为10.846min，第三色谱峰的保留时间为11.645min，第四色谱峰的保留时间为12.955min，第五色谱峰的保留时间为17.103min，第六色谱峰的保留时间为25.585min。经计算，S构型-氟比洛芬酯的色谱峰与R构型氟比洛芬酯峰之间的最小分离度为3.09，能够很好的分离消旋体中的R构型氟比洛芬酯，且不易受常规波动的影响，使得分析方法的耐用性更强；两个S构型-氟比洛芬酯色谱峰之间的分离度为2.03。
实施例2：
(1)溶液配制：
对照品溶液：分别取氟比洛芬酯对照品、氟比洛芬对照品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并定量稀释制成每1ml约含氟比洛芬酯0.1、氟比洛芬0.2mg的溶液。
供试品溶液：取艾氟洛芬酯供试品适量，精密称定，加适量流动相使溶解并配制成每1ml约含1mg的溶液。
(2)色谱条件与系统适用性
色谱柱：CHIRALPAK AD-H 4.6*250mm，5μm
流动相：正己烷：异丙醇：甲醇：乙醇＝96.5：1：0.5：2
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：254nm
精密量取对照品溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，经检测，出峰顺序依次为R构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、R构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、R构型-氟比洛芬的色谱峰、S构型-氟比洛芬的色谱峰，经分析，本实施例流动相的微调并不影响出峰顺序，与实施例1的出峰顺序一致。
(3)结果
氟比洛芬酯四种构型、氟比洛芬两种构型的HPLC测定结果呈现于图6、图7色谱图，由图6可见，第一色谱峰的保留时间为9.377min，第二色谱峰的保留时间为11.116min，第三色谱峰的保留时间为11.961min，第四色谱峰的保留时间为13.350min，第五色谱峰的保留时间为17.867min，第六色谱峰的保留时间为26.707min。经计算，S构型-氟比洛芬酯的色谱峰与R构型氟比洛芬酯峰之间的最小分离度为3.76，能够很好的分离消旋体中的R构型氟比洛芬酯，且不易受常规波动的影响，使得分析方法的耐用性更强；两个S构型-氟比洛芬酯色谱峰之间的分离度为2.51。
对比例1：
(1)溶液配制：
取氟比洛芬酯对照品适量，精密称定，加溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含1mg的溶液。
(2)色谱条件与系统适用性
色谱柱：CHIRALPAK AD-H 4.6mm*250mm，5μm
流动相：正己烷：异丙醇：乙醇＝98：1：1
流速：1.0ml
柱温：30℃
检测波长：254nm
精密量取对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为R构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟洛芬酯的色谱峰2，R构型-氟比洛芬酯的色谱峰2。
(3)结果
氟比洛芬酯四种构型的HPLC测定结果呈现于图8色谱图，由图可见，第一个色谱峰的保留时间为10.459min，第二个色谱峰的保留时间为10.917min，第三个色谱峰的保留时间为15.665min，第四个色谱峰的保留时间为19.008min。各峰面积百分比例(从左到右)分别为24.244％、25.799％、24.397％、25.560％，R构型-氟比洛芬酯的第一个色谱峰与S构型--氟洛芬酯的第一个色谱峰未能基线分离，不利于不同构型氟比洛芬酯的分离。
对比例2：
(1)溶液配制：
取氟比洛芬酯对照品适量，精密称定，加溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含1mg的溶液。
(2)色谱条件与系统适用性
色谱柱：CHIRALPAK AD-H 4.6*250mm，5μm。
流动相：正己烷：异丙醇：甲醇：乙醇＝96：1：1：2
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：254nm
精密量取对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为R构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟洛芬酯的色谱峰2，R构型-氟比洛芬酯的色谱峰2。
(3)结果
氟比洛芬酯四种构型的HPLC测定结果呈现于图9色谱图，由图可见，第一个色谱峰的保留时间为7.161min，第二个色谱峰的保留时间为9.058min，第三个色谱峰的保留时间为9.242min，第四个色谱峰的保留时间为10.080min。各峰面积百分比(从左到右)分别为24.507％、22.968％、26.913％、25.613％。S构型-氟洛芬酯的2个色谱峰未能基线分离，不利于不同构型S构型-氟洛芬酯样品之间的分离。
对比例3
(1)溶液配制：
分别取氟比洛芬酯对照品、氟比洛芬对照品适量，精密称定，加溶剂适量使溶解并定量稀释制成每1ml约含氟比洛芬酯0.2、氟比洛芬0.5mg的溶液。
(2)色谱条件与系统适用性
色谱柱：CHIRALPAK AD-H 4.6mm*250mm，5μm
流动相：正己烷：异丙醇＝90：10
流速：1.0ml
柱温：30℃
检测波长：254nm
精密量取对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为R构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰1、S构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、R构型-氟比洛芬的色谱峰、R构型-氟比洛芬酯的色谱峰2、S构型-氟比洛芬的色谱峰。
(3)结果
氟比洛芬酯四种构型、氟比洛芬两种构型的HPLC测定结果呈现于图10色谱图，由图可见，第一色谱峰的保留时间为5.543min，第二色谱峰的保留时间为5.652min，第三色谱峰的保留时间为6.003min，第四色谱峰的保留时间为6.255min，第五色谱峰的保留时间为6.733min，第六色谱峰的保留时间为8.175min。经计算，S构型-氟洛芬酯的色谱峰与R构型氟比洛芬酯峰之间的最小分离度为0.32，两个S构型-氟洛芬酯色谱峰之间的分离度为1.41，氟比洛芬酯与氟比洛芬峰之间的最小分离度为1.13。由图9可知，氟比洛芬酯异构体未能有效分离，且受氟比洛芬异构体的干扰较明显，不利于氟比洛芬酯与氟比洛芬之间的分离检测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：采用直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂的色谱柱；采用正己烷、异丙醇和乙醇的混合溶液作为流动相。
2.根据权利要求1所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，流动相中正己烷：异丙醇：乙醇的体积比为97：1：2。
3.根据权利要求1所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，流动相的混合溶液中还包括甲醇，为正己烷、异丙醇、甲醇和乙醇的混合溶液，优选的正己烷：异丙醇：甲醇：乙醇的体积比为(96～98)：(0.5～1)：(0～0.5)：
(1～2)；优选为96.5：1：0.5：2。
4.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，色谱柱为CHIRALPAK AD-H，优选的色谱柱的的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm；优选的洗脱方式为等度洗脱。
5.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为20～40℃，优选为25-35℃，更优选为30℃。
6.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测波长为220-260nm，优选为254nm。
7.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.5～1.5ml/min，优选为0.8～1.2ml/min，更优选为1.0ml/min。
8.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，进样量为1-20μl，优选为5μl-10μl，更优选为5μl。
9.根据权利要求1～3任一项所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，对照品和供试品配制为0.1～1.0mg/ml的溶液。
10.权利要求9所述的同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法，其特征在于，对照品和供试品配制所用的溶剂为流动相。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311805757.3A CN117761200A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN117761200A true CN117761200A (zh) | 2024-03-26 |
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| CN202311805757.3A Pending CN117761200A (zh) | 2023-12-26 | 2023-12-26 | 一种同时检测氟比洛芬酯异构体和氟比洛芬异构体的检测方法 |
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2023
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