CN109576296A - 鸭瘟病毒us1基因无痕缺失病毒株及其构建方法 - Google Patents

鸭瘟病毒us1基因无痕缺失病毒株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法。本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组分别缺失鸭瘟病毒US1单、双拷贝基因，首次完成了该基因的无痕缺失病毒株构建，并探究了该基因对病毒复制的影响。本发明技术方案为准确探究鸭瘟病毒US1基因功能奠定了基础，以期对鸭瘟病毒分子生物学研究提供参考。

Description

鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种鸭瘟病毒US1基因单、双拷贝无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1及其构建方法。
背景技术
细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)是基于大肠杆菌(E.coli)F因子构建的质粒载体。F因子又称F质粒，是一种“性质粒”，能将宿主染色体基因转移至另一宿主细胞，天然F因子是超螺旋闭环DNA分子，大小约100kb，编码约100个蛋白质。BAC可容纳100～300kb大小外源插入片段，并能稳定遗传，克隆至BAC载体的基因组在传代中不会出现在酵母人工染色体(YAC)载体中那样易发生缺失、重组和嵌合现象，并且可以在E.coli中进行人工遗传操作，方便又安全。
鸭瘟(Duck plague)是由鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)又名鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起，可感染鸭、鹅和天鹅等其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性和致死性的传染病。鸭瘟于1957年首次在我国被报道，并迅速流行，迄今为止，给养鸭业带来巨大经济损失。
鸭瘟病毒属于疱疹病毒科成员，其全基因组大小约为160kb，其由一个独特长区(unique long,UL)、一个独特短区(unique short，US)和两段反向重复序列(IRS and TRS)组成。DPV基因组与其他α-疱疹病毒相似，由UL区和US区组成，中间有IR区相隔，两端有TR区相连，即UL-IRS-US-TRS。
在其他疱疹病毒中DPV US1编码的ICP22蛋白同源物已有大量报道。以HSV-1为例，ICP22是一个广泛的翻译后修饰蛋白，是病毒最重要的即刻早期蛋白之一，在病毒复制和转录调控过程中起重要作用，是决定病毒是否进入潜伏感染或裂解感染的关键蛋白。VZV中同源物OFF63也是该病毒有效建立潜伏期的关键因素。因此，HSV-1ICP22和VZV ORF63在感染过程中所起的重要作用，提示DPV ICP22在感染过程中可能起着类似的作用。目前尚不清楚DPV ICP22在DPV生命周期中的真正生物学功能，对这些方面的研究必须等待进一步研究其在病毒复制中的作用。拟通过构建鸭瘟病毒US1基因缺失株来为鸭瘟病毒分子生物学研究提供参考。因此，如何构建鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株是目前主要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法，本发明利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan-S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组分别缺失鸭瘟病毒US1单、双拷贝基因，首次完成了该基因的无痕缺失病毒株构建。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种鸭瘟病毒US1单拷贝基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：
(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；
(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；
(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；
(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1；
(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1中提取pBAC-DPV-ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。
进一步地，步骤(2)中引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’。
进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNAPolymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
进一步地，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。
一种鸭瘟病毒US1双拷贝基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：
(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；
(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；
(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；
(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1，然后制备GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态；
(5)以pEPkan-S为模板，以1808F、1808R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_sceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上下游各40bp的内部同源打靶片段1808，切胶回收获得1808片段；
(6)将1808片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态中，经筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana；
(7)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1；
(8)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1中提取pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-2ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1。
进一步地，步骤(2)中引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’；
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
进一步地，步骤(5)中引物序列为：
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1808R:5’-TTAACTCTTGGGGCGTTTTGTGGTACCCGCGAGTGCGCTCACGCACGCTTGACCGCTTGGCCGTCGCGATGCCGTCGCCATttaaccaattctgattag-3’；
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
进一步地，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’；
步骤(6)中鉴定时所用引物序列为：
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。
本发明提供的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法，具有以下有益效果：
本发明在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的基础上，利用Red/ET修饰技术，即利用含有可编码Red操纵子和I_sceI酶基因序列的GS1783大肠杆菌菌株及含有编码卡纳抗性及I_sceI酶切位点的质粒pEPkan-S，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组分别缺失鸭瘟病毒US1单、双拷贝基因，首次完成了鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株的构建，并研究了其对病毒复制的影响。为进一步探究鸭瘟病毒US1基因功能及转录调控机制的研究提供了充分的技术支持。
附图说明
图1为pEPkan-S质粒图谱。
图2为利用Red/ET修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上进行基因缺失的操作流程图(以第一个US1基因缺失为例)。
图3为质粒pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1酶切鉴定(A)及软件模拟图(B)。
图4为CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1无痕缺失病毒株拯救图。
图5为pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1病毒基因组质粒PCR鉴定结果图。
图6为CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1无痕缺失病毒株间接免疫荧光鉴定结果。
图7为CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1无痕缺失病毒株western-blot鉴定结果。
图8为CHv-BAC-G、CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1多步生长曲线测定结果。
具体实施方式
鸭瘟病毒US1基因(DPV CHv US1基因序列见SEQ ID NO：10)无痕缺失病毒株的构建过程中所用材料及试剂如下：
1、实验材料
细胞、菌株、病毒毒株、质粒
原代鸭胚成纤维细胞由9-11日龄非免疫受精鸭胚按常规方法制备；GS1783菌株由四川农业大学实验室保存；pBAC-DPV质粒由四川农业大学实验室构建并保存；pEPkan-S质粒(其序列见SEQ ID NO：9)由四川农业大学实验室保存。
2、分子生物学试剂
质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司；QIAGENPlasmid Midi Kit购自QIAGEN公司；Max DNA Polymerase、MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0购自TaKaRa公司；Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；2×Taq PCR MasterMix购自vazyme公司；Goldview购自北京赛百盛基因技术有限公司；低熔点琼脂糖购自Biowest Agarose。
3、实验所用溶液及其配制
LB液体培养基：称取Nacl 5g、Tryptone 5g、Yeast Extract 2.5g溶于400mL去离子水中，充分搅拌，定容至500mL，高温高压灭菌。
LB固体培养基：在定容至500mL的LB液体培养基中加入6.5g琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入500μL氯霉素(储存浓度25mg/ml)或500μL卡那霉素(储存浓度50mg/mL)，铺制平板，待凝固后，4℃保存。
MEM：将13.4g DMEM干粉和7.6碳酸氢钠溶于800mL去离子水，充分搅拌，定容至lL，过滤除菌，4℃保存。
50×TAE：将24.2g Tris和3.7g EDTA溶于80mL去离子水中，充分搅拌后，加入5.7mL冰醋酸，充分混匀，定容至100mL，室温保存。
1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉溶于100mL 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μL Goldview，再倒入制胶模中，并在适当位置处插上梳子，待凝固后，放入电泳槽中进行电泳。
预冷灭菌超纯水：量取300mL ddH2O，高温高压灭菌后置于-80℃冰箱，待用时拿出解冻。
实施例1US1基因无痕缺失株GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1菌株的构建
通过Red/ET修饰技术在大肠杆菌GS1783上构建US1单拷贝基因无痕缺失株GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：
1、制备GS1783电转感受态，电转化pBAC-DPV质粒
(1)复苏带pBAC-DPV质粒的大肠杆菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；
(2)按照QIAGEN Plasmid Midi Kit操作说明提取pBAC-DPV质粒；
(3)复苏GS1783冻存菌于LB固体培养基中，30℃培养过夜；
(4)挑取GS1783单菌落接种于5mL LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；
(5)将5mL种子液加入100mL LB液体培养基中，30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；
(6)将步骤(5)所得菌液立即放入冰水混合物中冷却20min；
(7)取步骤(6)所得菌液，4℃、4500×g离心10min去上清；
(8)用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤(7)菌体沉淀；
(9)向步骤(8)所得菌体中加入超纯水将菌液定容至500μL，每管200μl分至预冷EP管，获得GS1783电转感受态；
(10)在200μL GS1783电转感受态中加入200ng pBAC-DPV质粒，混匀后将感受态和质粒一起加入2mm预冷的电击杯底部，2.5kV/cm条件下进行电击；
(11)取100μL LB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌1h后，4500×g离心菌体2min，弃上清，采用200μL LB液体培养基悬浮沉淀，涂布在含有氯霉素的LB固体培养基上，30℃培养24h，获得GS1783-pBAC-DPV菌株。
2、扩增I_sceI-Kana-US1打靶片段
(1)复苏带有pEPkan-S质粒的大肠杆菌于含有卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，采用质粒小提试剂盒提取pEPkan-S质粒(pEPkan-S质粒图谱见图1)；
(2)以pEPkan-S质粒为模板，1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，采用1％普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’(SEQ ID NO：1)；
1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’(SEQ ID NO：2)。
上述引物中，大写字母为同源臂序列，小写字母为模板配对序列。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL。
PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
利用Red/ET修饰技术在人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上进行基因缺失的操作流程图(以第一个US1基因缺失为例)见图2，具体过程包括如下的3和4两个过程。
3、制备GS1783-pBAC-DPV电转感受态进行目的片段打靶
(1)复苏GS1783-pBAC-DPV冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜；
(2)挑取GS1783-pBAC-DPV单菌落接种于5mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；
(3)将5mL种子液加入100mL含氯霉素的LB液体培养基中，置于30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；
(4)将步骤(3)所得菌液于42℃培养15min后立即放入冰水混合物中冷却20min；
(5)取50mL步骤(4)所得菌液，于4℃4500×g离心10min，去上清；
(6)用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤(5)菌体沉淀；
(7)向步骤(6)所得菌体中加入超纯水将菌液定容至600μL，每管200μL分装至预冷EP管，获得GS1783-pBAC-DPV电转感受态；
(8)在200μL电转感受态中加入200ng I_sceI-Kana-US1打靶片段，混匀后将感受态和打靶片段一起加入2mm预冷的电击杯底部，2.5kV/cm条件下进行电击；
(9)加入1mL LB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌3h后，于4500×g离心菌体2min，弃上清，200μL LB液体培养基悬浮沉淀，涂布于含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的LB固体培养基，于30℃培养48h；
(10)PCR鉴定步骤(9)所得单菌落，以步骤(9)中生长的单菌落重悬液为模板，利用扩增I_sceI-Kana-US1打靶片段上游引物1603F和鉴定US1基因下游引物1604R1鉴定阳性菌落，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’(SEQ ID NO：1)；
1604R1:5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’(SEQ ID NO：3)。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板为步骤(9)单菌落重悬液1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
4、去掉I_sceI-Kana片段
(1)挑取GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana单菌落接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；
(2)取10μL步骤(1)所得种子液接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养2h至菌液呈现轻微云雾状；
(3)向步骤(2)所得菌液中加入1mL含氯霉素的LB液体培养基和5M终浓度为2％的L-阿拉伯糖，30℃培养1h；
(4)将步骤(3)所得菌液立即放入42℃水浴中培养30min；
(5)将步骤(4)所得菌液置于30℃培养2h后，取1μL菌液加入200μL LB液体培养基中混匀后涂布到含有氯霉素的LB固体培养基，30℃培养24h～48h；
(6)挑取步骤(5)中所得单菌落在含氯霉素和卡纳霉素双抗性LB固体培养基和氯霉素单抗性LB固体培养基上进行平行筛选，将氯霉素和卡纳霉素双抗性LB固体培养基不生长，氯霉素单抗性LB固体培养基生长的菌落通过PCR方法利用US1基因鉴定引物鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1。
1604F:5’-TCATTGCTCAATACGGGAAG-3’(SEQ ID NO：4)；
1604R1:5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’(SEQ ID NO：3)。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板为步骤(6)单菌落重悬液1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
实施例2 US1基因无痕缺失株GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1菌株的构建
通过Red/ET修饰技术在大肠杆菌GS1783上构建US1双拷贝基因无痕缺失株CHv-BAC-G-2ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：
1、扩增I_sceI-Kana-US1打靶片段
(1)复苏带有pEPkan-S质粒的大肠杆菌于含有卡那霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜；挑单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，采用质粒小提试剂盒提取pEPkan-S质粒(pEPkan-S质粒图谱见图1)；
(2)以pEPkan-S质粒为模板，1808F、1808R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因内部上、下游各40bp同源臂的打靶片段1808，采用1％普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增片段；
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’(SEQ ID NO：5)；
1808R:5’-TTAACTCTTGGGGCGTTTTGTGGTACCCGCGAGTGCGCTCACGCACGCTTGACCGCTTGGCCGTCGCGATGCCGTCGCCATttaaccaattctgattag-3’(SEQ ID NO：6)。
上述引物中，大写字母为同源臂序列，小写字母为模板配对序列。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板为步骤(6)单菌落重悬液1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
2、制备GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1电转感受态进行目的片段打靶
(1)复苏GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜；
(2)挑取GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1单菌落接种于5mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；
(3)将5mL种子液加入100mL含氯霉素的LB液体培养基中，置于30℃摇至OD600值在0.5～0.7之间；
(4)将步骤(3)所得菌液于42℃培养15min后立即放入冰水混合物中冷却20min；
(5)取50mL步骤(4)所得菌液，于4℃4500×g离心10min，去上清；
(6)用预冷超纯水在冰上反复清洗步骤(5)菌体沉淀；
(7)向步骤(6)所得菌体中加入超纯水将菌液定容至600μL，每管200μL分装至预冷EP管，获得GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1电转感受态；
(8)在200μL电转感受态中加入200ng I_sceI-Kana-US1打靶片段，混匀后将感受态和打靶片段一起加入2mm预冷的电击杯底部，2.5kV/cm条件下进行电击；
(9)加入1mL LB液体培养基重悬电击后菌体，30℃摇菌3h后，于4500×g离心菌体2min，弃上清，200μL LB液体培养基悬浮沉淀，涂布于含有卡那霉素和氯霉素双抗生素抗性的LB固体培养基，于30℃培养48h；
(10)PCR鉴定步骤(9)所得单菌落，以步骤(9)中生长的单菌落重悬液为模板，利用扩增I_sceI-Kana-US1打靶片段上游引物1808F和鉴定US1基因下游引物1604R1鉴定阳性菌落，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana；
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’(SEQ ID NO：5)；
1604R1:5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’(SEQ ID NO：3)。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板为步骤(6)单菌落重悬液1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
3、去掉I_sceI-Kana片段
(1)挑取GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana单菌落接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜，获得种子液；
(2)取10μL步骤(1)所得种子液接种于2mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养2h至菌液呈现轻微云雾状；
(3)向步骤(2)所得菌液中加入1mL含氯霉素的LB液体培养基和5M终浓度为2％的L-阿拉伯糖，30℃培养1h；
(4)将步骤(3)所得菌液立即放入42℃水浴中培养30min；
(5)将步骤(4)所得菌液置于30℃培养2h后，取1μL菌液加入200μL LB液体培养基中混匀后涂布到含有氯霉素的LB固体培养基，30℃培养24h～48h；
(6)挑取步骤(5)中所得单菌落在含氯霉素和卡纳霉素双抗性LB固体培养基和氯霉素单抗性LB固体培养基上进行平行筛选，将氯霉素和卡纳霉素双抗性LB固体培养基不生长，氯霉素单抗性LB固体培养基生长的菌落通过PCR方法利用US1基因鉴定引物鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1。
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’(SEQ ID NO：5)；
1604R1:5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’(SEQ ID NO：3)。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板为步骤(6)单菌落重悬液1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
实施例3拯救CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1病毒
1、复苏GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1、GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1冻存菌于含有氯霉素的LB固体培养基中，30℃培养过夜。
2、按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书提取pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1质粒：
(1)挑取GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1、GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1单菌落接种于100mL含氯霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜；
(2)收获菌体：4℃，离心15min，离心力6000×g。
(3)用4mL Buffer P1重悬菌体(使用前将RNase A加入到Buffer P1)。
(4)加入4mL buffer P2，迅速翻转管4-6次，室温下(15-25℃)静置5min。
(5)加入4mL预冷的buffer P3，立即混匀并彻底用力翻转4-6次，冰上孵育15min。
(6)4℃下，离心30min，离心力≥20,000×g，迅速将含有质粒的上清转移到新的离心管。
(7)将上清置于4℃下，再次离心15min，离心力≥20,000×g，迅速将含有质粒的上清转移到新离心管。
(8)用4ml buffer QBT平衡柱子，在重力下使柱子排空。
(9)把步骤(7)中的上清加入到QIAGEN-tip，使其在重力下进入树脂。
(10)用2×10mL的Buffer QC洗脱QIAGEN-tip。
(11)用5mL Buffer QF洗脱DNA。
(12)加入3.5mL室温温度的异丙醇洗涤DNA，混合后立刻离心，4℃、30min、15000×g，离心完成后仔细移除上清。
(13)用25mL室温温度的70％无水乙醇洗DNA沉淀，离心10min，15000×g，离心完成后仔细移除上清，不要触碰底部沉淀。
(14)将步骤(13)所得物风干5～15min，并溶解到合适容积的灭菌超纯水中，获得DPV单、双拷贝US1基因缺失的阳性克隆质粒pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1。
3、转染鸭胚成纤维细胞(DEF)
制备鸭胚成纤维细胞(DEF)并接种于6孔板，37℃，5％CO2培养，按照Lipofectamine 3000操作说明转染pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1质粒。
4、观察荧光并传代
观察荧光斑，收集病毒，反复冻融2次后接种于长满DEF的6孔板；重复此步骤三次，获得DPV单、双拷贝US1基因缺失的病毒CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1(如图4)。
实施例4 pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1质粒及重组病毒CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1的鉴定
1、RFLP分析鉴定
用Qiagen Plasmid Midi Kit试剂盒抽提pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，各取1μg，分别用BamHⅠ和Xho I酶切1h；酶切产物全部上样，1％凝胶电泳30V、0.01A 16～17h；电泳完成后凝胶成像并分析，结果如图3所示。BamHⅠ(1-3)、XhoⅠ(5-7)单酶切模板依次为pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1。*表示酶切后的差异性条带。
其中，A为鉴定结果图，B为软件模拟图。
2、PCR分析鉴定
根据Qiagen Plasmid Midi Kit说明书提取pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，利用US1鉴定引物1604F和1604R1、UL48真核鉴定引物1611F和1611R，进行重组病毒基因组的鉴定，结果如图5所示。图5中样品1至4、5至8模板分别为pBAC-DPV、pBAC-DPV-ΔUS1、pBAC-DPV-2ΔUS1、ddH2O，引物分别为1604F、1604R1和1611F、1611R。结果显示重组病毒基因组中成功敲除单、双拷贝US1基因。
1604F:5’-TCATTGCTCAATACGGGAAG-3’(SEQ ID NO：4)；
1604R1:5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’(SEQ ID NO：3)；
1611F:5’-CTACCGGACTCAGATCTCGAGATAGGTGTGGGTGTGGAT-3’(SEQ ID NO：7)
1611R:5’-GTACCGTCGACTGCAGAATTCCATTATCTGGCGAGAACAACG-3’(SEQ ID NO：8)。
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
3、间接免疫荧光(IFA)分析鉴定
制备鸭胚成纤维细胞(DEF)并接种于6孔板，37℃，5％CO2培养，然后接毒CHv-BAC-G、CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1，24h后收样，用鼠抗US1蛋白通过间接免疫荧光分析鉴定两株无痕缺失病毒，具体为鼠抗US1抗体血清和山羊抗鼠IgG检测病毒感染情况下ICP22蛋白表达情况，细胞核以DAPI表示，ICP22蛋白以FITC表示，Merge为两者叠加(放大倍数：40×)，结果见图6。由图6可知，重组病毒CHv-BAC-G-ΔUS1中ICP22蛋白正常表达，CHv-BAC-G-2ΔUS1中无ICP22蛋白表达。
4、免疫印迹(western-blot)分析鉴定
制备鸭胚成纤维细胞(DEF)并接种于6孔板，37℃，5％CO2培养，然后接毒CHv-BAC-G、CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1，24h后收样，用鼠抗US1抗体血清和山羊抗鼠IgG检测病毒感染情况下ICP22蛋白表达情况，分析鉴定两株无痕缺失病毒，结果见图7。由图7可知，重组病毒CHv-BAC-G-ΔUS1中ICP22蛋白正常表达，CHv-BAC-G-2ΔUS1中无ICP22蛋白表达。
实施例5检测US1基因缺失后对病毒复制的影响
将亲本病毒CHv-BAC-G和US1基因两株无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1分别以0.01MOI接种DEF细胞，接毒12h、24h、48h、72h、96h、108h后分别收集上清液和细胞沉淀，每个时间点设立3个生物学重复。待收集完全后，反复冻融2次，于96孔板用TCID50，同时设3组技术性重复，生长曲线如图8所示，其中A为上清，B为细胞，*表示<0.0001。
三株病毒以低感染复数(0.01MOI)感染DEF细胞后，表现出了相似的增殖规律；在感染后的12h，无论是在细胞内还是在上清液中均未能检测到具有感染性的病毒粒子，说明在接毒量很少的情况下，绝大多数病毒吸附到细胞表面且进入了细胞内部，尚未组装出具有感染性的病毒粒子，这一结果与疱疹病毒16至20h的理论复制周期相符。
实验结果显示，US1缺失之后病毒产生了复制缺陷，缺失株病毒上清液滴度显著低于亲本株，在感染后48h和72h尤甚，说明US1基因缺失影响细胞中病毒的释放过程。缺失株病毒细胞滴度与亲本株相比也存在差异，说明US1基因缺失也可影响细胞中病毒对DEF的感染滴度。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caatatataa aaggctctcg tttacagaac tgcgatagac aggatgacga cgataagtag 60
gg 62
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggttaatac gcgcttgcag catatatcgc gacaggttta gtctatcgca gttctgtaaa 60
cgagagcctt ttatatattg ttaaccaatt ctgattag 98
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggtgttta ttgacatca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcattgctca atacgggaag 20
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcgacgg catcgcgacg gccaagcggt caagcgtgcg aggatgacga cgataagtag 60
gg 62
<210> 6
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttaactcttg gggcgttttg tggtacccgc gagtgcgctc acgcacgctt gaccgcttgg 60
ccgtcgcgat gccgtcgcca tttaaccaat tctgattag 99
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctaccggact cagatctcga gataggtgtg ggtgtggat 39
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaccgtcga ctgcagaatt ccattatctg gcgagaacaa cg 42
<210> 9
<211> 6288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacggatcgg gagatccgat tacaaggatg acgacgataa gtagggataa cagggtaatc 60
gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata 120
aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg 180
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 240
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 300
tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 360
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 420
ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg 480
cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata 540
ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc 600
cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt 660
tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga 720
aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct 780
cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag 840
tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt 900
ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata 960
aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt 1020
aacactggca ttaccctgtt atccctagat cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 1080
ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 1140
tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 1200
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 1260
ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 1320
gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 1380
ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 1440
catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 1500
tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 1560
ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 1620
cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc 1680
cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttggta 1740
ccgagctcgg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattctgcag atatccatca 1800
cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggccctatt ctatagtgtc acctaaatgc 1860
tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1920
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1980
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 2040
gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 2100
ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc 2160
ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 2220
tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 2280
cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg catcccttta gggttccgat ttagtgcttt 2340
acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 2400
ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 2460
gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 2520
tttggggatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 2580
ttaattctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccaggcagg 2640
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 2700
ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 2760
gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 2820
tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt 2880
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tcccgggagc 2940
ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 3000
acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 3060
ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 3120
gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 3180
ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 3240
tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 3300
gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 3360
gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 3420
agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 3480
ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga 3540
tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt 3600
ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 3660
ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 3720
ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 3780
cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca 3840
cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg 3900
gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc 3960
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 4020
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 4080
tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 4140
tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 4200
aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 4260
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 4320
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 4380
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 4440
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 4500
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 4560
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 4620
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 4680
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 4740
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 4800
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 4860
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4920
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 4980
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 5040
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 5100
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 5160
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5220
tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5280
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 5340
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5400
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5460
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5520
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5580
agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5640
atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 5700
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 5760
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5820
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5880
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5940
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 6000
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 6060
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 6120
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6180
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6240
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 6288
<210> 10
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggcgacgg catcgcgacg gccaagcggt caagcgtgcg aacaaactgt aacggtatcg 60
tatgttcaag gattgagtaa ttcaccgtct acatccaccg ctttgtggtc atcaccaccg 120
gcaactttga ccaaaccgtc tatagaatcg cctagaagac aattggatcc gcgcacggta 180
aagccgaggc aacaaatgtc gccggctgga ggagatggca tgtgggatct gcataagtcc 240
atcactgtag atcacaagga atacggacct cctgtaccgc cggacgaagc ccgcagtggt 300
atggatccca aaatgggacc cggcgcgttt tgtgcttcgc cgtggttacc cgacgcaact 360
cgactaggtg acgatgttaa cctcgtgttt aaagctataa tacgagcatc cggatcaact 420
gggcgttatt gccgggcctt tcggagaagt ttattggaat tttacctgat cgggcgctat 480
ggaccacgac tgccgcgcga gggctgggaa gctactttac aactatcccc caaccaaagt 540
ggaccgctcc gtgctgtatt gcgcgaggcg gacggacgta tagtgaacaa taccggctat 600
atggaagggc cgtttgggcc caccgaagcg ccgtatggag cagaatgtga ggtcgacggg 660
ggatgttatt ctgacgatga gcgatcggaa tgcgagtcag atctatcgga aggggacatg 720
aacttcgtgt tatcgtcaga tacggaaagc gagcgtggct acgattccga cgcgtcggta 780
cgtagcgtca catcaagcag ccatagtaat tgtgacgatg ttgactatga cccgctgggc 840
gaccttgatt cagaagagga gatgacctcg tcggtatcta cctccgactc tgaaagcgaa 900
gttatagagg ttatagggac caaacgcaaa cggccgacca cgaggagtat gagcgcactc 960
gcgggtacca caaaacgccc caagagttaa 990

Claims (10)

1.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；
(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；
(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；
(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1；
(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1中提取pBAC-DPV-ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’。
3.根据权利要求1或2所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNAPolymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
4.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。
5.采用权利要求1-4任一项所述的方法构建得到的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。
6.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；
(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；
(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；
(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1，然后制备GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态；
(5)以pEPkan-S为模板，以1808F、1808R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_sceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上下游各40bp的内部同源打靶片段1808，切胶回收获得1808片段；
(6)将1808片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态中，经筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana；
(7)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1；
(8)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1中提取pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-2ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1。
7.根据权利要求6所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’；
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
8.根据权利要求6所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(5)中引物序列为：
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1808R:5’-TTAACTCTTGGGGCGTTTTGTGGTACCCGCGAGTGCGCTCACGCACGCTTGACCGCTTGGCCGTCGCGATGCCGTCGCCATttaaccaattctgattag-3’；
PCR扩增体系为：ddH2O 7μL、Max DNA Polymerase 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。
9.根据权利要求6所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：
1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’；
步骤(6)中鉴定时所用引物序列为：
1808F:5’-ATGGCGACGGCATCGCGACGGCCAAGCGGTCAAGCGTGCGaggatgacgacgataagtaggg-3’；
1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。
10.采用权利要求6-9任一项所述的方法构建得到的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1。
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