CN109576265A - 一种新型的含mar核心片段的动物细胞表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体。所述重组表达载体的MAR核心片段，其核苷酸碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。本发明的表达载体可有效提高蛋白在哺乳动物细胞中的产量并降低生产成本。

Description

一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体

本申请是2014年4月1日提交的201410129979.2号发明专利申请“一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体。

背景技术

目前，很多用于生产重组蛋白的载体已被开发，重组蛋白在以细菌、真核微生物、昆虫细胞等为宿主的表达中能获得较高的产量，但这些表达系统缺少类似于哺乳动物细胞的蛋白质修饰机制(例如糖基化修饰等)，表达的动物蛋白易缺少生物活性或因折叠错误而产生包涵体。而以哺乳动物细胞表达系统来生产重组蛋白，其产量往往较低，而且导入基因的稳定性也会有一定的问题。后来人们发现，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是生产单克隆抗体等复杂大分子的最佳系统，利用CHO表达系统生产单克隆抗体，其产率有了很大的提高，但是筛选和维持高表达细胞株仍是件耗时耗力且结果不确定的工作。细胞转染后，融合基因通常随机整合入宿主细胞的基因组中，大多数的重组发生于“静默区”，例如非转录区。通常需要筛选上千个克隆才能得到几个产量尚可的细胞株。

核基质附着区(matrix attachment region，简称MAR)元件是一种能帮助产生并维持开放的染色质域的DNA序列。开放的染色质域能促进转录，表达及转基因的多拷贝整合。将MAR元件放入载体中能增加细胞株的产量及高产细胞株的比例(Kwaks TH,Otte AP2006 Trends Biotechnol 24:137–142)，但MAR元件较大(3kb以上)，而质粒转染细胞的效率随着质粒大小的增加而降低(Yin W et al Anal Biochem.2005Nov15；346(2):289-94)，从而限制了MAR元件在双亚基共表达载体中的应用。

因此，开发一种更为有效的哺乳动物细胞表达载体，一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以提高导入基因在哺乳动物细胞中表达的表达载体，所述表达载体两端含有人工转录因子结合位点的核基质附着区的MAR核心片段。该表达载体可有效提高蛋白在哺乳动物细胞中的产量并降低生产成本。

具体地，发明公开了：

1、一种分离的重组表达载体的MAR核心片段，其核苷酸碱基序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

2、一种重组表达载体，所述载体两端含有上述1所述的MAR核心片段。

3、上述2所述载体，其所述MAR核心片段插入在启动子的上游及聚腺苷酸化位点的下游。

4、上述3所述载体，所述启动子为CMV、SV40或EF-1a启动子。优选地，所述MAR核心片段插在载体上游FSPI位点,或SV40PA下游Afe I位点,或PEF-1a上游Nhe I位点,或BGH PA下游EcoRV位点。最优选上游FSPI位点及PEF-1a上游Nhe I位点。

5、上述2-4任一所述载体，所述载体为pBudCE4.1、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF或pCHO 1.0，或者上述载体的改造载体。

6、上述5所述载体，所述载体为pBudCE4.1改造的载体，所述载体核苷酸序列如SEQID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

7、上述2-6任一所述载体，其中所述载体包含一个或多个编码一种或多种重组蛋白的功能重组基因。

8、一种宿主细胞，其包含上述7所述的载体。

9、上述8所述的细胞，其为哺乳动物细胞，包括但不限于选自以下所述的组：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK 293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞、PerC6细胞和MDCK细胞。

10、一种制备重组蛋白的方法，所述方法包括转录和翻译存在于上述任一所述表达载体上的一个或多个编码所述重组蛋白的基因。

本发明的表达载体尤其适合应用于哺乳动物细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞CHO的表达。

本发明的两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段DNA序列可插入哺乳动物细胞表达载体，从而大大提高导入的哺乳动物基因在哺乳动物细胞中表达，且稳定性很好。

本发明提供了一种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段DNA序列.如本发明实例列举的，所述表达载体为改造的pBudCE4.1载体,所述改造的pBudCE4.1载体，在SV40聚腺苷酸化位点及BGH聚腺苷酸化位点下游分别插入Afe I和EcoR V限制酶切位点。用kanamycin抗性基因及DHFR基因替换pBudCE4.1中的Zeocin抗性基因。所述改造载体命名为pBCM1.1,pBCM1.2,pBCM1.3，其DNA序列分别为SEQ ID No.4，5，6所示。不含上述核基质结合区元件片段及人工转录因子结合位点DNA的改造载体命名为pBCM1.0,DNA序列如SEQ ID No 7所示。

本发明的两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段DNA序列可用常规的合成方法制备。

将本发明的两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的质粒与不含两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的质粒做比较。通过测定外源蛋白在上述两种质粒的表达量，结果表明，本发明的两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的质粒特别适用于CHO细胞，与不含两端加有人工转录因子结合位点的核基质结合区元件MAR核心片段的质粒相比，动物细胞中的外源蛋白的表达量获得大幅提高，表达量提高了10-17倍。高产细胞株的比例提高了25-40倍。

将外源蛋白(例如治疗性蛋白、抗体)的基因插入本发明的表达载体中，然后转染至哺乳动物细胞，可用于外源蛋白(例如治疗性蛋白、抗体)的生产。

附图说明

附图1含本发明MAR核心片段的表达载体与不含MAR基因或含MAR全长基因序列的表达载体平均GFP表达量对比图。

附图2含本发明MAR核心片段的表达载体与不含MAR基因或含MAR全长基因序列的表达载体的GFP平均高表达细胞株比例对比图。

附图3含本发明MAR核心片段的表达载体与不含MAR基因或含MAR全长基因序列的表达载体平均CAT表达量对比图。

附图4含本发明MAR核心片段的表达载体与不含MAR基因或含MAR全长基因序列的表达载体的CAT平均高表达细胞株比例对比图。

附图5 pBCM1.0质粒结构图。

具体实施方式

以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

本发明实施例所列举的表达载体，是由pBudCE4.1载体(购自：LifeTechnologies)改造获得：包括在SV40聚腺苷酸化位点及BGH聚腺苷酸化位点下游分别插入AfeI和EcoR V限制酶切位点；将卡那霉素抗性基因(Kanamycin Resistance Gene)，PGK启动子，二氢叶酸还原酶(DHFR)，及SV40PA从pCHO1.0(购自Life Technologies)中PCR出，并通过NheI和AfeI位点装入pBudCE4.1中，并同时去除Zeocin抗性基因；将氯霉素乙酰转移酶基因(Chloramphenicol Acetyltransferase gene，CAT基因)从pBudCE4.1/lacZ/CAT(购自Life Technologies)中PCR出，并通过Kpn I和Bgl II位点装入pBudCE4.1中；将绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescent Protein gene，GFP基因)从PCDNA3.1/CT-GFP-TOP9(购自LifeTechnologies)中PCR出，并通过Pst I和BamH I位点装入pBudCE4.1。

实施例1 pBudCE4.1中引入Afe I和EcoR V限制酶切位点

通过点突变的方法将Afe I和EcoR V限制酶切位点引入SV40聚腺苷酸化位点及BGH聚腺苷酸化位点下游。用Quickchange点突变试剂盒(购自安捷伦科技公司)进行点突变。引入Afe I酶切位点。

正向引物：5’-GGAAAACGATTCCGAAGC GCT AC-3’

反向引物：5’-CCT TCT ATG AAA GGT AGC GCT TCG-3’

定点突变PCR扩增条件如下：1、95℃ 30秒；2、95℃ 30秒；3、55℃ 1分钟；4、68℃ 5分钟；5、2-4重复18循环。

加入Dpn I酶将模板质粒消化,然后转化XL1-Blue感受态大肠杆菌。具体步骤如下：1.新鲜制备的或-20℃下保存的100uL感受态细胞(购自安捷伦科技)，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2.加入Dpn I酶(购自：NEB公司)消化后的质粒，轻轻混匀。3.冰上放置30分钟。4.42℃水浴热激60秒。5.冰上放置2分钟。6.加400uL LB培养液(购自Sigma-Aldrich)，37℃250转/分振荡培养30分钟。7、将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上8.平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。9、经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为质粒转化的大肠杆菌，10、挑取单克隆菌并抽提质粒。得到突变的质粒后，用Afe I酶切鉴定正确并送上海生工生物工程有限公司测序，结果正确。

然后在已引入AfeI的载体中引入EcoR V酶切位点：

正向引物：5’-ATCCACAGAATCAGGGGATAT CGC-3’

反向引物：5’-CAC ATG TTC TTT CCT GCG ATA TCC C-3’

定点突变PCR扩增条件如下：1、95℃ 30秒。2、95℃ 30秒；3、55℃ 1分钟；4、68℃ 5分钟；5、2-4重复18循环

加入Dpn I酶将模板质粒消化,然后转化XL1-Blue感受态大肠杆菌。得到突变的质粒后用EcoR V酶切鉴定正确并送上海生工生物工程有限公司测序，结果正确。

实施例2 pBudCE4.1中去除Zeocin抗性基因并加入卡那霉素抗性基因，PGK启动子，DHFR及SV40PA

将卡那霉素抗性基因、PGK启动子、DHFR及SV40PA从pCHO1.0(购自LifeTechnologies)中PCR出，并通过NheI和AfeI位点装入实施例1所获得的pBudCE4.1，同时去除Zeocin抗性基因。

正向引物:5’-GTG AGCGCTTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’

反向引物：5'-GTG GCTAGCTAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG-3'

PCR用Primestar HS高保真DNA聚合酶(购自TAKARA公司),

具体步骤如下：1、95℃ 3分钟；2、98℃ 10秒；3、47℃ 15秒；4、72℃ 3分钟；5、2-4重复30循环；6、72℃ 5分钟。

改造后的新载体命名为PBCM1.0，其结构图见附图5，其中，NheI、AfeI、FspI及EcoRV位点为两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的插入位点。

实施例3构建含有两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的表达载体

两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段(序列如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示)由上海生工生物工程有限公司合成得到。

两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段可插在PBCM1.0上游FSPI位点,或SV40PA下游Afe I位点,或PEF-1a上游Nhe I位点,或BGH PA下游EcoRV位点。

在以下的实例中，两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段插在PBCM 1.0上游FSPI位点及PEF-1a上游Nhe I位点,MAR核心片段序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

将两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段通过平端连接于PBCM1.0上游FSPI位点。并测序正确。

将两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段通过粘末端连接于PBCM1.0上游Nhe I位点。并测序正确。

构建得到的两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的表达载体分别命名为pBCM1.1,pBCM1.2,pBCM1.3，DNA序列分别为SEQ ID No.4，5，6。

实施例4含有两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的表达载体中插入外源蛋白基因

CAT基因插入PEF-1a下游的KpnI和BglII位点

将CAT基因从pBudCE4.1/lacZ/CAT(Life Technologies)中PCR出并通过Kpn I和Bgl II位点装入上述实施例3所构建的表达载体。

正向引物:5’-GTG GGTACC ATGGAGAAAAAAATCACTGG-3’

反向引物：5'-GTG AGATCT TTA CGCCCCGCCCTGCCACTCATC-3'

PCR用Primestar HS高保真DNA聚合酶(购自TAKARA公司)，

具体步骤如下：95℃ 3分钟；2、98℃ 10秒；3、52℃ 15秒；4、72℃ 1分钟，2-4重复30循环；5、72℃ 5分钟

CAT基因的表达量用氯霉素乙酰基转移酶检测试剂盒(购自Life Technologies)测定。

GFP基因从PCDNA3.1/CT-GFP-TOP9(购自Life Technologies)中PCR出并通过下游Pst I,BamH I位点装入实施例3所构建的表达载体。

正向引物1:5’-GTG CTGCAT GCCACCATGGCTAGCAAAGGAGAAG-3’

反向引物1：5’-GAGGGATCC TCATTATTTGTAGAGCTCATC-3’

PCR用Primestar HS高保真DNA聚合酶(购自TAKARA公司),

具体步骤如下：95℃ 3分钟；2、98℃ 10秒；3、50℃ 15秒；4、72℃ 1分钟，2-4重复30循环；5、72℃ 5分钟

GFP的表达量可通过cytofluorometric analyses(BD FACSCalibur flowcytometer)(购自BD公司)测定并通过WinMDI 2.8软件分析。

实施例5含有两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段的载体表达GFP及CAT

两端加有人工转录因子结合位点的MAR核心片段(序列如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所示)对增加绿色萤光蛋白及氯霉素乙酰转移酶在转染的CHO细胞中表达水平的影响。

利用FreeStyle MAX转染试剂(购自Life Technologies)将实施例4中构建好的表达载体pBCM1.1,pBCM1.2,pBCM1.3导入CHO-S细胞(购自Life Technologies)中。将上述转染后细胞置37℃，8％CO₂，130-150rpm悬浮培养。48小时后开始稳定表达筛选。同时以不含MAR和含MAR全长序列的表达载体作为对照。实验结果如附图1-4所示，结果表明，含本发明的MAR核心片段的表达载体在动物细胞中的外源蛋白的表达量获得大幅提高，GFP表达量提高了10-17倍(见附图1)。CAT表达量提高了14-15倍(见附图3)。GFP高产细胞株的比例提高了25-40倍(见附图2)。CAT高产细胞株的比例提高了25-40倍(见附图4)。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种新型的含MAR 核心片段的动物细胞表达载体

<130> 1

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> Synthesized DNA

<400> 1

gtggctagct ctttaattct aatatattta gaattcatct ttaattctaa tatatttaga 60

attcttcttt aattctaata tatttagaat tcctctttaa ttctaatata tttagaattc 120

ttctttaatt ctaatatatt tagaattcct ctttaattct aatatattta gaattcatct 180

ttaattctaa tatatttaga attcctcttt aattctaata tatttagaat tcttctttaa 240

ttctaatata tttagaattc atatatatac acatatatat aaaatatata tacacacata 300

tatataaaat atatatatac acacatatat ataaaatata tatatacaca tatatataaa 360

atatatatat acacatatat ataaaatata tatatataca catatatata aaatatatat 420

acacacatat atataaagta tatatataca cacatatata taaaatatat atatacacat 480

atatataaaa tatatatata cacatatata taaaatatat atatacacat atatataaaa 540

atatatatat atatttttta aaatattcca attgtctcac tttgtggatg agaaaaagaa 600

gtagttagag gtcaagtaac ttggcctaca tcttttctca agattgtaaa ctcctagtga 660

gcaataacca catcttcatt ttctttgtat aaaacaagaa agtttagcat gaaaaaggta 720

ctcaattaca aatgtgttgg attgaattga agacccttgg aaggggattt tgtacctgag 780

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tgtgaagtcc ttagccatga tagcccaata taacaggcta aatgataata ggtttatgtt 1020

cttttccttt atattctcag ataagcactg tcctctttaa ttctaatata tttagaattc 1080

atctttaatt ctaatatatt tagaattctt ctttaattct aatatattta gaattcctct 1140

ttaattctaa tatatttaga attcttcttt aattctaata tatttagaat tcctctttaa 1200

ttctaatata tttagaattc atctttaatt ctaatatatt tagaattcct ctttaattct 1260

aatatattta gaattcttct ttaattctaa tatatttaga attcagctag cgtg 1314

<210> 2

<211> 1494

<212> DNA

<213> Synthesized DNA

<400> 2

gtggctagcg atcagttgcg taatctatgc tgcattgcgc aattctagat cagttgcgta 60

atctatgctg cattgcgcaa ttcttgatca gttgcgtaat ctatgctgca ttgcgcaatt 120

ctcgatcagt tgcgtaatct atgctgcatt gcgcaattct tgatcagttg cgtaatctat 180

gctgcattgc gcaattctcg atcagttgcg taatctatgc tgcattgcgc aattctagat 240

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ttgcgcaatt cttgatcagt tgcgtaatct atgctgcatt gcgcaattct atatatatac 360

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gctgcattgc gcaattcttg atcagttgcg taatctatgc tgcattgcgc aattctcgat 1260

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aattcttgat cagttgcgta atctatgctg cattgcgcaa ttctagctag cgtg 1494

<210> 3

<211> 1470

<212> DNA

<213> Synthesized DNA

<400> 3

gtggctagct ctttaattct aatatattta gaattcatct ttaattctaa tatatttaga 60

attcttcttt aattctaata tatttagaat tcctctttaa ttctaatata tttagaattc 120

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tatacacata tatataaaat atatatatac acatatatat aaaatatata tatatacaca 480

tatatataaa atatatatac acacatatat ataaagtata tatatacaca catatatata 540

aaatatatat atacacatat atataaaata tatatataca catatatata aaatatatat 600

atacacatat atataaaaat atatatatat attttttaaa atattccaat tgtctcactt 660

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ctatgctgca ttgcgcaatt cttgatcagt tgcgtaatct atgctgcatt gcgcaattct 1320

ctctttaatt ctaatatatt tagaattcat ctttaattct aatatattta gaattcttct 1380

ttaattctaa tatatttaga attcctcttt aattctaata tatttagaat tcttctttaa 1440

ttctaatata tttagaattc cgctagcgtg 1470

<210> 4

<211> 9635

<212> DNA

<213> Synthesized DNA

<400> 4

gcgcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180

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gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540

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cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga 1440

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cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac 1620

ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca 1680

tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg 1740

catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag 1800

cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag 1860

acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca 1920

gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag 1980

acacaacgtg gctttccccc cccccccatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 2040

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 2100

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 2160

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 2220

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 2280

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 2340

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 2400

gcgtaaggag aaaataccgc atcagattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatccata 2460

tcataatatg tacaattcgc ccttcattta attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 2520

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 2580

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ttcttcttta attctaatat atttagaatt cctctttaat tctaatatat ttagaattca 3840

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atatatataa aatatatata tacacacata tatataaaat atatatatac acatatatat 4020

aaaatatata tatacacata tatataaaat atatatatat acacatatat ataaaatata 4080

tatacacaca tatatataaa gtatatatat acacacatat atataaaata tatatataca 4140

catatatata aaatatatat atacacatat atataaaata tatatataca catatatata 4200

aaaatatata tatatatttt ttaaaatatt ccaattgtct cactttgtgg atgagaaaaa 4260

gaagtagtta gaggtcaagt aacttggcct acatcttttc tcaagattgt aaactcctag 4320

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ttcatcttta attctaatat atttagaatt cttctttaat tctaatatat ttagaattcc 4800

tctttaattc taatatattt agaattcttc tttaattcta atatatttag aattcctctt 4860

taattctaat atatttagaa ttcatcttta attctaatat atttagaatt cctctttaat 4920

tctaatatat ttagaattct tctttaattc taatatattt agaattcagc tagctgaggc 4980

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tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc 6120

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ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 7020

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tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 7500

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 7560

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 7620

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 7680

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ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 7920

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 7980

gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 8040

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ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 8160

ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tatgcggtgt 8220

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ctgcgcatct ttaattctaa tatatttaga attcatcttt aattctaata tatttagaat 8340

tcttctttaa ttctaatata tttagaattc ctctttaatt ctaatatatt tagaattctt 8400

ctttaattct aatatattta gaattcctct ttaattctaa tatatttaga attcatcttt 8460

aattctaata tatttagaat tcctctttaa ttctaatata tttagaattc ttctttaatt 8520

ctaatatatt tagaattcat atatatacac atatatataa aatatatata cacacatata 8580

tataaaatat atatatacac acatatatat aaaatatata tatacacata tatataaaat 8640

atatatatac acatatatat aaaatatata tatatacaca tatatataaa atatatatac 8700

acacatatat ataaagtata tatatacaca catatatata aaatatatat atacacatat 8760

atataaaata tatatataca catatatata aaatatatat atacacatat atataaaaat 8820

atatatatat attttttaaa atattccaat tgtctcactt tgtggatgag aaaaagaagt 8880

agttagaggt caagtaactt ggcctacatc ttttctcaag attgtaaact cctagtgagc 8940

aataaccaca tcttcatttt ctttgtataa aacaagaaag tttagcatga aaaaggtact 9000

caattacaaa tgtgttggat tgaattgaag acccttggaa ggggattttg tacctgagga 9060

tctctttctt ttggccatat tgttcaatgg acaaaattta gccttcgaag gcaggccgat 9120

ttgaggttaa tactaccttt accacttgat agctatgtga ccttggccat gtggtttcaa 9180

cagtctgaac ctcattttct ctgtgtatgt gtggtcctcc ttacaagttt gtgaaaaatg 9240

tgaagtcctt agccatgata gcccaatata acaggctaaa tgataatagg tttatgttct 9300

tttcctttat attctcagat aagcactgtc ctctttaatt ctaatatatt tagaattcat 9360

ctttaattct aatatattta gaattcttct ttaattctaa tatatttaga attcctcttt 9420

aattctaata tatttagaat tcttctttaa ttctaatata tttagaattc ctctttaatt 9480

ctaatatatt tagaattcat ctttaattct aatatattta gaattcctct ttaattctaa 9540

tatatttaga attcttcttt aattctaata tatttagaat tcatgcgcaa ctgttgggaa 9600

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgcca 9635

<210> 5

<211> 9995

<212> DNA

<213> Synthesized DNA

<400> 5

gcgcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 240

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 660

cccaagcttg cattcctgca ggtcgacatc gatcttaagc agtacttcta gaggatccga 720

acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tatgcatacc ggtcatcatc accatcacca 780

ttgagtttga tccccgggaa ttcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 840

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catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 1140

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 1200

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ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca 1680

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ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 2160

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gcgtaaggag aaaataccgc atcagattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatccata 2460

tcataatatg tacaattcgc ccttcattta attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 2520

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 2580

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 2640

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atatatatat acacatatat ataaaatata tatacacaca tatatataaa gtatatatat 4200

acacacatat atataaaata tatatataca catatatata aaatatatat atacacatat 4260

atataaaata tatatataca catatatata aaaatatata tatatatttt ttaaaatatt 4320

ccaattgtct cactttgtgg atgagaaaaa gaagtagtta gaggtcaagt aacttggcct 4380

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tataaaacaa gaaagtttag catgaaaaag gtactcaatt acaaatgtgt tggattgaat 4500

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ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 5280

gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 5340

gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt aagtgccgtg 5400

tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact 5460

tccacctggc tccagtacgt gattcttgat cccgagctgg agccaggggc gggccttgcg 5520

ctttaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc 5580

gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca 5640

tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg 5700

cgggccagga tctgcacact ggtatttcgg tttttgggcc cgcggccggc gacggggccc 5760

gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg 5820

gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta 5880

tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat 5940

ggccgcttcc cggccctgct ccagggggct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc 6000

gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat 6060

gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctgg agcttttgga 6120

gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt 6180

gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctcgttg gaatttgccc 6240

tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc 6300

ttccatttca ggtgtcgtga acacgtggtc gcggccgctt cgaaggtacc atggagaaaa 6360

aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg 6420

catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct 6480

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tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat 6660

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atccccgcgc tggaggatca tccagccggc gtcccggaaa acgattccga agcccaacct 1020

ttcatagaag gcggcggtgg aatcgaaatc tcgtagcacg tgtagcgctt tagaaaaact 1080

catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 1140

gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 1200

gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct attaatttcc 1260

cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg 1320

agaatggcaa aagcttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag ccattacgct 1380

cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga 1440

gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc 1500

gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat tcttctaata 1560

cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac 1620

ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt agtctgacca 1680

tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg 1740

catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag 1800

cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc ctcgagcaag 1860

acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca 1920

gttttattgt tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag 1980

acacaacgtg gctttccccc cccccccatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 2040

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 2100

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 2160

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 2220

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 2280

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 2340

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 2400

gcgtaaggag aaaataccgc atcagattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatccata 2460

tcataatatg tacaattcgc ccttcattta attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc 2520

aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg 2580

cctctggcct cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg 2640

tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca 2700

gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat 2760

ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct 2820

ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag 2880

gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac 2940

gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttctcg 3000

agctcaagct tggggggggg gacagctcag ggctgcgatt tcgcgccaaa cttgacggca 3060

atcctagcgt gaaggctggt aggattttat ccccgctgcc atcatggttc gaccattgac 3120

tgcatcgtcg ccgtgtccca aaatatgggg attggcaaga acggagacct accctggcct 3180

ccgctcagga acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc agtggaaggt 3240

aaacagaatc tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga gaagaatcga 3300

cctttaaagg acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc accacgagga 3360

gctcattttc ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca accggaattg 3420

gcaagtaaag tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg 3480

aatcaaccag gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac 3540

acgtttttcc cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc 3600

ctctctgagg tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa 3660

gactaagcta gctgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc 3720

cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg 3780

gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa 3840

ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga 3900

acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct 3960

tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctc cagtacgtga ttcttgatcc cgagctggag 4020

ccaggggcgg gccttgcgct ttaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 4080

ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 4140

tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 4200

aagatagtct tgtaaatgcg ggccaggatc tgcacactgg tatttcggtt tttgggcccg 4260

cggccggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 4320

cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 4380

gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 4440

ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctcc agggggctca aaatggagga 4500

cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 4560

cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 4620

agttctggag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 4680

agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 4740

tctcgttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 4800

tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaac acgtggtcgc ggccgcttcg 4860

aaggtaccat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt tgatatatcc caatggcatc 4920

gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg tacctataac cagaccgttc 4980

agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa taagcacaag ttttatccgg 5040

cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc ggaattccgt atggcaatga 5100

aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc 5160

aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga cgatttccgg cagtttctac 5220

acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct ggcctatttc cctaaagggt 5280

ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt gagtttcacc agttttgatt 5340

taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt caccatgggc aaatattata 5400

cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt tcatcatgcc gtttgtgatg 5460

gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg 5520

gggcgtaaag atctggccgg ctgggcccgt ttcgaaggta agcctatccc taaccctctc 5580

ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt ttaaacccgc 5640

tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 5700

ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 5760

gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 5820

aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggat 5880

atcgcttctg aggcggaaag aaccagtggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5940

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6000

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 6060

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 6120

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 6180

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 6240

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 6300

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 6360

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 6420

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 6480

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 6540

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 6600

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 6660

ttaagggatt ttggtcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 6720

tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 6780

cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 6840

tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 6900

gcaccatata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 6960

cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 7020

ctattacgcc a 7031

Claims (10)

1.一种分离的重组表达载体的MAR核心片段，其核苷酸碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种重组表达载体，所述载体含权利要求1所述的MAR核心片段。

3.权利要求2所述载体，其所述MAR核心片段MAR核心片段插入启动子的上游及聚腺苷酸化位点的下游。

4.权利要求3所述载体，所述启动子为CMV、SV40或EF-1a启动子。

5.权利要求2-4任一所述载体，所述载体为pBudCE4.1、pDR1、pcDNA3.1(+)、pDHFF或pCHO 1.0，或者上述任一载体的改造载体。

6.权利要求5所述载体，其为pBudCE4.1改造的载体，所述载体核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

7.权利要求2-6任一所述载体，其中所述载体包含一个或多个编码一种或多种重组蛋白基因。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的载体。

9.权利要求8所述的细胞，其为哺乳动物细胞，可选自：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、Vero细胞、SP2/0细胞、NS/0骨髓瘤细胞、人类胚肾(HEK 293)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Hela细胞、人类B细胞、CV-1/EBNA细胞、L细胞、3T3细胞、HEPG2细胞或PerC6细胞和MDCK细胞。

10.一种制备重组蛋白的方法，所述方法包括转录和翻译存在于上述任一所述表达载体上的一个或多个编码所述重组蛋白的基因。