CN109576154A - 一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器 - Google Patents

Abstract

一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，采用嵌入式结构，两层PDMS板通过十字管道键合。PDMS A板通过输入口与微纳流控管道构成“两输入，四输出”、“三输入，四输出”结构，将3种不同因子与缓冲溶液混合成64种含因子1、因子2与因子3的混合溶液。每一个含三种因子的溶液输出口与3个细胞悬浮液输入口连通。每种细胞由PDMS B板的输入口输入，通过两层板连通口流进对应细胞培养室，同一微环境下：对不同列细胞培养室实现3种不同细胞的平行培养；对同一列细胞培养室实现三个同种细胞平行培养。本发明用于监控在多微环境、多微生态因子影响与控制因子动态浓度刺激下多细胞状态与命运的实验研究与检测分析。

Description

一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设 计用微纳流控阵列芯片反应器

技术领域

本发明属于医学细胞生物学实验及医疗检测装置领域，涉及一种多细胞及其多微环境、多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器。

背景技术

机体细胞与其微环境及机体微生物的相互作用在近年来成为医学细胞生物学领域的研究热点之一。观察、检测机体细胞在动态浓度的多因子刺激下所产生的一系列变化是研究机体细胞命运与状态的常用手段之一。微纳流控芯片以其独有的优势成为模拟机体细胞动态微环境的理想实验平台，在医学细胞生物学研究领域中具有广泛的应用。对外界溶解性因子(气体、代谢物、药物、细胞外基质材料、支架材料水凝胶等)进行合理控制是监控机体细胞的状态与命运的关键步骤，需要注意的是研究气体对机体细胞的作用时，需将气体事先溶于培养液中，从外部控制气体溶于培养液的量，已达到研究气体对机体细胞的作用的目的。

但目前却无法确定外界溶解性因子的最佳组合及其最佳浓度比例，这成为阻碍监控机体细胞状态与命运的重要因素，所以如何优化溶解性因子的组合及浓度是用于调控机体细胞命运与状态的亟待解决的关键问题。在优化外界溶解性因子的组合及其浓度比例的过程中，现有的研究多数是单独使用一种特定的溶解性因子或一种特定的浓度作为实验条件，这样既费时又不足以对研究进行有效地反馈。因此，需要一种能够快速而又精确地生成多种不同浓度溶解性因子的浓度梯度的组合，并且可以平行培养多种机体细胞的高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片。

发明内容

针对现有技术存在的问题，基于流体力学和微纳流控芯片技术，本发明提供一种用于监控机体细胞在与其微环境及机体微生物的相互作用下细胞状态与命运的实验装置，具体为通过嵌入式浓度分散结构设计出微纳流控阵列，提供一种高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片，能够快速而又精确地生成含3种溶解性因子的64种梯度浓度的溶液，并对3种细胞进行平行培养。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种多细胞及其多微环境、多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，所述的微纳流控阵列芯片反应器够快速精确地生成含3种溶解性因子的64种梯度浓度的溶液，并对3种细胞进行平行培养。该微纳流控阵列芯片反应器采用嵌入式结构，由两层聚二甲基硅氧烷PDMS(polydimethylsiloxane)板和一块玻璃片组成，两层PDMS板通过“十字管道”进行精确键合后，与玻璃片键合在一起，从上到下依次是PDMS B板、PDMS A板、玻璃片；所述的两层PDMS板包括PDMS A板、PDMS B板，两层板上有特定因子溶液输入口和特定的细胞输入口。

所述的PDMS A板包括混合器、细胞培养室，上半部分是混合器，下半部分是细胞培养室。根据微纳流控管道输入口的位置，将该板分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、H、I、J十三层，以此来对各输入口进行标示。

所述的混合器包括1个缓冲液输入口A1、1个因子1输入口A2、4个缓冲液输入口B3、4个因子2输入口B4、16个缓冲液输入口C5、16个因子3输入口C6、64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7。缓冲液与因子1溶液经由两个输入口(缓冲液输入口A1、因子1溶液输入口A2)构成的一个“两输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1的混合溶液。缓冲液、每种浓度的含因子1的溶液与因子2溶液经由1个“两输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口B3、因子2溶液输入口B4)构成的一个“三输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1与因子2的混合溶液。4种不同的浓度的含因子1的溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液。缓冲液、每种浓度的含因子1与因子2的溶液与因子3溶液经由1个“三输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口C5、因子3溶液输入口C6)构成的一个“三输入，四输出”结构，可混合成4种不同浓度的含因子1、因子2与因子3的混合溶液。16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成64种含因子1、因子2与因子3的混合溶液，形成64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7。

所述的细胞培养室包括细胞悬浮液1的64个输入口E8、细胞悬浮液2的64个输入口F9、细胞悬浮液3的64个输入口G10、细胞1的64列培养室H11、细胞2的64列培养室I12、细胞3的64列培养室J13。每一个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7与3个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道相连通，保证3种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下。64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7共与192个细胞悬浮液输入口相连通，形成192种微环境用于培养细胞；其中，64个细胞1悬浮液输入口E8通过微纳流控管道与64列细胞培养室H11(每列培养室从上到下包括3个细胞培养室)一一对应，即每一个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道与一列细胞培养室相连通，保证同种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下。

所述的PDMS B板包括4个溶液分散管道结构(2个缓冲溶液均分微纳流控结构、因子2溶液均分微纳流控结构与因子3溶液均分微纳流控结构)，3个细胞悬浮液分散管道结构。根据管道输入口的位置，将PDMS B板分为K、L、M、N、O、P、Q七层，以此来对各输入口进行标示。溶液均分微纳流控结构的作用在于可动态将同种溶液按实际需求均分成多份溶液，且每份溶液流速一致。通过改变溶液输入口至与PDMS A板间的输出口之间的微纳流控管道的长度，保证溶液从溶液均分微纳流控结构的溶液输入口到与PDMS A板相连通的输出口流经的路程相等，以此将同种溶液分成多份流速一致的溶液。

所述的缓冲溶液均分微纳流控结构输入口K14对应4个与PDMS A板相连通的输出口；因子2溶液均分微纳流控结构输入口L15对应4个与PDMS A板相连通的输出口；缓冲溶液均分微纳流控结构输入口M16对应16个与PDMS A板相连通的输出口；因子2溶液均分微纳流控结构输入口N17对应16个与PDMS A板相连通的输出口；细胞1悬浮液均分微纳流控结构输入口O18对应64个与PDMS A板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口E8一一对应并相连；细胞2悬浮液均分微纳流控结构输入口P19对应64个与PDMS A板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口F9一一对应并相连，如P19-1与F9-1相连，P19-2与F9-2相连；细胞3悬浮液均分微纳流控结构输入口Q20对应64个与PDMSA板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口G10一一对应并相连。

所述的在PDMS A板上B4-1与B3-2正中央，B4-2与B3-3正中央，B4-3与B3-4正中央分别有一个长宽相等的“十字管道”，共三个“十字管道”。在PDMS B板上L15-1与K14-2正中央，L15-2与K14-3正中央，L15-3与K14-4正中央，分别有一个长宽相等的“十字管道”，共三个“十字管道”。PDMS A板与PDMS B板上的“十字管道”作用在于便于后期键合。所述的“十字管道”的长宽均为1mm。

所述的PDMS A板混合器中“两输入，四输出”结构由两个溶液输入口及4个溶液输出管道组成，其中，微纳流控管道宽50-150μm，高100-300μm；所述的“三输入，四输出”结构由两个溶液输入口及一个“两输入，四输出”结构的输出口组成，其中，微纳流控管道宽50-150μm，高100-300μm。

所述的位于PDMS B板上的溶液均分微纳流控结构的溶液输入口至与位于PDMS A板上的溶液输出口之间的微纳流控管道长10-100μm，宽50-150μm，高100-300μm。

所述的在PDMS A板上与PDMS B板相连通的3种细胞的细胞悬浮液输入口上下有层次地排列，3种细胞输入口所在下方的微纳流控管道左右间距为100-300μm，3种细胞的细胞悬浮液输入口由上到下按顺序排列，排列间隔为200-500μm。

所述的PDMS A板上细胞培养室有层次的排列设计，位于同一列微纳流控管道中的3个细胞培养室由上到下排列，排列间隔100-250μm；相邻两列细胞培养室左右间距100-300μm，相邻两列最上方的细胞培养室上下间距160-350μm；每个细胞培养室直径为200-400μm，高100-300μm。

上述提及的所有的管道都是微纳流控管道。

嵌入式结构高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器在国内属首次构建，其主要创新点在于通过特定的输入口与微纳流控管道构成“两输入，四输出”结构与“三输入，四输出”结构，将3种不同溶解性因子溶液与缓冲溶液混合成64种含因子1、因子2与因子3的混合溶液。每一个含因子1、因子2与因子3的溶液输出口D7与3个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道相连通，可保证3种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下。在每个细胞悬浮液输入口后，通过微纳流控管道连接有一列细胞培养室，每列从上到下有3个细胞培养室，同一种细胞在同一微环境下平行培养在这三个细胞培养室内。而每种细胞由PDMS B板上的特定的输入口输入，通过PDMS A板与PDMS B板的连通接口流进对应的细胞培养室，以此来实现在同一微环境下，对不同列的细胞培养室，从左至右，实现3种不同细胞的平行培养；同一微环境下，对于同一列的细胞培养室，从上至下可以实现三个同种细胞平行培养。本发明可用于监控在多微环境、多微生态因子影响与控制因子动态浓度刺激下多细胞状态与命运的实验研究与检测分析及以此为基础的相关工程设计。

本发明的有益效果：在于利用微纳流控技术实现了快速、精确地将3种外界溶解性因子(气体、代谢物、药物、细胞外基质材料、支架材料水凝胶等)溶液组合出64种梯度浓度的混合溶液，并且与细胞培养室集成在一起实现配置溶液与培养细胞的一体化，简便快捷地实现细胞与生物、材料、代谢物、药物之间的对比研究、评价与预测，可用于监控在多因子动态浓度刺激下多细胞状态与命运的实验研究与检测分析及以此为基础的相关工程设计，进而为细胞微环境的解析与控制奠定实验基础。

附图说明

图1是微阵列嵌入式浓度分散结构。

图2是微纳流控结构整体注释图。

图3是各因子最终输出浓度图，其横纵坐标单位为列。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步说明。

一种多细胞及其多微环境、多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，利用流体力学原理和微纳流控技术对嵌入式浓度分散结构浓度梯度生成装置进行构建，并和细胞培养室集成在一起，实现快速而又精准地生成3种溶解性因子的浓度梯度的组合，并对3种细胞进行平行培养。

所述的PDMS A板包括混合器、细胞培养室，根据管道输入口的位置，将该板分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、H、I、J十三层，以此来对各输入口进行标示。

所述混合器包括一个缓冲液输入口A1、1个因子1输入口A2、4个缓冲液输入口B3(从左至右分别为B3-1，B3-2，B3-3，B3-4)、4个因子2输入口B4(从左至右分别为B4-1，B4-2，B4-3，B4-4)、16个缓冲液输入口C5(从左至右分别为C5-1，C5-2，C5-3，C5-4，C5-5，C5-6，C5-7，C5-8，C5-9，C5-10，C5-11，C5-12，C5-13，C5-14，C5-15，C5-16)、16个因子3输入口C6(从左至右分别为C6-1，C6-2，C6-3，C6-4，C6-5，C6-6，C6-7，C6-8，C6-9，C6-10，C6-11，C6-12，C6-13，C6-14，C6-15，C6-16)、64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7(从左至右分别为D7-1，D7-2，D7-3，D7-4，D7-5，D7-6，D7-7，D7-8，D7-9，D7-10，D7-11，D7-12，D7-13，D7-14，D7-15，D7-16，D7-17，D7-18，D7-19，D7-20，D7-21，D7-22，D7-23，D7-24，D7-25，D7-26，D7-27，D7-28，D7-29，D7-30，D7-31，D7-32，D7-33，D7-34，D7-35，D7-36，D7-37，D7-38，D7-39，D7-40，D7-41，D7-42，D7-43，D7-44，D7-45，D7-46，D7-47，D7-48，D7-49，D7-50，D7-51，D7-52，D7-53，D7-54，D7-55，D7-56，D7-57，D7-58，D7-59，D7-60，D7-61，D7-62，D7-63，D7-64)。

所述细胞培养室包括64个细胞悬浮液1输入口E8(从左至右分别为E8-1，E8-2，E8-3，E8-4，E8-5，E8-6，E8-7，E8-8，E8-9，E8-10，E8-11，E8-12，E8-13，E8-14，E8-15，E8-16，E8-17，E8-18，E8-19，E8-20，E8-21，E8-22，E8-23，E8-24，E8-25，E8-26，E8-27，E8-28，E8-29，E8-30，E8-31，E8-32，E8-33，E8-34，E8-35，E8-36，E8-37，E8-38，E8-39，E8-40，E8-41，E8-42，E8-43，E8-44，E8-45，E8-46，E8-47，E8-48，E8-49，E8-50，E8-51，E8-52，E8-53，E8-54，E8-55，E8-56，E8-57，E8-58，E8-59，E8-60，E8-61，E8-62，E8-63，E8-64)、64个细胞悬浮液2输入口F9(从左至右分别为F9-1，F9-2，F9-3，F9-4，F9-5，F9-6，F9-7，F9-8，F9-9，F9-10，F9-11，F9-12，F9-13，F9-14，F9-15，F9-16，F9-17，F9-18，F9-19，F9-20，F9-21，F9-22，F9-23，F9-24，F9-25，F9-26，F9-27，F9-28，F9-29，F9-30，F9-31，F9-32，F9-33，F9-34，F9-35，F9-36，F9-37，F9-38，F9-39，F9-40，F9-41，F9-42，F9-43，F9-44，F9-45，F9-46，F9-47，F9-48，F9-49，F9-50，F9-51，F9-52，F9-53，F9-54，F9-55，F9-56，F9-57，F9-58，F9-59，F9-60，F9-61，F9-62，F9-63，F9-64)、64个细胞悬浮液3输入口G10(从左至右分别为G10-1，G10-2，G10-3，G10-4，G10-5，G10-6，G10-7，G10-8，G10-9，G10-10，G10-11，G10-12，G10-13，G10-14，G10-15，G10-16，G10-17，G10-18，G10-19，G10-20，G10-21，G10-22，G10-23，G10-24，G10-25，G10-26，G10-27，G10-28，G10-29，G10-30，G10-31，G10-32，G10-33，G10-34，G10-35，G10-36，G10-37，G10-38，G10-39，G10-40，G10-41，G10-42，G10-43，G10-44，G10-45，G10-46，G10-47，G10-48，G10-49，G10-50，G10-51，G10-52，G10-53，G10-54，G10-55，G10-56，G10-57，G10-58，G10-59，G10-60，G10-61，G10-62，G10-63，G10-64)、64列细胞1培养室H11(从左至右分别为H11-1，H11-2，H11-3，H11-4，H11-5，H11-6，H11-7，H11-8，H11-9，H11-10，H11-11，H11-12，H11-13，H11-14，H11-15，H11-16，H11-17，H11-18，H11-19，H11-20，H11-21，H11-22，H11-23，H11-24，H11-25，H11-26，H11-27，H11-28，H11-29，H11-30，H11-31，H11-32，H11-33，H11-34，H11-35，H11-36，H11-37，H11-38，H11-39，H11-40，H11-41，H11-42，H11-43，H11-44，H11-45，H11-46，H11-47，H11-48，H11-49，H11-50，H11-51，H11-52，H11-53，H11-54，H11-55，H11-56，H11-57，H11-58，H11-59，H11-60，H11-61，H11-62，H11-63，H11-64)、64列细胞2培养室I12(从左至右分别为I12-1，I12-2，I12-3，I12-4，I12-5，I12-6，I12-7，I12-8，I12-9，I12-10，I12-11，I12-12，I12-13，I12-14，I12-15，I12-16，I12-17，I12-18，I12-19，I12-20，I12-21，I12-22，I12-23，I12-24，I12-25，I12-26，I12-27，I12-28，I12-29，I12-30，I12-31，I12-32，I12-33，I12-34，I12-35，I12-36，I12-37，I12-38，I12-39，I12-40，I12-41，I12-42，I12-43，I12-44，I12-45，I12-46，I12-47，I12-48，I12-49，I12-50，I12-51，I12-52，I12-53，I12-54，I12-55，I12-56，I12-57，I12-58，I12-59，I12-60，I12-61，I12-62，I12-63，I12-64)、64列细胞3培养室J13(从左至右分别为J13-1，J13-2，J13-3，J13-4，J13-5，J13-6，J13-7，J13-8，J13-9，J13-10，J13-11，J13-12，J13-13，J13-14，J13-15，J13-16，J13-17，J13-18，J13-19，J13-20，J13-21，J13-22，J13-23，J13-24，J13-25，J13-26，J13-27，J13-28，J13-29，J13-30，J13-31，J13-32，J13-33，J13-34，J13-35，J13-36，J13-37，J13-38，J13-39，J13-40，J13-41，J13-42，J13-43，J13-44，J13-45，J13-46，J13-47，J13-48，J13-49，J13-50，J13-51，J13-52，J13-53，J13-54，J13-55，J13-56，J13-57，J13-58，J13-59，J13-60，J13-61，J13-62，J13-63，J13-64)。

缓冲液与因子1溶液经由两个输入口(缓冲液输入口A1、因子1溶液输入口A2)构成的一个“两输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1的混合溶液。缓冲液、每种浓度的含因子1的溶液与因子2溶液经由1个“两输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口B3、因子2溶液输入口B4)构成的一个“三输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1与因子2的混合溶液。4种不同的浓度的含因子1的溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液。缓冲液、每种浓度的含因子1与因子2的溶液与因子3溶液经由1个“三输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口C5、因子3溶液输入口C6)构成的一个“三输入，四输出”结构，可混合成4种不同浓度的含因子1、因子2与因子3的混合溶液。16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成64种含因子1、因子2与因子3的混合溶液，形成64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7。每一个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7与3个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道相连通，如D7-1分别与E8-1、F9-1与G10-1相连通，D7-2分别与E8-2、F9-2与G10-2相连通，保证3种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下。64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7共与192个细胞悬浮液输入口相连通，形成192种微环境用于培养细胞。其中，64个细胞1悬浮液输入口E8通过微纳流控管道与64列细胞培养室H11(每列培养室从上到下包括3个细胞培养室)一一对应，如E8-1与H11-1通过微纳流控管道相连通，E8-2与H11-2通过微纳流控管道相连通，保证同种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下。

所述的PDMS B板包括4个溶液分散管道结构(2个缓冲溶液均分微纳流控结构、因子2溶液均分微纳流控结构与因子3溶液均分微纳流控结构)，3个细胞悬浮液分散管道结构。根据管道输入口的位置，可将所述PDMS B板分为K、L、M、N、O、P、Q七层，以此来对各输入口进行标示。溶液均分微纳流控结构的作用在于可动态将同种溶液按实际需求均分成多份溶液，且每份溶液流速一致。通过改变溶液输入口至与PDMS A板间的输出口之间的微纳流控管道的长度，保证溶液从溶液均分微纳流控结构的溶液输入口到与PDMS A板相连通的输出口流经的路程相等，以此将同种溶液分成多份流速一致的溶液。

所述缓冲溶液均分微纳流控结构输入口K14对应4个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是K14-1(与B3-1相连)，K14-2(与B3-2相连)，K14-3(与B3-3相连)，K14-4(与B3-4相连)；因子2溶液均分微纳流控结构输入口L15对应4个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是L15-1(与B4-1相连)，L15-2(与B4-2相连)，L15-3(与B4-3相连)，L15-4(与B4-4相连)；缓冲溶液均分微纳流控结构输入口M16对应16个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是M16-1(与C5-1相连)，M16-2(与C5-2相连)，M16-3(与C5-3相连)，M16-4(与C5-4相连)，M16-5(与C5-1相连)，M16-6(与C5-2相连)，M16-7(与C5-3相连)，M16-8(与C5-4相连)，M16-9(与C5-1相连)，M16-10(与C5-2相连)，M16-11(与C5-3相连)，M16-12(与C5-4相连)，M16-13(与C5-1相连)，M16-14(与C5-2相连)，M16-15(与C5-3相连)，M16-16(与C5-4相连)；因子2溶液均分微纳流控结构输入口N17对应16个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是N17-1(与C6-1相连)，N17-2(与C6-2相连)，N17-3(与C6-3相连)，N17-4(与C6-4相连)，N17-5(与C6-1相连)，N17-6(与C6-2相连)，N17-7(与C6-3相连)，N17-8(与C6-4相连)，N17-9(与C6-1相连)，N17-10(与C6-2相连)，N17-11(与C6-3相连)，N17-12(与C6-4相连)，N17-13(与C6-1相连)，N17-14(与C6-2相连)，N17-15(与C6-3相连)，N17-16(与C6-4相连)；细胞1悬浮液均分微纳流控结构输入口O18对应64个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是O18-1，O18-2，O18-3，O18-4，O18-5，O18-6，O18-7，O18-8，O18-9，O18-10，O18-11，O18-12，O18-13，O18-14，O18-15，O18-16，O18-17，O18-18，O18-19，O18-20，O18-21，O18-22，O18-23，O18-24，O18-25，O18-26，O18-27，O18-28，O18-29，O18-30，O18-31，O18-32，O18-33，O18-34，O18-35，O18-36，O18-37，O18-38，O18-39，O18-40，O18-41，O18-42，O18-43，O18-44，O18-45，O18-46，O18-47，O18-48，O18-49，O18-50，O18-51，O18-52，O18-53，O18-54，O18-55，O18-56，O18-57，O18-58，O18-59，O18-60，O18-61，O18-62，O18-63，O18-64，且与细胞1悬浮液输入口E8一一对应并相连，如O18-1与E8-1相连，O18-2与E8-2相连；细胞2悬浮液均分微纳流控结构输入口P19对应64个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是P19-1，P19-2，P19-3，P19-4，P19-5，P19-6，P19-7，P19-8，P19-9，P19-10，P19-11，P19-12，P19-13，P19-14，P19-15，P19-16，P19-17，P19-18，P19-19，P19-20，P19-21，P19-22，P19-23，P19-24，P19-25，P19-26，P19-27，P19-28，P19-29，P19-30，P19-31，P19-32，P19-33，P19-34，P19-35，P19-36，P19-37，P19-38，P19-39，P19-40，P19-41，P19-42，P19-43，P19-44，P19-45，P19-46，P19-47，P19-48，P19-49，P19-50，P19-51，P19-52，P19-53，P19-54，P19-55，P19-56，P19-57，P19-58，P19-59，P19-60，P19-61，P19-62，P19-63，P19-64，且与细胞1悬浮液输入口F9一一对应并相连，如P19-1与F9-1相连，P19-2与F9-2相连；细胞3悬浮液均分微纳流控结构输入口Q20对应64个与PDMS A板相连通的输出口，从左至右分别是Q20-1，Q20-2，Q20-3，Q20-4，Q20-5，Q20-6，Q20-7，Q20-8，Q20-9，Q20-10，Q20-11，Q20-12，Q20-13，Q20-14，Q20-15，Q20-16，Q20-17，Q20-18，Q20-19，Q20-20，Q20-21，Q20-22，Q20-23，Q20-24，Q20-25，Q20-26，Q20-27，Q20-28，Q20-29，Q20-30，Q20-31，Q20-32，Q20-33，Q20-34，Q20-35，Q20-36，Q20-37，Q20-38，Q20-39，Q20-40，Q20-41，Q20-42，Q20-43，Q20-44，Q20-45，Q20-46，Q20-47，Q20-48，Q20-49，Q20-50，Q20-51，Q20-52，Q20-53，Q20-54，Q20-55，Q20-56，Q20-57，Q20-58，Q20-59，Q20-60，Q20-61，Q20-62，Q20-63，Q20-64，且与细胞1悬浮液输入口G10一一对应并相连，如Q20-1与G10-1相连，Q20-2与G10-2相连。

另外，在PDMS A板上B4-1与B3-2正中央，B4-2与B3-3正中央，B4-3与B3-4正中央分别有一个长宽均为1mm的“十字管道”，共三个长宽均为1mm的“十字管道”。在PDMS B板上L15-1与K14-2正中央，L15-2与K14-3正中央，L15-3与K14-4正中央，分别有一个长宽均为1mm的“十字管道”，共三个长宽均为1mm的“十字管道”。PDMS A板与PDMS B板上的“十字管道”作用在于便于后期键合。

图1所示多细胞及其多微环境、多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器模型由两层PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)板及一块玻璃片组成，在PDMS A和PDMS B板上有特定因子溶液输入口和特定的细胞输入口。PDMS A板的上半部分是混合器，下半部分是细胞培养室。

多细胞及其多微环境、多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器具体的结构如图2所示，分为PDMS A层与PDMS B层两层，两层PDMS板通过“十字管道”进行精确键合。微纳流控管道宽度为100μm，深度为250μm。另外，弯曲的微纳流控管道的设计保证在同一水平位置弯曲纵向管道中的溶液的流量一致，进而保证各因子溶液能精确混合。在微纳流控芯片尾部有576个细胞培养室，直径为400μm，深度为250μm。

微纳流控芯片在进行接种细胞之前需进行灭菌处理。具体操作流程为先将微纳流控芯片表面使用75％酒精擦拭，清理干净表面，之后放入超净工作台中，使用紫外灭菌灯照射2h。在灭菌之后，需要进行去气泡操作，具体流程为向图2中所示的A1、A2、K14、L15、M16与N17共6个输入口依次通入75％酒精(防止芯片内部产生气泡)、去离子水和PBS(0.01M，pH7.4)。在灭菌与去气泡操作之后，向细胞液输入口O18、P19和Q20中分别通入200μg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液，通入一段时间(尽量使胶原蛋白溶液充满所有的细胞培养室)后将微纳流控芯片放入恒温箱中37℃下孵育2h，以增强胶原蛋白与PDMS板之间的黏附，进而增强细胞与细胞培养室之间的黏附性，之后便可灌注细胞。灌注的细胞悬浮液会均匀分成64份流进对应的细胞培养室。

在接种完细胞后即可通入各因子溶液，从缓冲液输入口A1、K14、M16输入PBS，以作为稀释因子溶液浓度的稀释液；从因子1溶液输入口A2输入因子1的溶液；从因子2溶液输入口L15输入因子2的溶液；从因子3溶液输入口N17输入因子3的溶液，形成64种含因子1、因子2与因子3的混合溶液，若将各因子终浓度进行归一化，则应严格按照因子1溶液浓度：因子2溶液浓度：因子3溶液浓度＝6:3:1的比例通入溶液，假设因子3溶液浓度为1时，因子1、因子2与因子3之间的浓度关系如图3所示。进而实现在同一微环境下，对不同列的细胞培养室，从左至右，实现3种不同细胞的平行培养；同一微环境下，对于同一列的细胞培养室，从上至下可以实现三个同种细胞平行培养。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，所述的微纳流控阵列芯片反应器能够快速精确地生成含3种溶解性因子的64种梯度浓度的溶液，并对3种细胞进行平行培养；该微纳流控阵列芯片反应器采用嵌入式结构，由两层聚二甲基硅氧烷PDMS板和一块玻璃片组成，两层PDMS板之间通过“十字管道”键合后，与玻璃片键合在一起，从上到下依次是PDMS B板、PDMS A板、玻璃片，两层板上有特定因子溶液输入口和特定的细胞输入口；

所述的PDMS A板包括混合器、细胞培养室，上半部分是混合器，下半部分是细胞培养室；根据微纳流控管道输入口的位置，将该板分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、H、I、J十三层，以此来对各输入口进行标示；

所述PDMS A板上的混合器包括1个缓冲液输入口A1、1个因子1输入口A2、4个缓冲液输入口B3、4个因子2输入口B4、16个缓冲液输入口C5、16个因子3输入口C6及64个含因子1、因子2与因子3溶液输出口D7；缓冲液与因子1溶液经由两个输入口(缓冲液输入口A1、因子1溶液输入口A2)构成的一个“两输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1的混合溶液；缓冲液、每种浓度的含因子1的溶液与因子2溶液经由1个“两输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口B3、因子2溶液输入口B4)构成的一个“三输入，四输出”结构，混合形成4种不同浓度的含因子1与因子2的混合溶液；4种不同的浓度的含因子1的溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液；缓冲液、每种浓度的含因子1与因子2的溶液与因子3溶液经由1个“三输入，四输出”结构的输出口及2个输入口(缓冲液输入口C5、因子3溶液输入口C6)构成的一个“三输入，四输出”结构，可混合成4种不同浓度的含因子1、因子2与因子3的混合溶液；16种不同的浓度的含因子1与因子2的混合溶液经由“三输入，四输出”结构最终可混合成64种含因子1、因子2与因子3的溶液，形成64个含因子1、因子2与因子3的溶液输出口D7；

所述细胞培养室包括64个细胞悬浮液1输入口E8、64个细胞悬浮液2输入口F9、64个细胞悬浮液3输入口G10、64列细胞1培养室H11、64列细胞2培养室I12、64列细胞3培养室J13；每一个含因子1、因子2与因子3的溶液输出口D7与3个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道相连通，保证3种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下；64个含因子1、因子2与因子3的混合溶液输出口D7共与192个细胞悬浮液输入口相连通，每一个细胞悬浮液输入口通过微纳流控管道与一列细胞培养室相连通，保证同种细胞可平行培养在同种浓度含因子1、因子2与因子3的混合溶液构成微环境下；

所述的PDMS B板包括4个溶液分散管道结构、3个细胞悬浮液分散管道结构；所述的4个溶液分散管道结构包括2个缓冲溶液均分微纳流控结构、因子2溶液均分微纳流控结构与因子3溶液均分微纳流控结构；根据管道输入口的位置，将PDMS B板分为K、L、M、N、O、P、Q七层，以此来对各输入口进行标示；

所述缓冲溶液均分微纳流控结构输入口K14对应4个与PDMS A板相连通的输出口；因子2溶液均分微纳流控结构输入口L15对应4个与PDMS A板相连通的输出口；缓冲溶液均分微纳流控结构输入口M16对应16个与PDMS A板相连通的输出口；因子2溶液均分微纳流控结构输入口N17对应16个与PDMS A板相连通的输出口；细胞1悬浮液均分微纳流控结构输入口O18对应64个与PDMS A板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口E8一一对应并相连；细胞2悬浮液均分微纳流控结构输入口P19对应64个与PDMS A板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口F9一一对应并相连；细胞3悬浮液均分微纳流控结构输入口Q20对应64个与PDMS A板相连通的输出口，且与细胞1悬浮液输入口G10一一对应并相连；

上述提及的所有管道均为微纳流控管道。

2.根据权利要求1所述的一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，所述的“两输入，四输出”结构由两个溶液输入口及4个溶液输出管道组成，其中，微纳流控管道宽50-150μm，高100-300μm；所述的“三输入，四输出”结构由两个溶液输入口及一个“两输入，四输出”结构的输出口组成，其中，微纳流控管道宽50-150μm，高100-300μm。

3.根据权利要求1所述的一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，位于PDMS B板上的溶液均分微纳流控结构的溶液输入口至与位于PDMS A板上的溶液输出口之间的微纳流控管道长10-100μm，宽50-150μm，高100-300μm。

4.根据权利要求1所述的一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，在PDMS A板上与PDMS B板相连通的3种细胞的细胞悬浮液输入口上下有层次排列，3种细胞输入口所在下方的微纳流控管道左右间距为100-300μm，3种细胞的细胞悬浮液输入口由上到下按顺序排列，排列间隔为200-500μm。

5.根据权利要求1所述的一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，PDMS A板上细胞培养室有层次的排列设计，位于同一列微纳流控管道中的3个细胞培养室由上到下排列，排列间隔100-250μm；相邻两列细胞培养室左右间距100-300μm，相邻两列最上方的细胞培养室上下间距160-350μm；每个细胞培养室直径为200-400μm，高100-300μm。

6.根据权利要求1所述的一种多细胞多微环境多微生态因子高通量精准对比分析与设计用微纳流控阵列芯片反应器，其特征在于，所述的“十字管道”的长宽均为1mm。