CN109570225A

CN109570225A - 一种提高镍污染土壤植物修复效率的方法

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Publication number: CN109570225A
Application number: CN201811366188.6A
Authority: CN
Inventors: 卢琪; 李怀悦; 翁轶能; 攸越; 潘维; 都韶婷
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109570225B

Abstract

本发明公开了一种提高镍污染土壤植物修复效率的方法，包括如下步骤：将修复植物种植于待修复镍污染土壤中，在修复植物的生长周期中，定期向修复植物的根部的土壤中接种保藏号为CGMCC 4.1290的云南原小单孢菌(Promicromonospora yunnanensis)菌液。本发明解决的技术问题是提供一种在Ni污染土壤中配施云南原小单孢菌活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶的方法，用于促进植物吸收土壤中的Ni，达到提高植物修复土壤Ni污染效率的效果。

Description

一种提高镍污染土壤植物修复效率的方法

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种利用云南原小单孢菌活化植物根系蔗糖非酵解型1蛋白激酶，从而提高镍污染土壤植物修复效率的方法。

背景技术

随着我国经济社会和城市化进程的不断推进，环境污染状况尤其是土壤污染日益严峻。截至2016年，全国已有2500万公顷耕地遭受不同程度的重金属污染(朱亦珺等.中国环境科学学会2016年学术年会.2016:4014-4018)。其中，工业活动中产生的Ni催化剂、Ni残渣的过度排放以及农业生产中污水灌溉、磷酸盐肥料的过量施用和地膜大量使用等现象，使大量Ni排放到环境中，造成土壤Ni污染。2014年《全国土壤污染状况调查公报》数据显示土壤重金属Ni污染物点位超标率已达4.8％，其中，轻微、轻度、中度和重度超标点位分别占了3.9％、0.5％、0.3％和0.1％。目前，Ni污染事件也频频发生。例如，2011年有研究对泰安土壤重金属现状进行评价时指出，泰安市土壤在重金属中主要存在Ni超标现象，超标率为12.7％，且主要集中在蔬菜种植区(李锋.山东农业大学硕士学位论文,2011)；2013年有学者对成都市锦江区江家菜地和温江区永宁镇“菜篮子”两个基地进行重金属含量分析指出，两个蔬菜基地的Ni元素均明显高出标准值24mg/kg左右，为污染下限值的130％，同时也是两个蔬菜基地的唯一污染元素(向仲香.现代农业科技,2013(16):212-214)。Ni虽然是生物体内必需的微量元素，但过量的Ni会严重影响生物体的生理生化功能。一方面，土壤中过量Ni会阻滞植物的生长发育，导致农产品产量与品质下降；另一方面，Ni可通过食物链迁移至人体从而对机体产生毒害作用，如妨碍血液机能、造成贫血、引起组织细胞机能变化等。由此，土壤Ni污染的治理也已逐渐成为近年来的研究重点。

传统的Ni污染修复技术(如物理化学修复技术，稳定化/固定化和热解吸等)通常费用昂贵且容易对土壤产生如二次污染等干扰。目前得到大众认可的植物修复技术以其原位、绿色、经济等优点被广泛应用。例如，Atma等(2017)研究发现芦竹可作为一种Ni超积累植物，吸收Ni至叶茎组织从而达到植物修复Ni污染土壤的效果(Atma等.InternationalJournal of Phytoremediation,2017,19(4):377-386)；超积累植物李氏禾对土壤中Ni表现出很强的富集能力，叶片中Ni最高含量可达1349mg/kg(张学洪等.桂林理工大学学报,2008,28(1):98-101)。众所周知，上述过程往往受植物生长速度、生物量、污染物在土壤中的分布和土壤理化性质等因素的限制，其修复效率较低。为弥补单纯依赖植物修复Ni污染土壤效率低的短板，有研究发现植物联合添加螯合剂的方式可显著提高植物修复效率。如，在向日葵对Ni污染土壤进行修复时，加入5.0mmol/kg EDTA可显著增加向日葵对Ni的提取效率，向日葵提取Ni的总量比对照增加72％(王学锋等.全国农业环境科学学术研讨会.2007)；Ni污染土壤中施加浓度为5.0/2.5mmol/kg EDTA/柠檬酸时，土壤中水溶态Ni含量是对照组的48.2倍，紫花苜蓿转运系数达到对照组的194.3％(谢芳芳等.安徽农业大学学报,2017,44(4):684-689)。但与此同时，螯合剂的使用带来的环境风险也如影随形，如有研究发现添加EDTA会显著抑制无重金属污染土壤中的脱氢酶活性(Epelde等.Science ofthe Total Environment,2008,401(1):21-28)；谢芳芳等(2017)提出EDTA或柠檬酸的添加会对土壤过氧化氢酶有不同程度的抑制作用；另外也有研究指出EDTA处理会对土壤中的微生物活性具有明显的抑制作用(Mühlbachová.Ecological Engineering,2011,37(7):1064-1071)。这说明化学物质的添加不仅会导致土壤肥力下降，同时还可能对作物和土壤微生物群落产生生物毒性。因此，外源添加螯合剂等化学试剂引起的二次污染也不容忽视。如何从生态学角度提高超积累植物的修复能力备受关注。

近年来微生物联合植物修复作为一种强化植物修复技术，充分发挥植物与微生物修复技术的优势，已逐渐成为人类研究重点。有研究发现一株从藨草根际土中筛选的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)可显著提高Ni污染土壤藨草具有富集Ni的能力，使藨草体内的Ni含量由88mg/kg增至267mg/kg(Chen等.Journal of Hazardous Materials,2017,325:319-326)；向Ni污染土壤中添加解磷酵母Pichia farinose FL7后，印度芥菜中Ni含量可增加50％(胡宗福等.中国生物工程杂志,2015,35(11):36-45)；Aka等报道Ni污染土壤中接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis KP717559)使荠菜根和茎组织中的Ni浓度分别增加了56％和32％(Aka等.International Journal of Phytoremediation,2016,18(2):200-209)；Ma等研究发现Bacillus cereus SRA10可使荠菜根和地上部组织中的Ni浓度增加56％和73％(Ma等.Journal of Hazardous Materials,2009,166(2):1154-1161)。值得注意的是，上述关于Ni污染土壤的微生物-植物联合修复技术研究中所采用的菌剂大多是通过分泌有机酸、氨基酸或生物表面活性剂等方式增加土壤中Ni的生物可利用度，以此提高植物的修复效率。如解磷毕赤酵母能够分泌有机酸导致土壤pH降低(从7.43±0.01降至7.12±0.05)；接种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa KP717554)、产碱杆菌(Alcaligenes feacalis KP717561)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis KP717559)使土壤中可溶性Ni含量显著增加44％；接种Bacillus cereus SRA10使土壤生物可利用Ni的浓度显著增加50％。上述菌剂虽然可以有效促进植物镍积累达到修复镍土壤的目的，但是也存在土壤酸化等土壤生理生化破坏等问题。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种在Ni污染土壤中配施云南原小单孢菌活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶的方法，用于促进植物吸收土壤中的Ni，达到提高植物修复土壤Ni污染的效果。

考虑到植物对土壤中Ni的提取主要依赖植物根系的吸收，因此通过调控植物根系吸收Ni效率的方法，可能更适合亟待被修复的中轻度污染农业土壤，本发明提供一种Ni污染土壤中配施云南原小单孢菌活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶的方法。

一种提高镍污染土壤植物修复效率的方法，包括如下步骤：

将修复植物种植于待修复镍污染土壤中，在修复植物的生长周期中，定期向修复植物根部的土壤中接种云南原小单孢菌(Promicromonospora yunnanensis)菌液。

优选地，所述云南原小单孢菌(Promicromonospora yunnanensis)为保藏号为CGMCC 4.1290的云南原小单孢菌(Promicromonospora yunnanensis)。购自于北京的中国普通微生物菌种保藏管理中心。

根据伯杰氏细菌系统分类学手册，云南原小单孢菌在分类学上归属于：放线菌目、微球菌亚目、原小单孢菌科、原小单孢菌属。

优选地，所述菌液接种至修复植物根部的土壤表层深0.4～0.6cm处。进一步优选为0.5cm。此厚度既适合实际操作又能使菌剂在基质中最优地活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶。

优选地，所述菌液的浓度为5×10⁷～1×10⁸CFU/mL；每次接种菌液体积为1.5～2.5mL。进一步优选地，每次接种菌液体积为2mL。此接种剂量能使菌种具有最优的定殖效果。

优选地，每6～8天接种一次，共接种3～5次。进一步优选地，每周接种一次，供接种4次。此接种时间及次数能使土壤中的活菌数量持续维持最高水平，从而使菌更优地活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶。

本发明采用对Ni具有较强积累能力的拟南芥为供试植株，本发明的方法适用的修复植物包括但不限于东南景天、蜈蚣草、印度荠菜、海洲香薷、龙葵、向日葵和李氏禾等Ni积累能力强的植物。

供试的拟南芥采用野生型拟南芥或2C型蛋白磷酸酶缺失突变体。

进一步优选地，所述拟南芥长至双叶、根长1.8～2.2cm后移植于待修复镍污染土壤中；待修复土壤中培养1～2周后接种所述菌液。植物移栽后过早接种，不利于植物在污染土壤中的恢复性生长；植物移栽后过晚接种，则会减弱接菌对修复植物体内Ni的积累量，影响修复效果。

优选地，所述镍污染土壤中Ni含量为40mg/kg～200mg/kg。土壤中Ni含量低于40mg/kg或高于200mg/kg，接菌后对修复的促进效果约降低10～30％。

本发明发现，50mg/kg Ni污染土壤中接种云南原小单孢菌可显著促进野生型拟南芥对Ni的积累。然而，接菌对通过生物工程手段构建的蔗糖非酵解型1蛋白激酶缺失型突变体内Ni的积累却无显著影响。这说明，接菌的作用由蔗糖非酵解型1蛋白激酶介导。与此同时，接菌可以大幅度提高2C型蛋白磷酸酶缺失突变体体内Ni的积累。考虑到2C型蛋白磷酸酶对蔗糖非酵解型1蛋白激酶的不利作用，上述结果均表明，外源添加云南原小单孢菌可通过活化蔗糖非酵解型1蛋白激酶，促进拟南芥根对Ni的转运，从而大幅度提高Ni污染土壤的植物修复效率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)当使用本发明方法时，可使Ni污染土壤的野生型拟南芥Ni含量增加36％，单株拟南芥体内Zn积累量提高68％。这说明，利用本发明方法可提高修复重金属Ni污染土壤的效率。

2)当使用本发明方法时，可使2C型蛋白磷酸酶缺失突变体拟南芥体内Ni含量增加106％，单株拟南芥体内Ni积累量提高155％。而对蔗糖非酵解型1蛋白激酶缺失型突变体内Ni的积累却无显著影响。这说明，今后可通过生物工程手段调控蔗糖非酵解型1蛋白激酶介导的Ni吸收过程，优化植物修复Ni污染土壤的效率。

具体实施方式

以下实验中以对Ni具有较强积累能力的拟南芥为供试植株。

实施例1

本试验供试植株为Colombia-0野生型拟南芥。土壤由营养土(Klasmann-deilmannGmbh)、蛭石和珍珠岩按6:3:1比例混匀(v/v)，并高压灭菌(121℃，30min)所得。将灭菌后的土壤置于塑料防水膜上摊开自然风干，土壤加入六水合硫酸镍(NiSO₄·6H₂O)溶液混匀得到含50mg/kg Ni土壤。无污染土壤与Ni污染土壤制备完毕后均放置三个月老化待用。试验土壤理化性质如下：pH 6.3、35g/kg N、25g/kg P、45g/kg K。

试验开始前将老化的土壤再次和匀后分装到F150直边盆中(150×105×115mm)，每盆称取200g试验土壤待用。取一块80目的尼龙纱布铺于厚度约2cm的海绵上并用霍格兰培养液浸润后置于培养箱(外径175×115×65mm)中，培养箱内加霍格兰培养液至海绵三分之二处。拟南芥种子放于4℃冰箱春化48h后平撒在上述纱布上进行发芽。霍格兰培养液成分如下：培养基中营养成分如下：2.25mM KNO₃、0.25mM MgSO₄、1mM CaCl₂、1mM NaH₂PO₄、0.375mM(NH₄)₂SO₄、0.375mM K₂SO₄、10μM H₃BO₃、0.5μM MnSO₄、0.5μM ZnSO₄、0.1μM CuSO₄、0.1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄和25μM Fe-EDTA，pH值为5.5。植物均在人工气候室培养，条件如下：光照强度50-60μmol photons m^-2s^-1，相对湿度70％-80％，光周期12h/25℃/天，12h/22℃/夜。

各直边培养盆中分别进行如下操作：

(1)待海绵上拟南芥幼苗长至双叶，根长约2cm后移至直边培养盆中。

(2)为使土壤含水率保持60-70％，本实例中每隔2-3d补水一次。

(3)拟南芥于培养盆培养2周后，接入云南原小单孢菌Promicromonosporayunnanensis(中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 4.1290)。菌剂的培养与处理方法：将上述菌种接入麦芽汁培养基中(酵母提取物4.0g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，蒸馏水1L，pH 7.3，121℃灭菌30min)活化摇菌，即将接种后的菌种瓶放置于恒温震荡箱内摇菌活化3d(转速150r/min、温度28℃)。将活化后的菌液置于4000r/min离心5min，弃上清液后加入10mL 0.9％生理盐水涡旋混匀后离心洗涤两次。在每株拟南芥根部的土壤表层深0.5cm处接种2mL上述菌液。每周配施一次，共配施4次。

(4)拟南芥于温室培养架种植1.5个月后收获(低温(8-15℃)下种植2个月，15-30℃则种植1.5个月即可)。将地上部用蒸馏水洗涤3次，在65℃下杀青并烘干至恒重后记录干重。将地上部样品用HNO₃/HCl(3:1，v/v)在120℃条件下消解至棕色氮氧化物基本赶完，然后在180℃下进一步消解至溶液透明。样品冷却后用1％硝酸定容至10mL。随后用原子吸收光谱(Agilent 4210MP-AES)测定并分析拟南芥体内的Ni含量。

Colombia-0野生型拟南芥叶片Ni含量(按干重计，下同)如表1所示：

表1 50mg/kg Ni污染土壤处理下野生型拟南芥地上部Ni含量及积累量

	Ni	Ni+云南原小单孢菌	增加百分比
				Ni含量mg/kg	26	36	36％
单株Ni积累量μg/plant	0.5	0.8	68％

实施例2

将实施例1中的“Colombia-0野生型拟南芥”改成“2C型蛋白磷酸酶缺失突变体”，其余同实施例1。所得结果如表2：

C型蛋白磷酸酶(AT4G26080、AT5G57050和AT1G72770)缺失突变体可通过已比较成熟的CRISPR/Cas9基因编辑手段获得。

表2 50mg/kg Ni污染土壤处理下2C型蛋白磷酸酶缺失突变体地上部Ni含量及积累量

	Ni	Ni+云南原小单孢菌	增加百分比
				Ni含量mg/kg	54	111	106％
单株Ni积累量μg/plant	1.1	2.7	155％

实施例3

将实施例1中的“Colombia-0野生型拟南芥”改成“类蔗糖非酵解型1蛋白激酶(AT3G50500和AT5G66880)缺失型突变体(可通过已比较成熟的CRISPR/Cas9基因编辑手段获得基因)”，其余同实施例1。所得结果如表3：

表3 50mg/kg Ni污染土壤处理下蔗糖非酵解型1蛋白激酶缺失型突变体拟南芥地上部Ni含量及积累量

	Ni	Ni+云南原小单孢菌	统计分析
				Ni含量mg/kg	20	21	不显著
单株Ni积累量μg/plant	0.4	0.5	不显著

综上所述，发明人经大量研究发现本方法可通过显著提高拟南芥根部镍转运蛋白的基因表达的方式促进植物对Ni的吸收，从而促进植物修复土壤Ni污染的效率，有望为植物修复重金属污染土壤研究提供新的方法。

本发明适用于所有能吸收土壤中镍元素的修复植物，比如东南景天、蜈蚣草、印度荠菜、海洲香薷、龙葵、向日葵和李氏禾等。尤其适用于遗传背景比较清晰的植物，例如可利用成熟的CRISPR/Cas9基因编辑手段对东南景天非酵解型1蛋白激酶同源基因进行编辑，获得该种植物的类蔗糖非酵解型1蛋白激酶缺失型突变体，从而大幅度提高该种植物对Ni的修复效率。

以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims

1.一种提高镍污染土壤植物修复效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述云南原小单孢菌(Promicromonosporayunnanensis)为保藏号为CGMCC 4.1290的云南原小单孢菌(Promicromonosporayunnanensis)。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌液接种至修复植物根部的土壤表层深0.4～0.6cm处。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌液的浓度为5×10⁷～1×10⁸CFU/mL；每次接种菌液体积为1.5～2.5mL。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每6～8天接种一次，共接种3～5次。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述修复植物为东南景天、蜈蚣草、印度荠菜、海洲香薷、龙葵、向日葵和李氏禾中的至少一种。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述拟南芥长至双叶、根长1.8～2.2cm后移植于待修复镍污染土壤中；待修复土壤中培养1～2周后接种所述菌液。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述镍污染土壤中Ni含量为40mg/kg～200mg/kg。