CN116855427B - 微生物组合物及杀虫抗菌用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微生物组合物，包括活菌比例为2‑7：2‑7：1‑5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。所述的微生物组合物具有杀虫、分泌抗生素和植物生长调节物质等生物防治作用，可以改善根际土壤微环境，减少作物病虫害的发生；还可明显增强土壤肥力，减少化肥用量，缓解因长期施用化肥造成的土壤板结现象，进而改善土壤结构，提高作物产量和品质。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种微生物组合物及其在杀虫抗菌中的用途。
背景技术
化肥和农药的过量使用，不仅造成生态环境污染，而且严重危害人类健康，影响农业可持续化发展。微生物菌剂是一种绿色环保、生态友好的肥料，具有增加土壤肥力、减少化肥和农药使用、净化和修复土壤、降低植物病害、提质增产、提高食品安全等特点，是实现农业可持续化发展的重要途径。微生物菌剂在世界范围内已得到了广泛应用，如根瘤菌、芽孢杆菌、假单胞菌等。
单一微生物菌剂存在功能有限、适应能力差等问题。将不同功能菌株组合得到比单一微生物菌剂促生能力更强、更稳定的微生物复合菌剂，是微生物菌剂发展的趋势。近年来国内外已经研发了很多具有多功能性、优势互补的微生物复合菌剂。
现有技术中主要的微生物肥料产品共有9个菌剂类品种：根瘤菌剂、固氮菌剂、溶磷菌剂、硅酸盐菌剂、菌根菌剂、光合菌剂、有机物料腐熟剂、微生物菌剂和土壤修复菌剂。缓控释肥、脲酶硝化抑制类氮肥、脲醛类肥料、功能性微生物肥为增值肥料新产品的代表。
随着研究的深入和应用的需要不断扩大新品种开发，微生物肥料现已形成：（1）由豆科作物接种剂向非豆科作物肥料转化；（2）由单一接种剂向复合生物肥转化；（3）由单一菌种向复合菌种转化；（4）由单一功能向多功能转化；
（5）由用无芽胞菌种生产向用有芽胞菌种生产转化等趋势。微生物肥料作为活的微生物制剂，其有益微生物数量和生命活动旺盛与否是质量的关键，是应用效果好坏的关键之一。
但微生物有机肥研究中仍然有一些技术问题没有解决。如微生物肥料产品仍存在效果不稳定、成本和价格都较高及产品质量审核不过关等问题，影响微生物有机肥的进一步应用。
葡萄施肥上存在很多问题，比如施肥时期、施肥方式和肥料种类的选择。由于果农施肥存在重化肥轻有机肥、酸化严重的土壤继续使用酸性肥料、肥料施用失衡等问题，导致土壤酸化、磷钾过量累积，葡萄产量及品质下降等问题。生物有机肥具有低投入、高产出、原料充足、节约能源、无毒、环保等特点，不仅可以解决葡萄种植过程中过量使用化肥造成的土壤富营养化、板结、益溃化、生物功能退化的问题，提高肥料的利用率，有较高的生态效益，还能够有效协调葡萄营养生长和生殖生长，加快葡萄生长速率，提高抗病害、抗寒能力，促进葡萄提早成熟，提高延后栽培葡萄的品质。因此，开展生物有机肥田间试验，验证其在葡萄产量和品质方面的效果，进而形成技术集成进行推广、示范，对促进葡萄产业绿色、优质、高产、高效发展具有重要意义。
根际土壤细菌在养分循环、有机质分解、土壤团聚体稳定、与植物的共生和致病相互作用等方面发挥着重要作用。根际土壤细菌能够促进葡萄养分吸收、激素产生以及预防疾病和害虫，从而实现提高葡萄产量以及葡萄种植系统可持续性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过重构葡萄种植根际土壤细菌群落提供一种葡萄专用微生物菌肥，为葡萄种植提供养分，提高葡萄产量。
本发明中，“微生物菌肥”也称为“生物有机肥”，指特定功能微生物与主要以动植物残体（如畜禽粪便、农作物秸秆等）为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。
一方面，本发明提供了一种微生物组合物。
所述的微生物组合物中包括活菌比例为2-7：2-7：1-5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的微生物组合物中包括活菌比例为3-7：3-7：1-5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的微生物组合物中包括活菌比例为2-5：2-5：1-4的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的活菌组合物中包括活菌比例为2：2：1的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
另一方面，本发明提供了前述的微生物组合物在制备微生物菌肥中的应用。
所述的微生物菌肥可以是液态菌肥，也可以是固态菌肥。
当所述的微生物菌肥为液态菌肥时，所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2×108CFU/mL，优选为5×108-5×109CFU/mL，进一步优选为7.5×108CFU/mL。
所述的液态菌肥中包括活菌比例为3-7：3-7：1-5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的液态菌肥中包括活菌比例为6-7：4-6：3-4的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
当所述的微生物菌肥为固态菌肥时，所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2×108CFU/g，优选为5×108-5×109CFU/g，进一步优选为5×108CFU/g或3.68×109CFU/g。
所述的固态菌肥中，包括活菌比例为2-5：2-5：1-4的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的固态菌肥中，包括活菌比例为3-5：3-4：2-3的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌。
优选地，所述的液态菌肥中包括：解淀粉芽孢杆菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，紫色变异链霉菌0.5×108-2.5×108CFU/mL。
进一步优选地，所述的液态菌肥中包括：解淀粉芽孢杆菌3×108-3.5×108CFU/mL，荧光假单胞菌2×108-3×108CFU/mL，紫色变异链霉菌1.5×108-2×108CFU/mL。
优选地，所述的固态菌肥中包括：解淀粉芽孢杆菌1.0×108-2.5×108CFU/g，荧光假单胞菌1.0×108-2.5×108CFU/g，紫色变异链霉菌0.5×108-2.0×108CFU/g。
进一步优选地，所述的固态菌肥中包括：解淀粉芽孢杆菌1.5×108-2.5×108CFU/g，荧光假单胞菌1.5×108-2×108CFU/g，紫色变异链霉菌1×108-1.5×108CFU/g。
进一步优选地，所述的固态菌肥中还包括基料。
所述的基料包括但不限于：经过粗加工的农作物秸秆或麸皮。
所述的固态菌肥可以通过前述液态菌肥混合所述基料进行制备，也可以通过直接接种于所述基料进行制备。
优选地，所述的微生物菌肥可以是葡萄用微生物菌肥。
所述微生物菌肥的制备方法中包括培养前述的微生物组合物。
所述微生物组合物的培养可以是分开培养方式，也可以是共同培养，凡能够达到最终菌含量和活菌比例的方法均在本发明方案可实现范围内。
优选地，所述微生物菌肥的制备方法中至少包括：
将前述的微生物组合物的三种菌分别接种于培养基进行发酵以制备含单菌的菌肥，将含单菌的菌肥按活菌比例进行复配制成复合菌肥。
所述的培养基包括但不限于LB培养基，或者可以是本领域常用的其他能够培养细菌的培养基，能够实现培养效果均可。
优选地，当所述的微生物菌肥为液态菌肥时，所述的培养基可以是LB培养基。
优选地，当所述的微生物菌肥为固态菌肥时，所述的培养基可以是麸皮培养基。
进一步优选地，所述液态菌肥的制备方法可以包括：在无菌条件下，将荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、紫色变异链霉菌分别接种于LB培养基，在28-37℃条件下恒温培养24-36h；将培养后的菌悬液按一定体积比混合均匀得液态菌肥。
进一步优选地，所述固态肥的制备方法可以包括：将基料粉碎成粗粉作为赋形剂；将所述赋形剂和前述的液态菌肥按体积比为1.5-2：1进行混合，用基料吸附菌液，向混合物中加水并混合均匀获得含水量为30％-50％的混合物，同时使温度达到30-40℃。
所述的微生物菌肥还可以经过发酵。具体地，可以是将单菌活化后接种于基料中进行发酵，发酵产物按照活菌比例为2-7：2-7：1-5进行复配得到微生物菌肥。
优选地，所述的发酵产物按照活菌比例为2：2：1进行复配得到微生物菌肥。
本发明同时提供了含有前述的微生物组合物的微生物菌肥。
本发明的有益效果：
（1）本发明制备的微生物菌肥具有杀虫、分泌抗生素和植物生长调节物质等生物防治作用，可以改善根际土壤微环境，减少作物病虫害的发生；
（2）本发明制备的微生物菌肥可明显增强土壤肥力，可以减少化肥用量，缓解因长期施用化肥造成的土壤板结现象，进而改善土壤结构，且无任何污染，符合当代人们追求的绿色生活理念；
（3）荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、紫色变异链霉菌三种菌作为葡萄菌肥添加物以拮抗葡萄的生长过程中的病原菌，提高葡萄产量和品质，进而形成技术集成进行推广、示范，促进葡萄产业绿色、优质、高产、高效发展。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的菌株均为现有菌株，其中：
解淀粉芽孢杆菌来源为无锡酶制剂厂，资源归类编码15131311101；
荧光假单胞菌来源为中国农业科学院生物技术研究所，资源归类编码15131134101；
紫色变异链霉菌来源于甘肃省科学院生物研究所，资源归类编码15131517101，原始编号：LJ3。
如无特别说明，各菌株的培养基配方如下：
紫色变异链霉菌
培养基编号：CM0017；
培养基名称：综合PDA琼脂(Synthetic Potato Medium)；
培养基成分：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B10.008g/L，琼脂 15.0g，pH6.0。马铃薯提取液制备方法：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，水补足至1.0L。
培养温度：28℃；
需氧类型：好氧。
荧光假单胞菌
培养基编号：CM0002；
培养基名称：营养肉汁琼脂；
培养基成分：
蛋白胨5.0g，牛肉浸取物（广东环凯微生物 牛肉浸膏 BR 500g）3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。推荐使用商品化成品培养基。
培养温度：28℃；
需氧类型：好氧。
解淀粉芽孢杆菌
培养基：牛肉浸液1.0L，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0-25.0g，pH7.2-7.4。牛肉浸液的制备：瘦牛肉洗净，切碎，称取550克浸泡于1375mL水中，浸泡一夜，过滤，滤液分装后0.6kg/cm2灭菌40min后备用。
培养温度：最适生长温度28-32℃，最高生长温度45℃。
需氧类型：好氧。
实施例1
本实施例提供了具有杀菌功能的液态菌肥。
所述液态菌肥中菌的组成包括解淀粉芽孢杆菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，紫色变异链霉菌0.5×108-2.5×108CFU/mL。
液态菌肥的制备方法是：在无菌条件下，将荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、紫色变异链霉菌分别接种于LB培养基，在28-37℃条件下恒温培养24-36h；将培养后的菌悬液按一定体积比混合均匀，使最终的浓度为：解淀粉芽孢杆菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×108-3.5×108CFU/mL，紫色变异链霉菌0.5×108-2.5×108CFU/mL。
本实施例提供了以下几种活菌含量（CFU/mL）的液态菌肥：
实施例2
本实施例提供了具有杀菌功能的固态菌肥。
所述固态菌肥中细菌组成为：解淀粉芽孢杆菌1.0-2.5×108CFU/g，荧光假单胞菌1.0-2.5×108CFU/g，紫色变异链霉菌0.5-2.0×108CFU/g。
固态菌肥的制备方法是：将基料粉碎成粗粉作为赋形剂；将所述赋形剂和扩大培养的葡萄根际土壤细菌群落各核心菌属菌株混合液按体积比为1.5-2.0：1进行混合，用基料吸附菌液，向混合物中加水并混合均匀获得含水量为30％-50％的混合物，温度维持30-40℃。
所述基料为经过粗加工的农作物秸秆或麸皮。将基料和菌液搅拌均匀后进一步粉碎过筛、造粒、包装即得。
本实施例提供了以下几种活菌含量（CFU/g）的固态菌肥：
实施例3
本实施例提供了经过发酵的复合菌肥。
解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌、紫色变异链霉菌分别接种于LB培养基平板上活化12 h，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，于37℃、180r·min-1振荡培养12 h，即为种子液。将种子液按5%接种量接种于麸皮培养基中，37℃曲盘发酵48 h后干燥，将三种菌肥按2：2︰1混合制成复合菌肥。将菌肥适当稀释后，用平板计数法测得复合菌肥的活菌数为3.68×109CFU·g-1。
实验例1病原菌拮抗实验
通过文献查得葡萄易感菌种，所用的病原菌有4种：层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、青枯菌（Ralstonia solanacearum），具体来源如下：
①层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）：
资源归类编码：15151916102；
来源：西北农林科技大学动物医学院；
收藏时间：2011.4.29；
②炭疽菌（Colletotrichum spp.）：
资源归类编码 15151528101；
来源：山东省果树研究所转中国林科院森环森保所；
收藏时间：2003-8-10；
③灰霉菌（Botrytis cinerea）：购自上海保藏生物技术中心，编号ATCC 58025；
④青枯菌（Ralstonia solanacearum）：购自上海鲁微科技有限公司，编号：1.1619，原始编号：XZqK2。
将在PDA平板上培养7d的病原菌用无菌打孔器打取直径为6 mm的菌饼接种于新的PDA平板中央，在距离病原菌菌块2 cm处的4个对接点接种待测菌液，设置对照不接种待测菌株，具体分组如下：
1）待测菌液为解淀粉芽孢杆菌LB培养液（7.5×108CFU/mL），接种量为2mL；
2）待测菌液为荧光假单胞菌LB培养液（7.5×108CFU/mL），接种量为2mL；
3）待测菌液为紫色变异链霉菌LB培养液（7.5×108CFU/mL），接种量为3mL；
4）待测菌液为实施例1中的菌肥（3种分别设置），接种量为2mL；
每组处理重复3次，28℃培养。10 d后用游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌率（%）=[（对照菌落直径–处理菌直径）/对照菌落直径]×100%。选取少量病原真菌菌丝，放在滴有纯化水的载玻片上，轻轻将菌丝展开，盖上盖玻片，滤纸吸取多余水分，油镜观察拮抗菌对病原菌菌丝的影响。
拮抗实验抑菌率结果：
三株细菌的复合菌肥拮抗效果更好。
拮抗实验对病原真菌菌丝的抑制效果：
抗真菌物质发挥作用一般通过破坏真菌细胞的外层保护（如水解细胞壁，使其通透性增加）、破坏细胞膜、抑制DNA合成3种形式引起病原菌细胞的死亡。在拮抗培养中，拮抗菌与病原菌菌落从未接触，而病原菌靠近拮抗菌菌落的边缘部分出现萎缩现象。镜检结果也显示，正常生长的病原真菌菌丝粗细均匀一致，粗壮，光滑，生长端菌丝舒展。而受到拮抗菌作用病原真菌菌丝，有的细胞壁被溶解；有的打结，发生波浪形扭曲、畸变；有的生长端分枝明显增多、分枝间隔变短，菌丝扭曲；有的生长边缘呈珊瑚状，并且有的菌丝断裂，在断裂处出现了明显的球状膨大现象；有的菌丝因细胞壁被消解而变得透明，还有些菌丝变细、变暗，原生质浓缩。这说明此三种菌株能够产生抗真菌物质。
复合拮抗菌株经平板连续培养10代，仍表现出较强的拮抗效果，没有明显的弱化特征，说明其具有作为生防菌剂的潜质。
实验例2平邑甜茶盆栽试验
2022年3-9月取山东省烟台市农科院葡萄园连作土，土壤pH 6.37，有机质含量为23.65 g·kg-1，全氮含量为1.63 g·kg-1，有效磷含量为88.97 mg·kg-1，速效钾含量为305mg·kg-1，解钾氮65.71 mg·kg-1。收集于距主干1m，深5-40 cm范围内，多点取样，混匀使用。
设置以下分组：
连作土对照（空白对照）：使用上述连作土直接培养；
溴甲烷熏蒸处理：连作土经溴甲烷熏蒸；
菌肥载体（麸皮）处理：连作土中添加麸皮，添加量为土壤质量的1%；
菌肥处理：连作土中添加实施例3制备的菌肥，添加量为土壤质量的1%。
菌肥和载体的使用量均为土壤质量的1%，每个处理21盆，每盆定植平邑甜茶幼苗2株。培养四个月。
（1）生物量的测定：采用游标卡尺测定每个处理组所有幼苗的株高和地径；选取具有代表性的幼苗用根系扫描仪测量根长；用百分天平测量地上部鲜质量、地下部鲜质量、地上部干质量、地下部干质量。
（2）土壤酶的测定：每个处理去掉表层土和盆周围的土，分别过筛装入封口袋，用于土壤酶的测定。脲酶活性用苯酚钠比色法测定，以37℃恒温培养24 h后1g土壤中释放的铵态氮的毫克数表示（mg·g-1）。过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法测定，以1g土壤消耗0.1 mol·L-1高锰酸钾溶液的毫升数表示（m L·g-1）。磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，以37℃恒温培养24 h后1 g土壤中释放的酚的毫克数表示（mg·g-1）。蔗糖酶活性采用3, 5–二硝基水杨酸比色法测定，以37℃恒温培养24 h后1g土壤中生成的葡萄糖的毫克数表示（mg·g-1）。
（3）根系酶活性测定：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）提取。SOD活性的测定用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法，以每g鲜叶抑制NBT光化还原50%为1个酶活性单位（U·g-1FW)；POD活性的测定按Omran方法，CAT活性测定用紫外分光光度法。POD和CAT的酶活单位（U）定义为每g鲜样每min使OD470nm和OD240nm降低0.1个A值所需的酶量。
试验数据通过SPSS进行方差分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检测。
结果分析：
（1）与未经任何处理的连作土（对照）相比，连作土经溴甲烷熏蒸、菌肥载体（麸皮）和菌肥处理后，平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜样质量和干样质量均有增加；连作土经溴甲烷熏蒸处理比未经任何处理的对照组也增加，但菌肥处理增加量低于连作土经溴甲烷熏蒸处理增加量，说明菌肥处理效果不及溴甲烷熏蒸处理；菌肥载体（麸皮）处理与未经任何处理的相比差异不显著，排除了菌肥载体的影响，以上结果说明三种菌株具有促进植物生长的作用。具体数据见下表：
注：表格中a、b、c、d表示显著性差异水平，具不同标记字母的即为差异显著。
（2）复合菌肥对平邑甜茶幼苗根系酶活性的影响
对根系酶活的测定结果表明，溴甲烷熏蒸处理、菌肥载体和菌肥处理组中平邑甜茶幼苗的根系酶SOD、POD和CAT的活性较对照组均显著增加。其中经溴甲烷熏蒸处理的酶活性分别比对照增加了151.20%、457.02%和103.64%；菌肥载体处理的SOD、POD和CAT的活性分别比对照增加了30.19%、129.60%和20.76%；菌肥处理分别比对照增加了64.59%、230.25%和51.13%。但菌肥处理与菌肥载体处理相比SOD、POD和CAT的活性显著提高了26.42%、43.84%和25.15%，说明复合菌肥能够增强植物的根系酶活性。具体数据如下：
注：表格中a、b、c、d表示显著性差异水平，具不同标记字母的即为差异显著。
（3）复合菌肥对土壤酶活性的影响
溴甲烷熏蒸处理、菌肥载体和菌肥处理均能够提高土壤酶的活性。其中溴甲烷熏蒸处理土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶分别比对照增加了36.28%、7.46%、7.27%和40.54%；菌肥载体处理分别比对照增加了70.82%、32.84%、16.36%和78.38%；菌肥处理分别比对照增加了132.02%、56.72%、58.18%和145.95%。菌肥处理比溴甲烷熏蒸处理酶活提高了70.25%、45.83%、47.46%和75.00%，差异显著。证明三种拮抗菌可提高土壤酶活性，改善土壤环境。具体数据见下表：
注：表格中a、b、c、d表示显著性差异水平，具不同标记字母的即为差异显著，具相同标记字母的即为差异不显著，ab表示与a和b都不具有显著性差异。
现有防治植物病害的拮抗菌绝大部分从土壤（如植物根际土壤）分离，向种植土壤中回施这些有益菌可以在一定程度上改变微生物群体平衡，增加植物根系酶和土壤酶的活性，抑制土壤中病原菌的生长并促进植物的生长发育。但这些来源于土壤的拮抗菌易受外界条件影响，防病效果不稳定，无法达到持续防治的效果。针对以上问题，本发明研究结果对利用根际微生物菌肥防治葡萄连作障碍，促进葡萄产业健康发展具有重要意义。
土壤酶活性是土壤生物学活性的表现，也是衡量土壤肥力的一项重要指标。脲酶是一种专属性很强的水解酶，能催化酰胺化合物水解为氨，有利于土壤中稳定性较高的有机氮向有效态氮转化；磷酸酶活性的增加可加速土壤有机磷的脱磷速度，改善土壤磷素的供应水平。过氧化氢酶作为土壤中重要的一种氧化还原酶，能将土壤中过氧化氢分解，使作物免遭毒害，对作物的生长有着重要的影响。土壤蔗糖酶与土壤中有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度有关，其酶促作用产物直接关系到作物的生长，过氧化氢酶活性与土壤微生物呼吸量和总生物量有关。在菌肥处理后，能够显著提高土壤酶活，说明内生菌菌肥能增强土壤有效成分的转化利用率，使植物易于利用。已有研究发现植物内生菌具有固氮、溶磷解钾、产铁载体等作用，从而提高土壤酶活，提高土壤可利用养分，同时内生菌还会产生生长素等促生物质，促进作物生长。
实验例3复合菌肥对葡萄种植的影响
2022年3-9月，山东省烟台市农科院葡萄园连作土种植的葡萄进行复合菌肥实验，土壤条件：pH 6.37，有机质含量为23.65 g·kg-1，全氮含量为1.63 g·kg-1，有效磷含量为88.97 mg·kg-1，速效钾含量为305 mg·kg-1，解钾氮65.71 mg·kg-1。
设置实验组和对照组，对照组正常种植，实验组葡萄品种包括：酿酒葡萄(马瑟兰、黑虎香)和鲜食葡萄(摩尔多瓦、玫瑰香、阳光玫瑰)。
对照处理，基肥施用普通商品有机肥9 t·hm-2,51%复合肥225 kg·hm-2,追肥分别在3月份追施45%复合肥300 kg·hm-2,5月份追施51%复合肥300 kg·hm-2,7月追施硫酸钾肥450 kg·hm-2；
实验组复合菌肥具体施用方法为以实施例3制备的复合菌肥为底肥，基肥施用生物有机肥6 t·hm-2,51%复合肥202.5 kg·hm-2,追肥分别在3月份追施45%复合肥270 kg·hm-2、实施例1中1-1组的液态菌肥（微生物制剂）15 L·hm-2,5月追施51%复合肥270 kg·hm-2、实施例1中1-1组的液态菌肥（微生物制剂）15 L·hm-2,7月追施硫酸钾肥255 kg·hm-2、实施例1中1-1组的液态菌肥（微生物制剂）15 L·hm-2。除施肥外，其他管理措施相同。
在7月中下旬，对照组有大量的叶片发黄，出现炭疽病，且烂果较多，而施用菌肥的实验组病害程度相对轻很多，葡萄果实丰满，烂果现象较少。究其原因，是由于菌肥组采用生物有机肥作底肥，并分3次追施微生物制剂，生物有机肥和微生物菌肥中含有功能菌解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌，具有抗病促生作用。研究表明，解淀粉芽孢杆菌在生长过程中通过与病原菌竞争营养和侵染位点、分泌抗菌物质和诱导植物产生系统抗病性来达到生物防治目的。另有研究发现，解淀粉芽孢杆菌还可通过分泌植物生长激素、溶磷固氮作用和促进植物营养功能等不同方式对植物产生促生作用。本试验中未施用生物有机肥的葡萄发病情况较施用生物有机肥组严重，施用生物有机肥的植株抗病性较强，可能是肥料中的微生物提高了植物的抗病性。
实验例4杀虫实验
本实验研究葡萄施用生物菌肥部分替代化学农药对防治虫害的发生有何影响。综合评估土壤施用生物菌肥对预防虫害的效果，对于化肥减量控害具有非常现实的意义。
（1）试验地概况：
本试验在山东省烟台市农科院葡萄园种植地进行，以山东烟台地区酿酒葡萄马瑟兰为实验对象，南北行向，植株采用单干双臂整形，葡萄发芽期为4月初，果实收获期是10月上中旬。
（2）供试材料：
0.1mol/L酚酞指示试剂、0.1mol/L氢氧化钠标准溶液浓硫酸（比重1.84）、蒽酮试剂、0.5mol/L的标准葡萄糖溶液、福林-丹尼斯试剂、碳酸钠饱和溶液、0.1mol/L HCl溶液。
（3）试验方法：
设常规化学（CT）、空白对照（CK）、菌剂1-1+CT（菌剂组1）、菌剂1-2+CT（菌剂组2）、菌剂1-3+CT（菌剂组3）共计五个处理组，每个处理重复三次。菌剂处理组均进行树体喷雾13次；CT组进行树体喷雾12次；空白对照不做喷雾处理。具体见表1，其中菌剂组以菌剂组1为例，菌剂组2和菌剂组3具体施用参照菌剂组1，差别在于将菌剂1-1各自替换为菌剂1-2和菌剂1-3。
表1 菌剂和肥料使用方法
（4）绿盲蝽防治效果结果及分析：
不同肥料施用模式对绿盲蝽虫害效果的影响见表2：
表2
注1：表格中a、b、c、d表示显著性差异水平，具不同标记字母的即为差异显著。
注2：绿盲蝽虫害调查主要针对果实虫害，调查方法：每处理随机选择两棵树，并从上至下调查每棵树的所有果实上的害虫，并进行害虫识别和统计。根据以下方法记录虫害指数。
果实虫害分级标准：0级：未受害；1级：全穗果粒25%以下受害；2级：全穗果粒25%-50%受害；3级：全穗果粒50%以上受害；虫情指数=∑（各级虫数×各级代表值）/（调查总虫数×最高级代表值）。
由表2可知，从7月25日调查结果来看，菌剂组1的绿盲蝽防治效果与常规化学处理组相比呈现显著性差异，防治效果增加了47.2%；从8月15日调查结果看，菌剂组1、菌剂组2和菌剂组3与CT组相比均表现出显著性差异，且菌剂组1防虫效果与菌剂组2和菌剂组3相比更好；从8月31日和9月15日调查结果看，三组绿盲蝽防治效果与常规化学处理组相比无显著差异。
（5）农药使用成本分析
酿酒葡萄马瑟兰在整个生长发育期，从试验结果上来看，化学处理667m2用药共3.19kg，硫酸铜1.25kg，用药成本为309元；菌剂组667m2用药共4.05kg，用药成本243元，在不计节省的劳动成本情况下，菌剂处理组施药成本比常规化学处理组显著降低。从酿酒葡萄马瑟兰病虫害调查结果看，菌剂对绿盲蝽防治效果有显著性差异，说明菌剂代替部分化学药剂施药模式不仅能达到减少化学药剂用量的目的，还能更好地防治病虫害。在葡萄整个生长过程中，菌剂部分替代化学农药的施药模式可有效减少化学农药使用量，节约种植成本。
Claims (9)
1.一种微生物组合物在制备微生物菌肥中的应用，其特征在于，所述的微生物组合物由活菌比例为2-7：2-7：1-5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌组成；所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2×108CFU/g或2×108CFU/mL，所述的微生物菌肥为葡萄用微生物菌肥；
所述的解淀粉芽孢杆菌来源为无锡酶制剂厂，资源归类编码15131311101；
所述的荧光假单胞菌来源为中国农业科学院生物技术研究所，资源归类编码15131134101；
紫色变异链霉菌来源于甘肃省科学院生物研究所，资源归类编码15131517101，原始编号：LJ3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，由活菌比例为3-7：3-7：1-5或2-5：2-5：1-4的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌组成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，由活菌比例为2：2：1的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌组成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌肥中总活菌数为5×108-5×109CFU/g或5×108-5×109CFU/mL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌肥中总活菌数为5×108CFU/g或3.68×109CFU/g。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌肥中总活菌数为7.5×108CFU/g。
7.包括一种微生物组合物的葡萄用微生物菌肥，其特征在于，所述的微生物组合物由活菌比例为2-7：2-7：1-5的解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌和紫色变异链霉菌组成；所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2×108CFU/g或2×108CFU/mL；
所述的解淀粉芽孢杆菌来源为无锡酶制剂厂，资源归类编码15131311101；
所述的荧光假单胞菌来源为中国农业科学院生物技术研究所，资源归类编码15131134101；
紫色变异链霉菌来源于甘肃省科学院生物研究所，资源归类编码15131517101，原始编号：LJ3。
8.根据权利要求7所述的微生物菌肥，其特征在于，制备方法中包括将所述的微生物组合物的三种菌分别接种于培养基进行发酵以制备含单菌的菌肥，将含单菌的菌肥按活菌比例进行复配制成复合菌肥。
9.根据权利要求8所述的微生物菌肥，其特征在于，所述的培养基为LB培养基、畜禽粪便、农作物秸秆、麸皮培养基中的任意一种或多种。
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