CN109569546B - 一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法及应用 - Google Patents

一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：在二氧化硅包覆的磁性纳米粒子中加入甲苯，再加入GLYMO，回流搅拌反应，得到表面改性的磁性纳米粒子；然后将得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入醇类溶剂，得到溶解有磁性纳米粒子的醇溶液；然后将螯合配基和NaBH4溶于Na2CO3溶液中，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的醇溶液，30℃下反应；最后在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入金属离子溶液，搅拌、进行磁分离后，得螯合金属磁性纳米颗粒。本发明一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，反应工艺简单，条件易控，无需特殊的反应器，适合于规模化生产。

Description

一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制 备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及的是一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备及应用。
背景技术
蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等，能与多种金属离子(Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等)发生特殊的相互作用，这些作用包括配位结合、静电吸附以及共价键结合，其中以配位结合为主，而这其中又以组氨酸标签(His-tag)成为蛋白纯化的首选标签。因此，在重组蛋白末端融合数目从4-10个不等的成串组氨酸肽段，凭借其与二价金属离子的螯合作用，从而利用亲和作用纯化蛋白成为最常用的重组蛋白表达纯化方法。标签长度及暴露程度常影响标签与金属离子的相互作用，常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，根据实际情况可控制组氨酸。
金属螯合亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)，为His-Tag纯化标签的重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。目前，IMAC技术多采用琼脂糖或者葡聚糖微珠等天然大分子聚合物作为固相载体支持物，通过化学交联反应将亚氨基二乙酸(IDA)，氨三乙酸(NTA)，羧甲基天冬氨酸 (CM-ASP)等配基固定在聚合物载体上，然后将固定了配基的微珠填充到柱子中形成亲和层析柱，进行蛋白纯化前再将柱内的填料微珠与铜、镍、钴等离子螯合形成IMAC，进而完成纯化步骤。
由于传统的金属螯合亲合层析柱为柱式结构，需要将待分离粗蛋白液中的细胞碎片、杂质颗粒等离心除去后才能进行上样纯化分离操作。此外，过高的上样速度与压力可能破坏琼脂糖等载体微球，进而导致填料柱塌缩。磁性纳米粒子作为一种新型的介质，利用其在磁场下可快速分离的特点，通过在磁珠表面螯合金属离子，进而将其用于 His-Tag蛋白的纯化，具有速度快、容易放大、可自动化操作等诸多优点。研究者采用磁性微球替代琼脂糖等填料珠作为IMAC的固相载体支持物，将金属离子固定到磁性微球表面，进而采用外磁场操控磁性微球实现分离与纯化过程。琼脂糖微球的制备及将其作为IMAC介质的修饰工艺已经较为成熟，只需在制备琼脂糖微球的过程中整合磁性纳米粒子即可制备磁性IMAC微球，制得的微球一般为25～120微米尺寸范围。中国发明“用于组氨酸标签蛋白纯化的磁性微球及其制备和应用方法”(专利号CN201010109426.2)，其中磁性微球包括：四氧化三铁纳米颗粒50wt％～80wt％，氧化硅壳层40wt％～15wt％，通过在硅层修饰氨基，通过交联剂交联超支化聚合物，进而采用丁二酸酐羧基化，获得表面含大量羧基的磁性纳米粒子，进而吸附金属离子，用于组氨酸标签蛋白纯化。该方法制备过程复杂，且表面羧基位置不可控，因而以何种形式与金属离子配位不可控，所吸附的金属离子对各种缓冲体系的耐受性均有待探讨。
以二氧化硅包覆磁性纳米颗粒，进而在表面螯合金属离子，是制备磁性IMAC纳米颗粒的另一种方法。因为二氧化硅对蛋白的非特异性吸附较小，因而吸附的杂蛋白较少，便于在洗涤过程中洗去大部分杂蛋白，使洗脱时目标蛋白纯度大大提高。在二氧化硅磁性纳米颗粒表面螯合最常用的亚氨基二乙酸(IDA)和氨三乙酸(NTA)配基制备IMAC磁珠是最为有效和现实的选择。Qian Ni等在期刊Biomed. Chromatogr.2016；30:566–573发表题为”Preparation of core–shell structure Fe3O4@SiO2superparamagnetic microspheresimmobilized with iminodiacetic acid as immobilized metal ion affinityadsorbents for His-tag protein purification”的论文。Kouroush Salimi等在期刊RSCAdv.,2017,7,8718发表题为“Highly selective magnetic affinity purification ofhistidine-tagged proteins by Ni2+carrying monodisperse composite microspheres“的论文。这两篇论文均通过3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)与亚氨基二乙酸(IDA)在pH＝11碱性条件下，在0℃和60℃交替反应24h制备IDA–GLYMO，然后在 pH＝3酸性条件和95℃下将IDA–GLYMO偶联到二氧化硅包覆的磁珠表面，进而通过IDA螯合Ni2+制备IMAC磁珠。该过程需先制备 IDA–GLYMO，需要特殊的反应器严格控温并缓慢滴加GLYMO，整个过程控制复杂，不易放大；且传统方法中ID A和环氧基反应所处的强碱性水溶液环境对磁珠二氧化硅层的腐蚀严重，难以在二氧化硅表面直接修饰ID A，因而不得不将ID A与硅烷偶联剂GLYMO先反应生成新的硅烷偶联剂IDA–GLYMO，然后再偶联到硅基磁珠，此外生成的IDA–GLYMO粘稠，不利于磁性纳米粒子在IDA–GLYMO 中的分散和耦合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，反应工艺简单，条件易控，无需特殊的反应器，适合于规模化生产。
本发明的目的在于提供由上述制备方法制备得到的螯合金属磁性纳米颗粒应用于组氨酸标签蛋白的纯化。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取10～50g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L 甲苯，加入1～40mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应12～24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入1～10L醇类溶剂，得到溶解有磁性纳米粒子的醇溶液；
步骤3、将30～120g的螯合配基和1～6g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2 中得到的溶解有磁性纳米粒子的醇溶液，在20～40℃下反应12～48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1～2L、浓度为 2M的金属离子溶液，搅拌2～4h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
步骤2中，所述醇类溶剂采用乙醇、甲醇、正丙醇或异丙醇。
步骤3中，所述螯合配基采用亚氨基二乙酸(IDA)、N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸(ANTA)或N-羧甲基天冬氨酸(CM-ASP)。
步骤4中，所述金属离子溶液为Cu2+溶液、Zn2+溶液、Ni2+溶液或Co2+溶液。
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法制备得到的螯合金属磁性纳米颗粒应用于组氨酸标签蛋白的纯化。
采用上述技术方案后，本发明一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，在反应体系中引入醇类溶剂，既保证螯合配基在醇/水体系有一定的溶解度，能够在碱性条件下与磁珠表面的环氧基团反应，又通过醇类溶剂的引入，大大抑制了磁性纳米粒子表面二氧化硅层的水解脱落，克服了碱性水体系反应过程中二氧化硅层水解脱落的问题，因而可直接将螯合配基修饰到二氧化硅包覆的磁性纳米粒子的表面，从而达到宏量制备单分散、强磁场响应性的核壳结构的硅基IMAC磁性纳米颗粒的目的。本发明所提供的制备方法简便，条件易控，克服了传统方法较为复杂，过程难以控制的缺陷，原料易得、工艺简单、易于放大生产，因而具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
实施例1
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入6L乙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液；
步骤3、将60g的IDA和3g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液，在30℃下反应36h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Ni2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例2
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取10g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入1mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 12h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入1L乙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液；
步骤3、将30g的IDA和6g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液，在20℃下反应48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Ni2+溶液，搅拌4h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例3
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取50g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入40mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 12h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入10L乙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液；
步骤3、将120g的IDA和6g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液，在30℃下反应48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Co2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例4
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入5L甲醇，得到溶解有磁性纳米粒子的甲醇溶液；
步骤3、将30g的IDA和1g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的甲醇溶液，在40℃下反应48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Ni2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例5
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入6L异丙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的异丙醇溶液；
步骤3、将120g的ANTA和3g的NaBH4溶于1L、浓度为2M 的Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的异丙醇溶液，在30℃下反应36h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Cu2+溶液，搅拌4h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例6
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入6L乙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液；
步骤3、将60g的ANTA和6g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液，在30℃下反应48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入2L、浓度为2M 的Ni2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例7
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入40mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 12h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入10L正丙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的正丙醇溶液；
步骤3、将30g的CM-ASP和1g的NaBH4溶于1L、浓度为2M 的Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的正丙醇溶液，在30℃下反应48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Zn2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例8
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入6L乙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液；
步骤3、将60g的CM-ASP和3g的NaBH4溶于1L、浓度为2M 的Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的乙醇溶液，在30℃下反应36h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Co2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
实施例9
一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、称取20g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入20mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应 24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入10L异丙醇，得到溶解有磁性纳米粒子的异丙醇溶液；
步骤3、将60g的IDA和3g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的 Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的异丙醇溶液，在30℃下反应36h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1L、浓度为2M 的Cu2+溶液，搅拌2h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
以上实施例中，二氧化硅包覆的磁性纳米粒子为市面上可购买得到的药品，可由河南惠尔纳米科技有限公司、厦门普睿迈格生物科技有限公司、阿拉丁商城、上海生工有限公司等地购买得到。
应用例
步骤1、将带有六个组氨酸标签的绿色荧光蛋白(6his-EGFP) 的重组大肠杆菌经培养诱导表达后，取发酵液100mL离心，收集菌体；
步骤2、加入5mL配方如表1的结合缓冲液，超声破碎上述菌体，离心收集上清粗酶液；
步骤3、向上清粗酶液中加入上述各实施例中制备的螯合金属磁性纳米颗粒100mg，4℃孵育1小时，磁分离，去除上清液，得到磁珠；
步骤4、向步骤3的磁珠中加入10mL配方如表1的清洗缓冲液，震荡洗涤孵育10分钟，磁分离，去除上清液；
步骤5、向步骤4得到的磁珠中加入1mL配方如表1的洗脱缓冲液，震荡洗涤孵育1h，磁分离，收集上清液，即得到纯化后的带有六个组氨酸标签的绿色荧光蛋白，经电泳验证为单一条带，表明制备的螯合金属磁性纳米颗粒可应用于组氨酸标签蛋白的分离纯化。
表1组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方
Figure BDA0001874055590000121
上述实施例并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (5)

1.一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、称取10～50g二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，加入1L甲苯，加入1～40mL的3-缩水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷，80℃回流搅拌反应12～24h，得到表面改性的磁性纳米粒子；
步骤2、将步骤1中得到的表面改性的磁性纳米粒子进行磁分离，去除上清液后，再加入1～10L醇类溶剂，得到溶解有磁性纳米粒子的醇溶液；
步骤3、将30～120g的螯合配基和1～6g的NaBH4溶于1L、浓度为2M的Na2CO3溶液中，完全溶解后倒入三口烧瓶，加入步骤2中得到的溶解有磁性纳米粒子的醇溶液，在20～40℃下反应12～48h，以去离子水将磁性纳米粒子洗至中性；
步骤4、在步骤3中得到的磁性纳米粒子中加入1～2L、浓度为2M的金属离子溶液，搅拌2～4h，进行磁分离后，收集磁性纳米粒子，即得螯合金属磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述醇类溶剂采用乙醇、甲醇、正丙醇或异丙醇。
3.根据权利要求1所述的一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述螯合配基采用亚氨基二乙酸、N,N-双(羧甲基)-L-赖氨酸或N-羧甲基天冬氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤4中，所述金属离子溶液为Cu2+溶液、Zn2+溶液、Ni2+溶液或Co2+溶液。
5.根据权利要求1所述的一种用于组氨酸标签蛋白纯化的螯合金属磁性纳米颗粒的制备方法制备得到的螯合金属磁性纳米颗粒应用于组氨酸标签蛋白的纯化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111167409B (zh) * 2019-12-04 2021-01-08 甘肃省科学院传感技术研究所 Ni-NTA修饰的二氧化硅包覆四氧化三铁磁性纳米功能组装体的制备方法及应用
CN112044415A (zh) * 2020-09-07 2020-12-08 武汉理工大学 一种金属螯合磁性微珠及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1660206A1 (en) * 2003-09-12 2006-05-31 Promega Corporation Methods and kits for purifying his-tagged proteins
CN104607143A (zh) * 2015-02-06 2015-05-13 大连民族学院 一种铁镍磁性微球、其制备方法及在蛋白质纯化中的应用
CN106492770A (zh) * 2015-09-08 2017-03-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种组氨酸标签蛋白亲和纯化材料及其应用
CN108417337A (zh) * 2018-01-16 2018-08-17 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 一种镍化磁性微球及其制备方法和其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1660206A1 (en) * 2003-09-12 2006-05-31 Promega Corporation Methods and kits for purifying his-tagged proteins
CN104607143A (zh) * 2015-02-06 2015-05-13 大连民族学院 一种铁镍磁性微球、其制备方法及在蛋白质纯化中的应用
CN106492770A (zh) * 2015-09-08 2017-03-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种组氨酸标签蛋白亲和纯化材料及其应用
CN108417337A (zh) * 2018-01-16 2018-08-17 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 一种镍化磁性微球及其制备方法和其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Preparation of core–shell structure Fe3O4@SiO2 superparamagnetic microspheres immoblized with iminodiacetic acid as immobilized metal ion affinity adsorbents for His-tag protein purification;Qian Ni;《Biomedical Chromatography》;20151113;第566-573页 *

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