CN109557154B - 一种丝绸文物的高灵敏度检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及文物检测领域，公开了一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，本发明方法先制备纯净的丝素蛋白粉末，同时提取文物样中的丝素蛋白；在NHS/EDC溶液的作用下利用层层自组装的方法在清理干净的玻碳电极表面依次修饰金纳米颗粒，中空结构的聚丙烯酸‑多巴胺复合物，聚甲基丙烯酸甲酯‑马来酸酐/1‑十八碳烯交替共聚物球形纳米珠，鼠抗丝素蛋白单克隆抗体；利用修饰后的电极分别对丝素蛋白溶液和文物样溶液进行检测。本发明公开的方法，灵敏度高，检测下限低，重现性好，可对丝绸文物进行高灵敏度检测。

Description

一种丝绸文物的高灵敏度检测方法
技术领域
本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种丝绸文物的高灵敏度检测方法。
背景技术
蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，其起源问题一直笼罩在迷雾中。蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、X-射线衍射等，但蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对研究丝绸的起源至关重要。
当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的WesternBlotting或ELISA法，但是这些方法对一些丝素蛋白含量极低的文物样仍然难以进行检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，本发明方法检测下限低，灵敏度高，重现性好，能检测出文物泥化样中含量极低的丝素蛋白。
本发明的具体技术方案为：一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，包括以下步骤：
A）取蚕茧并取出内部的蚕蛹，去除最内层的蛹衬；将所得蚕茧壳加入Na2CO3脱胶液中搅拌，并重复该操作多次以充分除去丝胶；将不溶的丝素用去离子水洗多次，烘干，备用。
B）将烘干的丝素加入蛋白提取液中搅拌溶解；将溶有丝素的蛋白提取液在常温下冷却过滤后，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子，得到纯化的丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液真空冷冻干燥，得到丝素蛋白，研磨成粉末后密封瓶备用。
C）取一根玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0μm、0.3μm、0.05 μm的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤。
D）将洗净的玻碳电极浸泡在0.4-0.6M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化35-45周，循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.08-0.12V/s。
E）配制得到PBS 7.4溶液，称取 K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl，加入PBS 7.4溶液，得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为4.5-5.5 mM的铁氰化钾溶液。
F）分别配制十六烷基三甲基溴化铵溶液、HAuCl4溶液和NaBH4溶液；将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加于离心管中，在震荡作用下向其中加入HAuCl4溶液；再在震荡作用下，快速加入NaBH4溶液，剧烈震荡，静置，得到金纳米颗粒溶液。
本发明制备的金纳米颗粒，用于吸附和负载样品，和传统方法直接在电极表面进行实验相比，金纳米颗粒比表面积大，负载性能更好。
G）按体积比50-70:80-100:8-12将0.15-0.25 mg/mL的聚丙烯酸溶液、1.5-2.5mol/L的氨水和水混合，超声震荡，然后加入异丙醇，搅拌均匀，静置后1-5℃保存。
H）按体积比5-7：8-12：8-12将步骤G）所得溶液、水，和异丙醇混合，随后加入多巴胺溶液，静置，得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物溶液。
本发明合成的聚丙烯酸-多巴胺复合物，具有中空结构，与平面结构相比可以容纳更多的样品，同时其表面有大量氨基存在，便于通过NHS/EDC法与具有羧基的界面偶联。
I）称取质量比为110-130：70-90的聚甲基丙烯酸甲酯和马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，加入三氯甲烷和十二烷基磺酸钠溶液，所得混合液超声震荡，离心，除去上清液，剩余产物用水洗涤多次，得到球形纳米珠，最后加入三氯甲烷中制得溶液，备用。
本发明制备的球形纳米珠，因为其形状和表面含有大量羧基，可通过NHS/EDC法修饰聚丙烯酸-多巴胺复合物上，且结合率较高，同时由于表面羧基存在，能在界面上富集端基为氨基的抗体，较传统的直接滴加抗体的方法，抗体利用效率更高。
J）取步骤D）处理后的玻碳电极，滴加35-45 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于玻碳电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.2-0.3M的巯基丙酸中5-7h，然后彻底洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液浸泡中0.5-1.5h；然后将玻碳电极洗涤后在其表面滴加25-35 μL步骤H）所得溶液，室温干燥后洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min；彻底洗涤后在玻碳电极表面继续滴加25-35μL步骤I）所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min；最后在玻碳电极表面滴加8-12 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体，35-39℃孵育0.5-1.5h。
K）用步骤B）中所得的丝素蛋白配制不同浓度的溶液，滴加15-25 μL于步骤J）处理完的玻碳电极表面，35-39℃孵育0.5-1.5h，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V。
L）称取文物样，用步骤B）中所述蛋白提取液溶解，按步骤K）所用方法测试。
本发明所需文物样极少，在文物稀缺的情况下也能对其进行有效检测，对考古鉴别具有重大意义。
作为优选，步骤A）中，将所得蚕茧壳加入质量分数为0.4%-0.6%的Na2CO3脱胶液中，在浴比为1:45-1:55、温度为98 ± 2 ℃的条件下搅拌20-40min；烘干温度为 55-65 °C。
作为优选，步骤B）中，所述蛋白提取液由摩尔比为1:7-9:1-3的氯化钙、水和乙醇组成；丝素与蛋白提取液的浴比为1:45-1:55，搅拌溶解条件为在98 ± 2 ℃下搅1.5-2.5h；透析期间并每隔3-5 h换一次水，透析时间为60-80 h；真空冷冻干燥时间为60-80 h。
作为优选，步骤C）中，玻碳电极的直径位2-4mm，打磨时间为8-12min；超声洗涤时间为8-12min。
作为优选，步骤F）的具体过程为：取3.6445 g十六烷基三甲基溴化铵于锥形瓶中，加入100 mL水，在35-39℃水浴中搅拌溶解；取2.057mL、10 g/L的HAuCl4于离心管中，加入2.942 mL的水摇匀，遮光保存；按NaBH4与冻水的比例为11.4 mg:30 mL配制0.5-0.7 mLNaBH4溶液；过滤得到8-12 mL十六烷基三甲基溴化铵溶液于离心管中，在震荡作用下向其中加入0.2-0.3 mL的HAuCl4溶液；再在震荡作用下，快速加入0.5-0.7 mL的NaBH4溶液，剧烈震荡1-3 min，20-30℃下静置1.5-2.5 h，得到金纳米颗粒溶液。
作为优选，步骤G）中，超声震荡时间为0.5-1.5h，搅拌时间为0.5-1.5h。
作为优选，步骤H）中，静置温度为45-55℃，静置时间为2-4h。
作为优选，步骤I）中，超声震荡时间为1-3 min，离心速率为8000-12000 rpm，离心时间为8-12min。
作为优选，步骤J）中，所述NHS/EDC溶液中NHS和EDC的摩尔比为0.2-0.4:0.4-0.6。
作为优选，步骤L）中，称取0.01-0.03 g文物样，用1-3 mL步骤B）中所述蛋白提取液溶解。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1、本发明中制备的金纳米颗粒，用于吸附和负载样品，和传统方法直接在电极表面进行实验相比，金纳米颗粒比表面积大，负载性能更好。
2、本发明合成的聚丙烯酸-多巴胺复合物，具有中空结构，与平面结构相比可以容纳更多的样品，同时其表面有大量氨基存在，便于通过NHS/EDC法与具有羧基的界面偶联。
3、本发明制备的球形纳米珠，因为其形状和表面含有大量羧基，可通过NHS/EDC法修饰在中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物上，且结合率较高，同时由于表面羧基存在，能在界面上富集端基为氨基的抗体，较传统的直接滴加抗体的方法，抗体利用效率更高。
4、本发明所需文物样极少，在文物稀缺的情况下也能对其进行有效检测，对考古鉴别具有重大意义。
附图说明
图1为南海一号文物样检测结果图，#1、#2、#8为不同船舱取得的土样；
图2为不同浓度的现代蚕丝样溶液获得的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
A）取5g蚕茧，用剪刀将其剪开取出里面的蚕蛹，去除最内层的蛹衬。将得到的蚕茧壳称重并加入质量分数为0.4%的Na2CO3脱胶液，在浴比为1:45，温度为 98℃的条件下搅拌0.5 h，并重复该操作两次，以充分除去丝胶。将不溶的丝素用去离子水洗五次，并放置于55°C的烘箱烘干过夜，留以备用。
B）将烘干的丝素加入蛋白提取液（氯化钙：水：乙醇的摩尔比为1:8:2），在浴比为1:45，温度为 98 ℃的条件下搅拌溶解1.5 h。将溶有丝素蛋白的提取液在常温下冷却过滤后，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子，并每隔4 h换一次水，72 h后得到较纯的丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥72 h，得到丝素蛋白，研磨成粉末后放入密封瓶保存备用。
C）取一根直径3mm的玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0、0.3、0.05 μm 的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨，打磨时间为10分钟；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤10分钟。
D）将洗净的电极浸泡在0.5 M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化40周，循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.1V/s 。
E）称取0.2 g KCl，0.27 g KH2PO4，8 g NaCl和1.42 g Na2HPO4加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4，得到PBS7.4溶液；称取 K3[Fe(CN)6] 1.646 g、K4[Fe(CN)6] 2.112 g、KCl 7.45 g，加入1000 mLPBS 7.4溶液。得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为5.0 mM的铁氰化钾溶液。
F）取3.6445 g 十六烷基三甲基溴化铵于250mL锥形瓶中，加入100 mL水，在37℃水浴中搅拌溶解；取2.057mL HAuCl4（10 g/L）于50 mL离心管中，加入2.942 mL的水摇匀，遮光保存；按11.4 mg：30 mL（NaBH4：冻水）的比例配制0.6 mL NaBH4溶液；过滤得到10 mL十六烷基三甲基溴化铵于50 mL离心管中，在震荡作用下向其中加入0.25 mL配制好的HAuCl4溶液；再在震荡作用下,快速加入0.6 mL配制好的NaBH4溶液，剧烈震荡2 min，25℃下静置2 h，得到金纳米颗粒溶液。
G）取60 μL 的聚丙烯酸（0.2 mg/mL）溶液与90 μL的氨水（2 mol/L），加入10 mL水，超声震荡1小时，然后加入110 mL异丙醇，磁力搅拌1小时，静置后4℃保存。
H）取6 mL步骤G）中所得溶液，加入10 mL水，10 mL异丙醇，随后加入80 μL的多巴胺（0.05 g/mL），50℃静置3小时，得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物。
I）称取120 mg聚甲基丙烯酸甲酯和80 mg马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，加入2 mL三氯甲烷和5 mL十二烷基磺酸钠溶液(3 mg/mL)。所得混合物超声震荡2 min，然后在10000 rpm的转速下离心10 min，除去上清液，剩余产物用水洗涤三次，得到球形纳米珠，最后加入1 mL三氯甲烷备用。
J）取步骤D）中处理好的玻碳电极，滴加40 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.25M的巯基丙酸中6小时，然后彻底洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液浸泡中1小时；将电极洗涤后在其表面滴加30 μL步骤H）中所得溶液，室温干燥后洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；彻底洗涤后在电极表面继续滴加30 μL步骤I）中所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；最后在电极表面滴加10 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时。
K）用步骤B）中所得的丝素蛋白配制浓度为100 ng/mL溶液，滴加20 μL于步骤J）处理完的电极表面，37℃孵育1小时，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V。
L）称取0.02 g文物样，用2 mL步骤B）中的蛋白提取液溶解，按步骤K）所用方法测试。
本发明使用的方法可以对土样中的丝绸文物微痕迹进行有效鉴别，如图2（不同浓度的现代蚕丝样溶液获得的标准曲线）所示，该方法的线性检测范围为0.1-100 ng/mL，最低检出限为0.058 ng/mL。
按实施例1的方法对南海一号文物样进行检测，检测结果如图1所示，结果显示土样#1、#8中含有丝绸成分。
实施例2
A）取5g蚕茧，用剪刀将其剪开取出里面的蚕蛹，去除最内层的蛹衬。将得到的蚕茧壳称重并加入质量分数为0.5% 的Na2CO3脱胶液，在浴比为1:50，温度为 99 ℃的条件下搅拌0.5 h，并重复该操作两次，以充分除去丝胶。将不溶的丝素用去离子水洗五次，并放置于60 °C的烘箱烘干过夜，留以备用。
B）将烘干的丝素加入蛋白提取液（氯化钙：水：乙醇的摩尔比为1:8:2），在浴比为1:50，温度为 99 ℃的条件下搅拌溶解2 h。将溶有丝素蛋白的提取液在常温下冷却过滤后，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子，并每隔4 h换一次水，72 h后得到较纯的丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥72 h，得到丝素蛋白，研磨成粉末后放入密封瓶保存备用。
C）取一根直径3mm的玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0、0.3、0.05 μm 的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨，打磨时间为10分钟；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤10分钟。
D）将洗净的电极浸泡在0.5 M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化40周，循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.1V/s 。
E）称取0.2 g KCl，0.27 g KH2PO4，8 g NaCl和1.42 g Na2HPO4加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4，得到PBS7.4溶液；称取 K3[Fe(CN)6] 1.646 g、K4[Fe(CN)6] 2.112 g、KCl 7.45 g，加入1000 mLPBS 7.4溶液。得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为5.0 mM的铁氰化钾溶液。
F）取3.6445 g 十六烷基三甲基溴化铵于250mL锥形瓶中，加入100 mL水，在37℃水浴中搅拌溶解；取2.057mL HAuCl4（10 g/L）于50 mL离心管中，加入2.942 mL的水摇匀，遮光保存；按11.4 mg：30 mL（NaBH4：冻水）的比例配制0.6 mL NaBH4溶液；过滤得到10 mL十六烷基三甲基溴化铵于50 mL离心管中，在震荡作用下向其中加入0.25 mL配制好的HAuCl4溶液；再在震荡作用下,快速加入0.6 mL配制好的NaBH4溶液，剧烈震荡2 min，25℃下静置2 h，得到金纳米颗粒溶液。
G）取60 μL 的聚丙烯酸（0.2 mg/mL）溶液与90 μL的氨水（2 mol/L），加入10 mL水，超声震荡一小时，然后加入110 mL异丙醇，磁力搅拌一小时，静置后4℃保存。
H）取6 mL步骤G）中所得溶液，加入10 mL水，10 mL异丙醇，随后加入80 μL的多巴胺（0.05 g/mL），50℃静置3小时，得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物。
I）称取120 mg聚甲基丙烯酸甲酯和80 mg马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，加入2 mL三氯甲烷和5 mL十二烷基磺酸钠溶液(3 mg/mL)。所得混合物超声震荡2 min，然后在10000 rpm的转速下离心10 min，除去上清液，剩余产物用水洗涤三次，得到球形纳米珠，最后加入1 mL三氯甲烷备用。
J）取步骤D）中处理好的玻碳电极，滴加40 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.25M的巯基丙酸中6小时，然后彻底洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液浸泡中1小时；将电极洗涤后在其表面滴加30 μL步骤H）中所得溶液，室温干燥后洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；彻底洗涤后在电极表面继续滴加30 μL步骤I）中所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；最后在电极表面滴加10 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时。
K）用步骤B）中所得的丝素蛋白配制10 ng/mL的溶液，滴加20 μL于步骤J）处理完的电极表面，37℃孵育1小时，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V。
L）称取0.02 g文物样，用2 mL步骤B）中的蛋白提取液溶解，按步骤K）所用方法测试。
实施例3
A）取5g蚕茧，用剪刀将其剪开取出里面的蚕蛹，去除最内层的蛹衬。将得到的蚕茧壳称重并加入质量分数为0.6% 的Na2CO3脱胶液，在浴比为1:55，温度为100 ℃的条件下搅拌0.5 h，并重复该操作两次，以充分除去丝胶。将不溶的丝素用去离子水洗五次，并放置于55-65 °C的烘箱烘干过夜，留以备用。
B）将烘干的丝素加入蛋白提取液（氯化钙：水：乙醇的摩尔比为1:8:2），在浴比为1:55，温度为 100 ℃的条件下搅拌溶解2.5 h。将溶有丝素蛋白的提取液在常温下冷却过滤后，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子，并每隔4 h换一次水，72 h后得到较纯的丝素蛋白溶液。将丝素蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥72 h，得到丝素蛋白，研磨成粉末后放入密封瓶保存备用。
C）取一根直径3mm的玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次用1.0、0.3、0.05 μm 的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨，打磨时间为10分钟；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤10分钟。
D）将洗净的电极浸泡在0.5 M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化40周，循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.1V/s 。
E）称取0.2 g KCl，0.27 g KH2PO4，8 g NaCl和1.42 g Na2HPO4加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4，得到PBS7.4溶液；称取 K3[Fe(CN)6] 1.646 g、K4[Fe(CN)6] 2.112 g、KCl 7.45 g，加入1000 mLPBS 7.4溶液。得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为5.0 mM的铁氰化钾溶液。
F）取3.6445 g 十六烷基三甲基溴化铵于250mL锥形瓶中，加入100 mL水，在37℃水浴中搅拌溶解；取2.057mL HAuCl4（10 g/L）于50 mL离心管中，加入2.942 mL的水摇匀，遮光保存；按11.4 mg：30 mL（NaBH4：冻水）的比例配制0.6 mL NaBH4溶液；过滤得到10 mL十六烷基三甲基溴化铵于50 mL离心管中，在震荡作用下向其中加入0.25 mL配制好的HAuCl4溶液；再在震荡作用下,快速加入0.6 mL配制好的NaBH4溶液，剧烈震荡2 min，25℃下静置2 h，得到金纳米颗粒溶液。
G）取60 μL 的聚丙烯酸（0.2 mg/mL）溶液与90 μL的氨水（2 mol/L），加入10 mL水，超声震荡一小时，然后加入110 mL异丙醇，磁力搅拌一小时，静置后4℃保存。
H）取6 mL步骤G）中所得溶液，加入10 mL水，10 mL异丙醇，随后加入80 μL的多巴胺（0.05 g/mL），50℃静置3小时，得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物。
I）称取120 mg聚甲基丙烯酸甲酯和80 mg马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，加入2 mL三氯甲烷和5 mL十二烷基磺酸钠溶液(3 mg/mL)。所得混合物超声震荡2 min，然后在10000 rpm的转速下离心10 min，除去上清液，剩余产物用水洗涤三次，得到球形纳米珠，最后加入1 mL三氯甲烷备用。
J）取步骤D）中处理好的玻碳电极，滴加40 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.25M的巯基丙酸中6小时，然后彻底洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液浸泡中1小时；将电极洗涤后在其表面滴加30 μL步骤H）中所得溶液，室温干燥后洗涤，将电极在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；彻底洗涤后在电极表面继续滴加30 μL步骤I）中所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC（0.3M/0.5M）溶液中浸泡0.5小时；最后在电极表面滴加10 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体，37℃孵育1小时。
K）用步骤B）中所得的丝素蛋白配制1 ng/mL的溶液，滴加20 μL于步骤J）处理完的电极表面，37℃孵育1小时，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V。
L）称取0.02 g文物样，用2 mL步骤B）中的蛋白提取液溶解，按步骤K）所用方法测试。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于包括以下步骤：
A）取蚕茧并取出内部的蚕蛹，去除最内层的蛹衬；将所得蚕茧壳加入Na2CO3脱胶液中搅拌，并重复该操作多次以充分除去丝胶；将不溶的丝素用去离子水洗多次，烘干，备用；
B）将烘干的丝素加入蛋白提取液中搅拌溶解；将溶有丝素的蛋白提取液在常温下冷却过滤后，用截留分子量为10000的纤维素透析袋在去离子水中透析以去除钙离子和氯离子，得到纯化的丝素蛋白溶液；将丝素蛋白溶液真空冷冻干燥，得到丝素蛋白，研磨成粉末后密封瓶备用；
C）取一根玻碳电极，将去除污渍的玻碳电极在麂皮上依次在1.0μm、0.3μm、0.05 μm的氧化铝悬浮液中进行8字形打磨；接下来依次在无水乙醇和蒸馏水中超声洗涤；
D）将洗净的玻碳电极浸泡在0.4-0.6M的稀硫酸溶液中，在电化学工作站上利用循环伏安法循环活化35-45周，循环伏安法的扫描范围为-0.4V-1.6V,扫描速率为0.08-0.12V/s；
E）配制得到PBS 7.4溶液，称取 K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl，加入PBS 7.4溶液，得到[Fe(CN)6]3-/4-浓度为4.5-5.5 mM的铁氰化钾溶液；
F）分别配制十六烷基三甲基溴化铵溶液、HAuCl4溶液和NaBH4溶液；将十六烷基三甲基溴化铵溶液添加于离心管中，在震荡作用下向其中加入HAuCl4溶液；再在震荡作用下，快速加入NaBH4溶液，剧烈震荡，静置，得到金纳米颗粒溶液；
G）按体积比50-70:80-100:8-12将0.15-0.25 mg/mL的聚丙烯酸溶液、1.5-2.5 mol/L的氨水和水混合，超声震荡，然后加入异丙醇，搅拌均匀，静置后1-5℃保存；
H）按体积比5-7：8-12：8-12将步骤G）所得溶液、水和异丙醇混合，随后加入多巴胺溶液，静置，得到中空结构的聚丙烯酸-多巴胺复合物溶液；
I）称取质量比为110-130：70-90的聚甲基丙烯酸甲酯和马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物，加入三氯甲烷和十二烷基磺酸钠溶液，所得混合液超声震荡，离心，除去上清液，剩余产物用水洗涤多次，得到球形纳米珠，最后加入三氯甲烷中制得溶液，备用；
J）取步骤D）处理后的玻碳电极，滴加35-45 μL步骤F）中所得金纳米颗粒溶液于玻碳电极表面，室温干燥后，将电极浸泡0.2-0.3M的巯基丙酸中5-7h，然后彻底洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液浸泡中0.5-1.5h；然后将玻碳电极洗涤后在其表面滴加25-35 μL步骤H）所得溶液，室温干燥后洗涤，将玻碳电极在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min；彻底洗涤后在玻碳电极表面继续滴加25-35μL步骤I）所得溶液，室温干燥，在NHS/EDC溶液中浸泡20-40min；最后在玻碳电极表面滴加8-12 μL鼠抗丝素蛋白单克隆抗体，35-39℃孵育0.5-1.5h；
K）用步骤B）中所得的丝素蛋白配制不同浓度的溶液，滴加15-25 μL于步骤J）处理完的玻碳电极表面，35-39℃孵育0.5-1.5h，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V；
L）称取文物样，用步骤B）中所述蛋白提取液溶解，滴加15-25 μL于步骤J）处理完的玻碳电极表面，35-39℃孵育0.5-1.5h，洗涤后在电化学工作站上用差分脉冲伏安法扫描测试，扫描范围为-0.2V-0.6V。
2.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤A）中，将所得蚕茧壳加入质量分数为0.4%-0.6%的Na2CO3脱胶液中，在浴比为1:45-1:55、温度为98± 2 ℃的条件下搅拌20-40min；烘干温度为 55-65 °C。
3.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤B）中，所述蛋白提取液由摩尔比为1:7-9:1-3的氯化钙、水和乙醇组成；丝素与蛋白提取液的浴比为1:45-1:55，搅拌溶解条件为在98 ± 2 ℃下搅1.5-2.5 h；透析期间并每隔3-5 h换一次水，透析时间为60-80 h；真空冷冻干燥时间为60-80 h。
4.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤C）中，玻碳电极的直径位2-4mm，打磨时间为8-12min；超声洗涤时间为8-12min。
5.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤F）的具体过程为：取3.6445 g十六烷基三甲基溴化铵于锥形瓶中，加入100 mL水，在35-39℃水浴中搅拌溶解；取2.057mL、10 g/L的HAuCl4于离心管中，加入2.942 mL的水摇匀，遮光保存；按NaBH4与冰水的比例为11.4 mg:30 mL配制0.5-0.7 mL NaBH4溶液；过滤得到8-12 mL十六烷基三甲基溴化铵溶液于离心管中，在震荡作用下向其中加入0.2-0.3 mL的HAuCl4溶液；再在震荡作用下，快速加入0.5-0.7 mL的NaBH4溶液，剧烈震荡1-3 min，20-30℃下静置1.5-2.5 h，得到金纳米颗粒溶液。
6.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤G）中，超声震荡时间为0.5-1.5h，搅拌时间为0.5-1.5h。
7.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤H）中，静置温度为45-55℃，静置时间为2-4h。
8.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤I）中，超声震荡时间为1-3 min，离心速率为8000-12000 rpm，离心时间为8-12min。
9.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤J）中，所述NHS/EDC溶液中NHS和EDC的摩尔比为0.2-0.4:0.4-0.6。
10.如权利要求1所述的一种丝绸文物的高灵敏度检测方法，其特征在于，步骤L）中，称取0.01-0.03 g文物样，用1-3 mL步骤B）中所述蛋白提取液溶解。
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