CN109554457A - 一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法 - Google Patents

一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法,涉及分子生物学领域。本发明涉及检测两个基因的两个SNP位点,提供待检测位点的检测用特异性引物及其反应条件(详见表1~3)。本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting,HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型,本发明还将提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。

Description

一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法
技术领域
本发明为一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法,涉及分子生物学领域,尤其针对美肤行业肤质评测。
背景技术
目前,常用的基因检测方法为测序法、基因芯片法、飞行质谱法,这些方法都需要在完成PCR扩增后进行后续实验分析,实验周期相对较长,适用于中、高通量的SNP检测。使用支持高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting,HRM)的仪器仅需要一次PCR扩增后即可根据扩增产物直接进行分析报告得出样品的基因型,极大的缩短了实验时长。
HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,具有极高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异,并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限,实现了真正的闭管操作。
HRM无需使用序列特异性探针,而是利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。基本原理:双链核苷酸(double strand DNA,dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响,序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上,因此利用实时PCR技术,通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化,就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时,借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。
研究发现痤疮的发生与毛囊皮脂腺单位雄激素受体水平升高、雄激素受体与雌激素受体比例失调以及雄激素受体活性增高有关。如面部毛囊皮脂腺单位雄激素受体水平高,痤疮就好发于面部。除面部外,痤疮还好发于皮脂腺较为丰富的胸背部。人体内存在多种基因调控性激素受体的活性,如:DNA损伤结合蛋白2(DDB2)基因编码DNA损伤结合蛋白2。DNA损伤结合蛋白2介导组蛋白H4的泛素化降解,而组蛋白H4在人皮脂腺细胞中是抗微生物反应的主要成分之一。研究还发现DNA损伤结合蛋白2与雄性激素受体有相互作用,调节雄性激素代谢。
selectin L(SELL),该基因编码细胞表面粘附分子,其属于粘附/归巢受体家族。编码的蛋白质含有C型凝集素样结构域、钙结合表皮生长因子样结构域和两个短补体样重复序列。其基因产物是白细胞在内皮细胞上结合和随后滚动所需的,促进它们迁移到次级淋巴器官和炎症部位,从而形成痘痘等。
damage specific DNA binding protein 2(DDB2),该基因编码的蛋白质是修复受紫外线损伤的DNA所必需的。该蛋白质是参与核苷酸切除修复的异二聚体蛋白质复合物的较小亚基,并且该复合物介导组蛋白H3和H4的泛素化,其促进细胞对DNA损伤的反应。
发明内容
为了加快检测速度、简化检测过程,本发明选用了HRM技术对与皮肤抗痘能力相关的基因突变位点进行基因型分析。为实现这一检测我们提供了一系列用于HRM试验的特异性扩增引物及对应的标准对照品。
本发明涉及检测两个基因共两个SNP位点,提供待检测位点的检测用特异性引物及其使用LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒特异性扩增DNA片段的反应体系和条件(详见表1)。本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术(High ResolutionMelting,HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型,本发明还将提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。
表1.检测用引物及其条件
本发明通过以下技术方案实现(以其中某一特定位点:rs7531806为例):
1)设计扩增含rs7531806在内的过氧化氢酶特定基因片段的1组引物;
2)将样品总DNA的浓度调至20ng/μL、制备一组含三种不同基因型的标准品;
3)使用1)的引物和2)的模板及标准品,使用HRM试剂盒并根据试剂盒说明对过氧化氢酶基因片段的扩增;
4)使用LightCycler 480 software软件对试验数据进行基因分型分析,确定样品的基因型。
所述标准品的制备:
a.通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法);
b.将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中,将连接后质粒进行转化扩增,最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)
c.将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理,同时取两种不同质粒1∶ 1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理,并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
所述试剂盒的反应体系及其反应条件:
表2.PCR扩增反应体系
序号 试剂 体积(μl)
1 ①2×Master Mix 10
2 ②MgCl<sub>2</sub>(25mM) 2.4
3 Primer 16F 0.4
4 Primer 16R 0.4
5 ③H<sub>2</sub>O 4.8
表3.PCR扩增反应条件
所述检测结果解读:判断样品的基因型,其特质在于不同基因型的dsDNA 在解链时的温度有细微的差别,从而导致其溶解曲线在突变点位有不同的曲线形状。以添加的三种不同基因型标准品为参照即可得出样品的基因型。
附图说明
图1、2为三种不同基因型的标准品在突变位点的溶解曲线线型(被检测样品线型与其中某一条重合)
图3为实例中的检测结果
具体实施方式
现结合实施例,进一步说明使用本发明的引物、标准品结合HRM试剂盒检测样品基因型的良好效果。本发明使用LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒及LightCycler 480仪器进行试验,但并不限制使用其他公司的仪器及试剂盒。
以下操作均已rs7531806位点的检测过程为例。
某位客户在刮取口腔上皮细胞之后,实验员进行核酸提取,将提取出的基因组DNA进行质量评估(检测其浓度及纯度)。根据所测得的浓度结果对样本进行稀释(稀释至工作浓度20ng/μL)。
标准模板的制备:
1)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中,将连接后质粒进行转化扩增,最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存);
2)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理,同时取两种不同质粒1∶1 混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理,并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
1.反应溶液配制
1)根据表2中提供的反应体系避光配制除模板DNA外的公共体系(反应数量为样本数X+标准品数量3),为避免多次移液操作造成损耗,应多配0.5个或数个反应的量;
2)将公共体系按照每孔18μl分装置各孔;
3)分装完毕,将板离心数秒钟;
4)根据按规划每孔加入2μl对应编号的DNA模板
2.上机检测
1)根据表3提供的条件设定反应温度和时间
2)反应结束LightCycler 480 software软件参照标准品分析确定各样本的基因型,同时,扩增后的样本仍可进行测序分析以验证实验结果的真实性。

Claims (5)

1.一种快速检测遗传性皮肤抗痘基因的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)设计2对特异性引物,并确定各引物对的扩增条件;
2)制备2组含三种不同基因型的标准品;
3)将待检测样品总DNA的浓度稀释至20ng/μL作为模板;
4)使用上述步骤中的引物及模板,借助HRM技术对各基因片段进行特异性扩增并测定其溶解曲线;
5)根据4)中的实验结果,依据与标准品的线型关系判断样品的基因型。
2.如专利要求1所述的5对引物,其特征为下表所示:
3.如权利要求1所述的2组标准品制备,其特征在于:
1)通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法);
2)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中,将连接后质粒进行转化扩增,最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存);
3)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理,同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理,并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
4.如专利要求1所述的特异性扩增体系与条件,其特质如下:
扩增体系:
序号 试剂 体积(μl) 1 ①2×Master Mix 10 2 ②MgCl<sub>2</sub>(25mM) 2.4 3 Primer 16F 0.4 4 Primer 16R 0.4 5 ③H<sub>2</sub>O 4.8
扩增条件:
5.如权利要求1中所述根据试验结果判断样品的基因型,其特征在于:使用LightCycler 480 software软件对样品的突变位点进行溶解曲线进行线型分析,与三种标准品进行对比分析样品的基因型。同时,扩增后的样本仍可进行测序分析以验证实验结果的真实性。
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