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Abstract

本发明为一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法，涉及分子生物学领域。本发明涉及检测五个基因的五个SNP位点，提供五个待检测位点的检测用特异性引物及其反应条件(详见表1～3)。本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型，本发明还将提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。

Description

一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法
技术领域
本发明为一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法，涉及分子生物学领域，尤其针对美肤行业肤质评测。
背景技术
目前，常用的基因检测方法为测序法、基因芯片法、飞行质谱法，这些方法都需要在完成PCR扩增后进行后续实验分析，实验周期相对较长，适用于中、高通量的SNP检测。使用支持高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting，HRM)的仪器仅需要一次PCR扩增后即可根据扩增产物直接进行分析报告得出样品的基因型，极大的缩短了实验时长。
HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。
HRM无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。基本原理：双链核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。
氧化是肌肤衰老的最大威胁，饮食不健康，日晒、压力、环境污染等都能让肌肤自由基泛滥，从而产生面色黯淡、缺水等氧化现象，都是身体产生氧化的“罪魁祸首”。所以无论从健康层面还是从护肤层面，我们都需要在日常生活中注意抗氧化。抗氧化能力的强弱主要由我们熟知的超氧化物歧化酶(SOD)的含量及活性所决定，它是是体内重要的内源性抗氧化酶之一，它在胞浆内合成，移至线粒体发挥作用，是人体内一种重要的超氧化物歧化酶。我们可检测包含SOD在内的多种编码氧化酶的基因来评定您的皮肤综合抗氧化能力。
Catalase(CAT)，该基因编码过氧化氢酶，过氧化氢酶是一种血红素酶，存在于几乎所有需氧细胞的过氧化物酶体中，是人体防御氧化应激的关键抗氧化酶。过氧化氧酶将活性氧过氧化氧转化为水和氧，从而减轻过氧化氢的毒性作用。
nuclear factor，erythroid 2like 2(NFE2L2)，该基因编码转录因子，该转录因子是碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白的小家族的成员。编码的转录因子还可调节其启动子中含有抗氧化反应元件(ARE)的基因；并可编码参与对损伤和炎症反应的蛋白质，包括产生自由基。
NAD(P)H quinone dehydrogenase 1(NQO1)，该基因是NAD(P)H脱氢酶(醌)家族的成员，编码细胞质2-电子还原酶。这种FAD结合蛋白可形成同源二聚体并将醌还原为氧醌。其酶活性还可防止醌的一个电子还原，从而导致自由基的产生。
manganese superoxide dismutase，superoxide dismutase 2(SOD2)别名为MnSOD，编码锰超氧化物歧化酶。该酶是体内重要的内源性抗氧化酶之一，它在胞浆内合成，移至线粒体发挥作用，催化超氧阴离子自由基(O2-)转变为H2O2和O2的歧化反应(2O2-+2H+→H2O2+O2)，对细胞和生物起保护作用。锰超氧化物歧化酶广泛存在于线粒体，其表达以及活性的降低将导致对线粒体内产生的超氧离子的清除作用降低，从而导致线粒体DNA的过氧化损伤。SOD2基因47位点的C/T单核苷酸多态性影响SOD2蛋白的活性，T等位基因SOD2第16位密码子编码结氨酸(Val)，C等位基因SOD2第16位密码子编码丙氨酸(Ala)，有报道SOD2第16位密码子是结氨酸(Val)会降低SOD2酶的活性。
glutathione peroxidase 1(GPX1)，该基因编码的蛋白质属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，其成员通过谷胱甘肽催化有机氢过氧化物和H2O2的还原，从而保护细胞免受氧化损伤。其他研究表明H2O2对生长因子介导的信号转导，线粒体功能和硫醇氧化还原平衡的维持也是必需的；因此，通过限制H2O2积累，谷胱甘肽过氧化物酶也参与调节这些过程。该基因家族的几种同工酶存在于脊椎动物中，其在细胞位置和底物特异性方面不同。该同工酶是最丰富的，普遍表达并定位于细胞质中，并且其优选的底物是过氧化氢。
发明内容
为了加快检测速度、简化检测过程，本发明选用了HRM技术对与皮肤抗氧化能力相关的基因突变位点进行基因型分析。为实现这一检测我们提供了一组用于HRM试验的特异性扩增引物及对应的标准对照品。
本发明涉及检测五个基因的五个SNP位点，提供五个待检测位点的检测用特异性引物及其使用LightCycler 480High Resolution Melting Master试剂盒特异性扩增DNA片段的反应体系和条件(详见表1)。本发明采用高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolution Melting，HRM)以分析待检测样本的各SNP位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型，本发明还将提供各SNP位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。
表1.检测用引物及其条件
本发明通过以下技术方案实现(以其中某一特定位点：rs1001179为例)：
1)设计扩增含rs1001179在内的过氧化氢酶特定基因片段的1组引物；
2)将样品总DNA的浓度调至20ng/μL、制备一组含三种不同基因型的标准品；
3)使用1)的引物和2)的模板及标准品，使用HRM试剂盒并根据试剂盒说明对过氧化氢酶基因片段的扩增；
4)使用LightCycler 480software软件对试验数据进行基因分型分析，确定样品的基因型。
所述标准品的制备：
a.通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法)；
b.将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)
c.将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1：1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
所述试剂盒的反应体系及其反应条件：
表2.PCR扩增反应体系
序号 试剂 体积(μl)
1 ①2×Master Mix 10
2 ②MgCl<sub>2</sub>(25mM) 2.4
3 Primer 16F 0.4
4 Primer 16R 0.4
5 ③H<sub>2</sub>O 4.8
表3.PCR扩增反应条件
所述检测结果解读：判断样品的基因型，其特质在于不同基因型的dsDNA在解链时的温度有细微的差别，从而导致其溶解曲线在突变点位有不同的曲线形状。以添加的三种不同基因型标准品为参照即可得出样品的基因型。
附图说明
图1、2为三种不同基因型的标准品在突变位点的溶解曲线线型(被检测样品线型与其中某一条重合)
图3为实例中的检测结果
具体实施方式
现结合实施例，进一步说明使用本发明的引物、标准品结合HRM试剂盒检测样品基因型的良好效果。本发明使用LightCycler 480High Resolution Melting Master试剂盒及LightCycler 480仪器进行试验，但并不限制使用其他公司的仪器及试剂盒。
以下操作均已rs1001179位点的检测过程为例。
某位客户在刮取口腔上皮细胞之后，实验员进行核酸提取，将提取出的基因组DNA进行质量评估(检测其浓度及纯度)。根据所测得的浓度结果对样本进行稀释(稀释至工作浓度20ng/μL)。
标准模板的制备：
1)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)；
2)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
1.反应溶液配制
1)根据表2中提供的反应体系避光配制除模板DNA外的公共体系(反应数量为样本数X+标准品数量3)，为避免多次移液操作造成损耗，应多配0.5个或数个反应的量；
2)将公共体系按照每孔18μl分装置各孔；
3)分装完毕，将板离心数秒钟；
4)根据按规划每孔加入2μl对应编号的DNA模板
2.上机检测
1)根据表3提供的条件设定反应温度和时间
2)反应结束LightCycler 480software软件参照标准品分析确定各样本的基因型，同时，扩增后的样本仍可进行测序分析以验证实验结果的真实性。

Claims (5)

1.一种快速检测遗传性皮肤抗氧化基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)设计5对特异性引物，并确定各引物对的扩增条件；
2)制备5组含三种不同基因型的标准品；
3)将待检测样品总DNA的浓度稀释至20ng/μL作为模板；
4)使用上述步骤中的引物及模板，借助HRM技术对各基因片段进行特异性扩增并测定其溶解曲线；
5)根据4)中的实验结果，依据与标准品的线型关系判断样品的基因型。
2.如专利要求1所述的5对引物，其特征为下表所示：
3.如权利要求1所述的5组标准品制备，其特征在于：
1)通过PCR扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法)；
2)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)；
3)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品DNA使用。
4.如专利要求1所述的特异性扩增体系与条件，其特质如下：
扩增体系：
序号 试剂 体积(μl) 1 ①2×Master Mix 10 2 ②MgCl<sub>2</sub>(25mM) 2.4 3 Primer 16F 0.4 4 Primer 16R 0.4 5 ③H<sub>2</sub>O 4.8
扩增条件：
5.如权利要求1中所述根据试验结果判断样品的基因型，其特征在于：使用LightCycler 480 software软件对样品的突变位点进行溶解曲线进行线型分析，与三种标准品进行对比分析样品的基因型。同时，扩增后的样本仍可进行测序分析以验证实验结果的真实性。
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